KR101488362B1 - 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전공학적 방법 및 진화적 적응으로 야생형 대장균을 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있도록 변이시키는 방법, 상기 방법에 따라 변이된 대장균 및 상기 대장균을 이용하여 바이오매스로부터 바이오연료, 생리활성기능물질, 의약용 물질 또는 화학산업 기반 화학물질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 변이대장균은 야생형 대장균과는 달리 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있으므로, 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 효소당화공정에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전공학적 방법 및 진화적 적응으로 야생형 대장균을 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있도록 변이시키는 방법, 상기 방법에 따라 변이된 대장균 및 상기 대장균을 이용하여 바이오매스로부터 바이오연료, 생리활성기능물질, 의약용 물질 또는 화학산업 기반 화학물질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
석유 화학 연료가 고갈됨에 따라 세계 각국에서는 대체 에너지에 상당한 관심을 쏟고 있다. 이러한 대체 에너지로서의 연료용 에탄올은 섬유소계(cellulose) 바이오매스로부터 전환될 수 있는데, 이 섬유소계는 광합성을 통해 고정되어 매년 방대한 양이 얻어질 수 있고 재생가능하다는 점에서 기능적으로나 경제적으로 매우 유리한 물질이다. 현재 섬유소계 바이오매스 중 많이 이용되고 있는 물질로는 목질계(lignocellulose) 바이오매스가 있으며, 이에 포함된 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 리그닌을 효율적으로 분해시키는 방법과 새로운 균주의 탐색 및 당화발효 공정에 많은 연구가 집중되어 있다.
섬유소계 연료 생산에 있어 주요 단계는 i) 적어도 3가지 효소(엔도글루카나아제, 엑소글루카나아제 및 β-글루카나아제)를 이용한 바이오매스의 효소 당화 공정과 ii) 얻어진 당류의 미생물 발효 공정으로 나눌 수 있다. 최근에는 효소 당화 공정과 발효 공정을 한 반응기에서 동시에 수행하여 시설 비용과 효소의 억제 작용을 감소시켜 에탄올 생산 효율을 증가시킨 동시당화발효(simultaneous saccharification and fermentation, SSF) 방법이 많이 연구되고 있다. 또한, 위 과정 중 효소적 당화 과정이 가장 비용이 많이 들기 때문에 당화에 사용되는 상기 효소의 기능을 향상시키거나 이의 사용을 절감하기 위하여 이를 생산하는 발효 균주의 개발을 모색하고 있다. 특히 최근 유전 공학 기술을 이용하여 당화 관련 효소의 유전자를 발효균주에 도입하여 이를 생산하게 함으로써 당화와 발효를 동시에 수행할 수 있는 균주를 개발하고 있다. 하지만, 당화 관련 유전자와 같은 외래 유전자의 발현 효율이 매우 낮으며 또한 과발현시 세포 성장과 대사에 부정적인 영향을 미치는 문제가 있다. 따라서, 외래 유전자를 도입하는 것보다 발효 균주 내의 내생 경로의 조절을 변형시키는 것에 관심이 옮겨지고 있다.
대장균은 목질계 연료 생산을 위한 효율적인 수단으로 받아들여지고 있는데, 그 이유는 바이오매스의 가수분해산물 내에 존재하는 모든 당을 이용할 수 있기 때문이다. 하지만, 가수분해산물 내에 선호되는 당류(예: 글루코스)가 존재하는 경우 그 외의 탄소원을 이용하는데 요구되는 효소의 생합성이 억제되는 현상인, 탄소원 이화물 억제(carbon catabolite repression, CCR)로 인해 미생물의 잠재성이 제한된다. 가수분해산물 내에 존재하는 자일로스와 아라비노오스와 같은 당류는 글루코스가 완전히 고갈될 때까지 대사될 수 없다. 이 글루코스 선호 이용은 발효 공정을 방해하여 효율을 감소시키고 이용되지 않은 탄소원의 축적으로 인해 하위 공정에 영향을 미친다. 목질계 가수분해산물로부터 얻어지는 당 혼합물의 조성은 매우 가변적이며, 주된 당은 글루코스와 자일로스이다. 따라서, 섬유소계 연료 생산의 비용, 효율 및 용이성을 개선하기 위해서는, 상기 당을 동시에 이용할 수 있는 변이대장균의 개발이 요구된다.
글루코스와 자일로스의 동시 이용은 이화물 활성화된(catabolite derepressed) 몇 가지 대장균 균주를 이용하여 종래에 입증되어 왔다. 많은 연구들은 CCR의 글로벌 전사조절자로 알려진 cAMP 수용체 단백질(cAMP receptor protein, CRP)에 초점을 맞추고 있다. 몇 가지 변이 CRP(CRP*)를 갖는 대장균 균주들이 부분적으로 CCR을 벗어난 것으로 규명되었다(Karimova, G., et al ., Research in Microbiology, 2004, 155(2): 76-79; Nair, N. U., et al ., Metabolic Engineering, 2010, 12(5): 462-468; Kimata, K., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America, 1997, 94(24): 12914-12919; Inada, T., et al ., Genes Cells, 1996, 1(3): 293-301). 또한, 글루코스 포스포트랜스퍼라아제 시스템(PTS)이 결여된 대장균 균주 역시 부분적으로 CCR이 제거되었으며, 메틸글리옥살 합성효소 유전자(methylglyoxal synthase gene)의 결실은 당 이용능 패턴을 조절하는데 도움을 주었다. 하지만, 상기 방법으로는 섬유소계 바이오연료를 생산하는데 충분할 정도로 CCR을 제거하지 못하므로, 여전히 새로운 방법이 요구된다.
한편, 일반적으로 ara 오페론으로 언급되는 L-아라비노스 대사관련 오페론들과 유전자들은 아라비노스를 펜토스 인산 경로의 중간체인 자일룰로스 5-포스페이트로 이화하는데 필요한 효소를 암호화하는 유전자 서열이다. ara 오페론 중에는 araBAD 오페론 및 araFGH 오페론이 존재하고 개별적으로는 araE 유전자가 존재하며, 이중 araB는 L-리불로키나아제를 암호화하며, araA는 L-아라비노스 이소머라아제를 암호화하고, araD는 L-리불로오스-5-포스파타아제 4-에피머라아제를 암호화하며, araF, araG 및 araH는 아라비노스 ABC 트랜스퍼라아제 하위단위를 각각 암호화하고, araE는 아라비노스/수소이온 동시수송 트랜스퍼라아제를 암호화한다고 알려져 있다(Mayer, C. and W. Boos, Chapter 3.4.1, Hexose/Pentose and Hexitol/Pentitol Metabolism. In A. Bck, R. Curtiss III, J. B. Kaper, P. D. Karp, F. C. Neidhardt, T. Nystrm, J. M. Slauch, C. L. Squires, and D. Ussery (ed.), EcoSalEscherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. http://www.ecosal.org. ASM Press, Washington, DC.)
또한, 일반적으로 xyl 오페론으로 언급되는 D-자일로스 대사관련 오페론들과 유전자들은 자일로스를 펜토스 인산 경로의 중간체인 자일룰로스 5-포스페이트로 이화하는데 필요한 효소를 암호화하는 유전자 서열이다. xyl 오페론 내에는 xylAB 오페론 및 xylGFH 오페론이 존재하며, 이중 xylA는 D-자일로스 이소머라아제를 암호화하고, xylB는 자일룰로키나아제(xylulokinase)를 암호화하며, xylF, xylG 및 xylH는 D-자일로스 ABC 트랜스퍼라아제 하위단위를 각각 암호화한다고 알려져 있다(Mayer, C. and W. Boos, Chapter 3.4.1, Hexose/Pentose and Hexitol/Pentitol Metabolism. In A. Bck, R. Curtiss III, J. B. Kaper, P. D. Karp, F. C. Neidhardt, T. Nystrm, J. M. Slauch, C. L. Squires, and D. Ussery (ed.), EcoSalEscherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. http://www.ecosal.org. ASM Press, Washington, DC.)
본 발명자들은 야생형 대장균의 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자, 및 xylAB 오페론 및 xylGFH 오페론의 유도성 프로모터(inducible promoter)를 각각 항시성 프로모터(constitutive promoter)로 치환하고, 자일로스 최소 배지 또는 아라비노스 및 자일로스의 최소 배지에서 적응시켜 얻은 변이대장균이 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 변이된 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이대장균을 이용하여 바이오매스로부터 생산된 바이오연료, 생리활성기능물질, 의약용 물질 또는 화학산업 기반 화학물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 야생형 대장균의 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 각각 항시성(constitutive) 프로모터로 치환하는 단계; 및 (2) 상기 대장균을 자일로스 최소 배지 또는 아라비노스 및 자일로스의 최소 배지에서 10일 이상 배양시키는 단계를 포함하는, 야생형 대장균으로부터 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형 대장균의 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터가 각각 항시성 프로모터로 치환되고, 자일로스 최소 배지 또는 아라비노스 및 자일로스의 최소 배지에서 10일 이상 배양된 것을 특징으로 하는, 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형 대장균의 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터가 각각 항시성 프로모터로 치환되고, 자일로스 최소 배지 또는 아라비노스 및 자일로스의 최소 배지에서 10일 이상 배양된 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균을 이용하여, 바이오매스로부터 바이오연료, 생리활성기능물질, 의약용 물질 또는 화학산업 기반 화학물질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 변이대장균은 야생형 대장균과는 달리 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있으므로, 바이오매스로부터 바이오연료, 생리활성기능물질, 의약용 물질, 화학산업 기반 화학물질 등을 생산하는데 있어서 생물화학공정 시간을 단축시켜 생산성을 높일 수 있다.
도 1은 λ-Red 재조합 시스템을 이용하여, 대장균 염색체 상의 항시성 프로모터(원래의 프로모터)를 항시성 프로모터인 CP 프로모터로 치환하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 araBAD 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하는 과정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 3은 araFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하는 과정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 4는 araE 유전자의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하는 과정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 5는 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하는 과정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 6a는 글루코스 최소 배지에서의 성장률을 나타낸 것이고, 도 6b는 자일로스 최소 배지에서의 성장률을 나타낸 것으로서, 각 그래프에서 마름모(◆)는 야생형 대장균(WT)을, 정사각형(■)은 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하되, 진화적 적응을 거치지 않은 균주(AXcp)를, X는 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 1의 균주(AXcpX50)를, 삼각형(▲)은 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 아라비노스 및 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 2의 균주(AXcpAX50)를 가리킨다.
도 7a 내지 7d는 본 발명에 따른 변이대장균을 글루코스(2 g/L) 및 자일로스(2 g/L)를 함유하는 배지에서 배양한 후, 남아 있는 글루코스(◆) 및 자일로스(■)의 농도를 나타낸 그래프이다. 도 7a는 야생형 대장균(WT)을 이용한 실험 결과이고, 도 7b는 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하되, 진화적 적응을 거치지 않은 균주(AXcp)를 이용한 실험 결과이며, 도 7c는 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 1의 균주(AXcpX50)를 이용한 실험 결과이고, 도 7d는 araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 아라비노스 및 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 2의 균주(AXcpAX50)를 이용한 실험 결과이다.
도 2는 araBAD 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하는 과정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 3은 araFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하는 과정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 4는 araE 유전자의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하는 과정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 5는 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하는 과정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 6a는 글루코스 최소 배지에서의 성장률을 나타낸 것이고, 도 6b는 자일로스 최소 배지에서의 성장률을 나타낸 것으로서, 각 그래프에서 마름모(◆)는 야생형 대장균(WT)을, 정사각형(■)은 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하되, 진화적 적응을 거치지 않은 균주(AXcp)를, X는 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 1의 균주(AXcpX50)를, 삼각형(▲)은 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 아라비노스 및 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 2의 균주(AXcpAX50)를 가리킨다.
도 7a 내지 7d는 본 발명에 따른 변이대장균을 글루코스(2 g/L) 및 자일로스(2 g/L)를 함유하는 배지에서 배양한 후, 남아 있는 글루코스(◆) 및 자일로스(■)의 농도를 나타낸 그래프이다. 도 7a는 야생형 대장균(WT)을 이용한 실험 결과이고, 도 7b는 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하되, 진화적 적응을 거치지 않은 균주(AXcp)를 이용한 실험 결과이며, 도 7c는 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 1의 균주(AXcpX50)를 이용한 실험 결과이고, 도 7d는 araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 아라비노스 및 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 2의 균주(AXcpAX50)를 이용한 실험 결과이다.
이하 본 발명에 사용된 용어를 설명한다.
본 발명에서 '오페론'이란 단일 조절신호 또는 프로모터의 조절하에 있는 유전자 집단을 함유하는 게놈 물질의 기능 단위를 지칭한다. 본 발명에서 'araBAD 오페론', 'araFGH 오페론', 'xylAB 오페론' 및 'xylFGH 오페론'은 각각의 구조와 기능이 당해 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명에서 '프로모터'는 특정 유전자의 전사를 돕는 DNA 영역을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 '유도성 프로모터(inducible promoter)'는 특정 인자의 존재 또는 부재에 의해 프로모터의 활성이 유도되는 프로모터를 지칭한다. 또한, 본원에 사용된 용어 '항시성 프로모터(constitutive promoter)'는 관련 유전자가 지속적으로 전사되게 하는 조절되지 않은 프로모터를 지칭하며, '항시적 프로모터', '항시발현용 프로모터' 또는 '구성적 프로모터'와 상호교환적으로 사용된다. 본 발명에서 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터는 당업계에 공지되어 있다.
본 발명은 (1) 야생형 대장균의 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 각각 항시성 프로모터로 치환하는 단계; 및 (2) 상기 대장균을 자일로스 최소 배지 또는 아라비노스 및 자일로스의 최소 배지에서 10일 이상 배양시키는 단계를 포함하는, 야생형 대장균으로부터 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균을 제조하는 방법을 제공한다.
야생형(wild-type) 대장균은 탄소원 이화물 억제(carbon catabolite repression; CCR)로 인하여 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 없어 바이오매스로부터 여러 가지 화학물질, 예컨대, 아미노산, 바이오 연료, 바이오 폴리머, 바이오 알콜 등을 산업적으로 생산하는데 사용하기 곤란한 문제가 있다. 이에 반해, 본 발명의 변이대장균은 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있으므로, 상기 화학물질을 생산하는데 있어서 생물화학공정 시간을 단축시켜 발효 효율, 수율 및 생산성을 높일 수 있고, 공정 비용을 절감할 수 있다.
이러한 특징은 대장균의 염색체 상의 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하는 유전공학적 방법 및 상기 균주를 자일로스 최소 배지 또는 아라비노스 및 자일로스 최소 배지에서 일정 기간 배양하는 진화적 적응(evolutionary adaptation)에 의해 달성된다.
본 발명의 방법에서, 단계 1은 야생형 대장균의 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 각각 항시성 프로모터로 치환하는 단계이다.
상기 araBAD 오페론 중 araB는 L-리불로키나아제를 암호화하며, araA는 L-아라비노스 이소머라아제를 암호화하고, araD는 L-리불로오스-5-포스파타아제 4-에피머라아제를 암호화하며, araF, araG, araH는 아라비노스 ABC 트랜스퍼라아제 하위단위를 각각 암호화하고, araE는 아라비노스/수소이온 동시수송 트랜스퍼라아제를 암호화한다고 알려져 있다. 상기 araBAD 오페론의 유도성 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 갖고, 상기 araFGH 오페론의 유도성 프로모터는 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 상기 araE 유전자의 유도성 프로모터는 서열번호 3의 염기서열을 갖는다.
상기 단계에서, araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터를 공지된 항시성 프로모터로 치환하는 과정은 도 1 내지 4에 나타낸 바와 같이, λ-Red 재조합 시스템을 이용한 스플라이스 오버랩 확장(Splice Overlap Extension; SOE) PCR에 의해 수행될 수 있으나, 당업계에 알려진 대안적인 방법에 의해 수행될 수도 있다. 본 발명에 사용되는 항시성 프로모터는 당업계에 특정 유전자를 항시적으로 전사시키는 것으로 알려진 프로모터라면 어느 것을 사용하여도 무방하나, 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 갖는 CP25 프로모터 또는 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 갖는 CP6 프로모터를 들 수 있다. 상기 CP25 프로모터는 문헌[Jensen, P. R. and K. Hammer (1998). "The sequence of spacers between the consensus sequences modulates the strength of prokaryotic promoters." Applied and Environmental Microbiology 64(1): 82-87]에서 가장 강한 활성을 가진 항시성(constitutive) 프로모터인 것으로 보고되어 있으며, CP6 프로모터는 동일한 문헌에서 두 번째로 강한 활성을 가진 것으로 보고되어 있다. 본 발명의 하나의 구체예에서, araBAD 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터는 CP25 프로모터로 치환되고, araFGH 오페론의 유도성 프로모터는 CP6 프로모터로 치환된다.
또한, 상기 단계에서, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 공지된 항시성 프로모터로 치환하는 과정은 도 5에 나타낸 바와 같이, λ-Red 재조합 시스템을 이용한 스플라이스 오버랩 확장(SOE) PCR에 의해 수행될 수 있으나, 당업계에 알려진 대안적인 방법에 의해 수행될 수도 있다.
상기 xylAB 오페론 중 xylA는 D-자일로스 이소머라아제를 암호화하고, xylB는 자일룰로키나아제(xylulokinase)를 암호화하며, xylFGH오페론 중 xylF, xylG, xylH는 D-자일로스 ABC 트랜스퍼라아제 하위단위를 각각 암호화한다고 알려져 있다. 상기 xylAB 오페론의 유도성 프로모터는 서열번호 4의 염기서열을 갖고, 상기 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터는 서열번호 5의 염기서열을 갖는다.
상기 본 발명에 사용된 항시성 프로모터로는 당업계에 특정 유전자를 항시적으로 전사시키는 것으로 알려진 프로모터라면 어느 것을 사용하여도 무방하나, 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 갖는 CP25 프로모터 또는 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 갖는 CP6 프로모터를 들 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에서, xylAB 오페론의 유도성 프로모터는 CP25 프로모터로 치환되고, xylFGH 오페론의 유도성 프로모터는 CP6 프로모터로 치환된다.
상기 변이방법으로 얻어지는 대장균은 항시성 프로모터의 작용으로 인해 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터가 활성화되어 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 표현형을 획득하게 된다.
본 발명의 방법에서 상기 단계 2는, 단계 1에서 변이된 대장균을 자일로스 최소 배지 또는 아라비노스 및 자일로스의 최소 배지에서 10일 이상 배양시켜 진화적 적응(evolutionary adaptation)시키는 단계이다. 상기 '자일로스 최소 배지'란 자일로스를 유일한 탄소원으로 하는 배지를 지칭한다. 상기 배지의 예로는 자일로스 4 g/L, 인산수소이나트륨 6.78 g/L, 인산칼륨일염기성 3.0 g/L, 염화나트륨 0.5 g/L, 염화암모늄 1.0 g/L, 황산마그네슘 2 mM 및 염화칼슘 0.1 mM이 첨가된 M9 최소 배지를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 '아라비노스 및 자일로스의 최소 배지'란 아라비노스 및 자일로스 이외에 다른 탄소원을 포함하지 않는 배지를 지칭한다. 상기 배지의 예로는 아라비노스 2 g/L, 자일로스 2 g/L, 인산수소이나트륨 6.78 g/L, 인산칼륨일염기성 3.0 g/L, 염화나트륨 0.5 g/L, 염화암모늄 1.0 g/L, 황산마그네슘 2 mM 및 염화칼슘 0.1 mM 이 첨가된 M9 최소 배지를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 나아가, 상기 배양 기간은 글루코스 및 자일로스 이용률에 영향을 미칠 수 있는 최소 기한으로서, 10일 이상, 20일 이상, 30일 이상, 40일 이상 또는 50일 이상 배양 또는 적응시킬 수 있다.
본 발명은 또한 야생형 대장균의 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터가 각각 항시성 프로모터로 치환되고, 자일로스 최소 배지 또는 아라비노스 및 자일로스의 최소 배지에서 10일 이상 배양된 것을 특징으로 하는, 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균을 제공한다.
본 발명의 대장균의 제조에 이용되는 대장균 및 항시성 프로모터는 상기 제조방법과 관련하여 상술한 바와 같다.
한편, 본 발명은 본 발명에 따른 변이대장균을 이용하여, 바이오매스로부터 바이오연료, 생리활성기능물질, 의약용 물질 또는 화학산업 기반 화학물질을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 바이오매스는 바람직하게는 섬유소계 바이오매스일 수 있으며, 보다 바람직하게는 목질계 바이오매스일 수 있다. 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 본 발명은 효소 당화 공정과 발효 공정에서 본 발명에 따른 변이대장균을 이용하는 것을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 당화 공정에 효소 대신에 본 발명에 따른 변이대장균을 사용하여 수행하거나 효소 일부를 사용하지 않고 본 발명에 따른 변이대장균을 사용하여 당화 공정을 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 발효 공정을 본 발명에 따른 변이대장균을 이용하여 수행할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 변이대장균은 당화공정과 발효공정을 한 반응기에서 동시에 수행하는 동시당화발효(SSF)에 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 변이대장균은 바이오매스로부터 아미노산, 바이오 연료, 바이오 폴리머, 바이오 알콜, 재조합 단백질 등과 같은 화학 물질을 생산하는 데에 적용될 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 프로모터 치환 및 진화적 적응에 의한 변이대장균의 제조
하기의 방식에 따라 대장균의 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하여 변이대장균을 제조하였다.
<1-1>
araBAD
오페론,
araFGH
오페론 및
araE
유전자의 유도성 프로모터의 항시성 프로모터로의 치환
Datta 등(Datta, S., N. Costantino, et al . (2006). "A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria." Gene 379(0): 109-115)에 개시되어 있는 λ-Red 재조합 시스템을 이용하여, 대장균 MG1655의 염색체 상의 araBAD의 유도성 프로모터(서열번호 1)를 합성된 항시성 프로모터인 CP25 프로모터(서열번호 6)로 치환하였다(도 1 참조).
구체적으로, 문헌[Datta, S., N. Costantino, et al. (2006). "A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria." Gene 379(0): 109-115; Datsenko KA et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , 97(12), 6640-6645, 2000; 및 Cherepanov, PP., W Wackernagel. (1995). Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158(1):9-14.]을 참조하여, 프로모터 치환을 위해 두 개의 오버래핑 단편을 SOE(Splice Overlap Extension) PCR을 통해 증폭하여 CP25 프로모터를 카나마이신 카세트에 연결하였다. 단편 1은 표 1에 기재된 세 개의 SOEing 프라이머를 사용하여 araB 프로모터의 하부 영역에 항시성 프로모터인 CP25를 붙이며, CP25 프로모터 앞쪽에는 단편 2와 연결시킬 수 있는 상동 서열을 가지고 있다. 단편 2는 araB 프로모터의 상부 영역에 상동인 오버행(overhang) 서열과 pKD13으로부터 유래한 카나마이신 카세트가 연결되어 있으며, 카나마이신 카세트 뒤쪽에는 단편 1과 연결시킬 수 있는 상동 서열을 가지고 있다. 상기 SOE PCR은 1단계 98℃ 3분, 2단계 95℃ 30초, 3단계 50~60℃ 30초 및 4단계 72℃ 2분으로 수행하였고, 상기 2단계에서 4단계를 30회 반복하였다. 제조과정을 도 2에 개략적으로 나타내었고, 사용된 프라이머 및 플라스미드를 표 1에 나타내었다.
| 프라이머 및 플라스미드 | 특성 | 참고 |
| SOEing 프라이머 | 5'-CCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCGTTACCAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3' | 서열번호 8 |
| 5'-CATAGCTGTTTCCTGTGTGAACAGTACTATGTGATTATACCAGCCCCCTCACTACATGTCAAGAATAAACTGCCAAAGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3' | 서열번호 9 | |
| 5'-TCGCACAGAATCACTGCCAAAATCGAGGCCAATTGCAATCGCCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAC-3' | 서열번호 10 | |
| Sequencing 프라이머 | 5'-AACTGGTTATTCGGGGCATC-3' | 서열번호 11 |
| 5'-AGGCGTGCCAGAAACTTAAC-3' | 서열번호 12 | |
| pSIM5 | λ-Red 재조합효소(recombinase) 발현 플라스미드; 온도 민감성 복제 | Datta et al 2006 |
| pKD13 | 유전자 파괴(gene disruption)용 주형 플라스미드. 내성 유전자가 FRT 부위의 측면에 있음. pir+ E.coli를 필요로 하는 oriR6K-gamma origin. | Datsenko and Wanner 2000 |
| pCP20 | 효모의 Flp 재조합효소를 가지며, 클로람페니콜 또는 암피실린 저항유전자를 가짐; 온도 민감성 복제 | Cherepanov and Wackernagel 1995 |
한편, 전술한 방법과 동일한 방식으로, araFGH 오페론의 유도성 프로모터를 CP6 프로모터(서열번호 7)로 치환하였다. 제조과정을 도 3에 개략적으로 나타내었고, 상기 과정에 사용된 SOEing 프라이머 및 플라스미드를 하기 표 2에 나타내었다.
| 프라이머 및 플라스미드 | 특성 | 참고 |
| SOEing 프라이머 | 5'-GGTAATGCGGCCTATTGACTGGTTAAAAAGAAGACATCCCGCATGGGTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3' | 서열번호 13 |
| 5'-CATAGCTGTTTCCTGTGTGAACAGTACTCAGTTATTATATCATCCGGAAATATCTGTGTCAAGAATAAACTCCCACATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3' | 서열번호 14 | |
| 5'-GACATAACGGCTGCCAGACCAATGGCTGCCAGGGCTTTAGTAAATTTGTGCATAGCTGTTTCCTGTGTGAACAGTACT-3' | 서열번호 15 | |
| Sequencing 프라이머 | 5'-GCTCTCATTATACGTGTTCTG-3' | 서열번호 16 |
| 5'-CCTCAAACCCTAAATCCTTCC-3' | 서열번호 17 | |
| pSIM5 | λ-Red 재조합효소(recombinase) 발현 플라스미드; 온도 민감성 복제 | Datta et al 2006 |
| pKD13 | 유전자 파괴(gene disruption)용 주형 플라스미드. 내성 유전자가 FRT 부위의 측면에 있음. pir+ E. coli를 필요로 하는 oriR6K-gamma origin. | Datsenko and Wanner 2000 |
| pCP20 | 효모의 Flp 재조합효소를 가지며, 클로람페니콜 또는 암피실린 저항유전자를 가짐; 온도 민감성 복제 | Cherepanov and Wackernagel 1995 |
한편, 전술한 방법과 동일한 방식으로, araE 유전자의 유도성 프로모터를 CP6(서열번호 7) 프로모터로 치환하였다.
제조과정을 도 4에 개략적으로 나타내었고, 상기 과정에 사용된 SOEing 프라이머 및 플라스미드를 하기 표 3에 나타내었다.
| 프라이머 및 플라스미드 | 특성 | 참고 |
| SOEing 프라이머 | 5'-TATCTGCTGTAAAATTAGGTGGTTAATAATAATCTCAATAATTCAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3' | 서열번호 18 |
| 5'-CATAGCTGTTTCCTGTGTGAACAGTACTCAGTTATTATATCATCCGGAAATATCTGTGTCAAGAATAAACTCCCACATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3' | 서열번호 19 | |
| 5'-CCCGCAAAGAACGTGGCGTTAAAGCAGATTCCGTATTGATAGTAACCATAGCTGTTTCCTGTGTGAACAGTACT-3' | 서열번호 20 | |
| Sequencing 프라이머 | 5'-CATTCTTCTTACTTTTATG-3' | 서열번호 21 |
| 5'-CTGGTCAGCACAAAGTGATC-3' | 서열번호 22 | |
| pSIM5 | λ-Red 재조합효소(recombinase) 발현 플라스미드; 온도 민감성 복제 | Datta et al 2006 |
| pKD13 | 유전자 파괴(gene disruption)용 주형 플라스미드. 내성 유전자가 FRT 부위의 측면에 있음. pir+ E. coli를 필요로 하는 oriR6K-gamma origin. | Datsenko and Wanner 2000 |
| pCP20 | 효모의 Flp 재조합효소를 가지며, 클로람페니콜 또는 암피실린 저항유전자를 가짐; 온도 민감성 복제 | Cherepanov and Wackernagel 1995 |
<1-2>
xylAB
오페론
및
xylFGH
오페론의
유도성 프로모터의
항시성
프로모터로의 치환
상기 실시예 <1-1>과 동일한 방식으로, 대장균 MG1655의 염색체 상의 xylAB 오페론에 존재하는 유도성 프로모터(서열번호 4)를 합성된 항시성 프로모터인 CP25 프로모터(서열번호 6)로 치환하였다(도 1 참조)
구체적으로, 문헌[Datta, S., N. Costantino, et al. (2006). "A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria." Gene 379(0): 109-115; Datsenko KA et al ., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , 97(12), 6640-6645, 2000; 및 Cherepanov, PP., W Wackernagel. (1995). Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158(1):9-14.]을 참조하여, 프로모터 치환을 위해 두 개의 오버래핑 단편을 SOE(Splice Overlap Extension) PCR을 통해 증폭하여 CP25 프로모터를 카나마이신 카세트에 연결하였다. 단편 1은 표 1에 기재된 두 개의 SOEing 프라이머를 사용하여 xylA 프로모터의 하부 영역에 항시성 프로모터인 CP25를 붙이며, CP25 프로모터 앞쪽에는 단편 2와 연결시킬 수 있는 상동 서열을 가지고 있다. 단편 2는 xylA 프로모터의 상부 영역에 상동인 오버행(overhang) 서열과 pKD13으로부터 유래한 카나마이신 카세트가 연결되어 있으며, 카나마이신 카세트 뒤쪽에는 단편 1과 연결시킬 수 있는 상동 서열을 가지고 있다. 상기 SOE PCR은 1단계 98℃ 3분, 2단계 95℃ 30초, 3단계 50~60℃ 30초 및 4단계 72℃ 2분으로 수행하였고, 상기 2단계에서 4단계를 30회 반복하였다. 제조과정을 도 5에 개략적으로 나타내었고, 사용된 프라이머 및 플라스미드를 표 4에 나타내었다.
| 프라이머 및 플라스미드 | 특성 | 참고 |
| SOEing 프라이머 | 5'-CGAAGCAGCTCCAGCCTACACCTTTGGCAGTTTATTCTTGACATGTAGTGAGGGGGCTGGTATAATCACATAGTACTGTTCACACAGGAAACAGCTATGCAAGCCTATTTTGACCAGCTCGATCGCGTTCGTTATGAAGGCTCA-3' | 서열번호 23 |
| 5'-TTGTTGCGCAATTGTACTTATTGCATTTTTCTCTTCGAGGAATTACCCAGTTTCATCAATTCCGGGGATCCGTCGACC-3' | 서열번호 24 | |
| Sequencing 프라이머 | 5'-AACTCAAATGCGACATCTGC-3' | 서열번호 25 |
| 5'-ATGCCTTCTTGTTTGGCTTC-3' | 서열번호 26 | |
| pSIM5 | λ-Red 재조합효소(recombinase) 발현 플라스미드; 온도 민감성 복제 | Datta et al 2006 |
| pKD13 | 유전자 파괴(gene disruption)용 주형 플라스미드. 내성 유전자가 FRT 부위의 측면에 있음. pir+ E. coli를 필요로 하는 oriR6K-gamma origin. | Datsenko and Wanner 2000 |
| pCP20 | 효모의 Flp 재조합효소를 가지며, 클로람페니콜 또는 암피실린 저항유전자를 가짐; 온도 민감성 복제 | Cherepanov and Wackernagel 1995 |
한편, 전술한 방법과 동일한 방식으로, xylFGH 오페론의 유도성 프로모터(서열번호 5)를 CP6 프로모터(서열번호 7)로 치환하였다.
제조과정을 도 5에 개략적으로 나타내었고, 상기 과정에 사용된 프라이머 및 플라스미드를 하기 표 5에 나타내었다.
| 프라이머 및 플라스미드 | 특성 | 참고 |
| SOEing 프라이머 | 5'-TGATGAAACTGGGTAATTCCTCGAAGAGAAAAATGCAATAAGTACAATTGCGCAACAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3' | 서열번호 27 |
| 5'-CATAGCTGTTTCCTGTGTGAACAGTACTCAGTTATTATATCATCCGGAAATATCTGTGTCAAGAATAAACTCCCACATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3' | 서열번호 28 | |
| 5'-GACTTCTTTGGCGTGTGCAGCAACGTTGGTAAGCAGGAGTGAGGTGCAAAGGGTGAGTAGAATGTTCTTTATTTTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAC-3' | 서열번호 29 | |
| Sequencing 프라이머 | 5'-AACTCAAATGCGACATCTGC-3' | 서열번호 30 |
| 5'-ATGCCTTCTTGTTTGGCTTC-3' | 서열번호 31 | |
| pSIM5 | λ-Red 재조합효소(recombinase) 발현 플라스미드; 온도 민감성 복제 | Datta et al 2006 |
| pKD13 | 유전자 파괴(gene disruption)용 주형 플라스미드. 내성 유전자가 FRT 부위의 측면에 있음. pir+ E. coli를 필요로 하는 oriR6K-gamma origin. | Datsenko and Wanner 2000 |
| pCP20 | 효모의 Flp 재조합효소를 가지며, 클로람페니콜 또는 암피실린 저항유전자를 가짐; 온도 민감성 복제 | Cherepanov and Wackernagel 1995 |
<1-3>
카나마이신
저항성 유전자의 제거
실시예 <1-1> 및 <1-2>에서 수득한 각각의 PCR 산물을 순차적으로 형질전환시키기 위해서는 이전 단계에 삽입된 카나마이신 저항성 유전자의 제거가 필요하다. 이를 위해 pCP20 플라스미드(Cherepanov, P. P. and W. Wackernagel (1995). "Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant." Gene 158(1): 9-14)를 형질전환시키고 암피실린이 함유된 LB 아가 플레이트 배지에 스트리킹하였다. 얻어진 균주들을 항생제가 없는 LB 아가 플레이트에 스트리킹한 뒤 42℃에서 하루 동안 유도(induction) 과정을 거치고, 이 과정을 거친 균주들을 또 다시 항생제가 없는 LB 아가 플레이트에 스트리킹한 뒤 42℃에서 하루 동안 유도 과정을 거쳤다. 그 후 콜로니들을 카나마이신 LB 아가 플레이트, 암피실린 LB 아가 플레이트, 항생제가 없는 LB 아가 플레이트에 각각 순서대로 접종하여 42℃에서 하루 동안 키운 뒤 항생제가 없는 LB 아가 플레이트에서만 자라는 균주를 최종적으로 선발하였다.
상기와 같이, araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 균주를 "AXcp"로 명명하였다.
<1-4> 변이대장균의
진화적
적응(
evolutionary
adaptation
)
상기 실시예 <1-3>에서 제작된 균주를 자일로스 최소 배지(자일로스 4 g/L, 인산수소이나트륨 6.78 g/L, 인산칼륨일염기성 3.0 g/L, 염화나트륨 0.5 g/L, 염화암모늄 1.0 g/L, 황산마그네슘 2 mM 및 염화칼슘 0.1 mM이 첨가된 M9 최소 배지)에서 200 rpm으로 교반하면서 37℃에서 50일간 배양하였다. 배양 중 배양액이 1.0의 OD600에 도달하면 세포를 새로운 배지로 옮겨 배양하였다.
상기와 같이, araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 균주를 "AXcpX50"으로 명명하였다.
실시예 2: 프로모터 치환 및 아라비노스 및 자일로스 최소 배지에서의 진화적 적응에 의한 변이대장균의 제조
실시예 1에서 변이대장균을 자일로스 최소 배지에서 50일간 배양하는 대신, 아라비노스 및 자일로스 최소 배지(아라비노스 2 g/L, 자일로스 2 g/L, 인산수소이나트륨 6.78 g/L, 인산칼륨일염기성 3.0 g/L, 염화나트륨 0.5 g/L, 염화암모늄 1.0 g/L, 황산마그네슘 2 mM 및 염화칼슘 0.1 mM 이 첨가된 M9 최소 배지)에서 50일간 배양하는 것을 제외하고, 실시예 1의 과정을 반복하여 변이대장균을 제조하였다.
상기와 같이, araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 아라비노스 및 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 균주를 "AXcpAX50"으로 명명하였다.
실험예 1: 변이대장균의 글루코스 및 자일로스 이용 여부 확인
실시예 1 및 2에서 제조된 변이대장균의 글루코스 및 자일로스의 이용 여부를 하기와 같이 측정하였다.
실험 균주들을 각각 글루코스 M9-최소 배지(글루코스 4 g/L) 50 mL 및 자일로스 M9-최소 배지(자일로스 4 g/L) 50 mL 상에서 배양하면서, 2시간마다 1 mL의 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수한 다음, 1시간 동안 80℃에서 멸균시켰다. 그리고 나서, 한번 더 원심분리하여 상층액 200 μL를 카나마이신 50 μg/mL 이 첨가된 3차 증류수 800 μL에 섞어, HPC-87P 컬럼(Bio-Rad) 및 굴절율 검출기(Shimadzu)가 장착된 시마주(Shimadzu) HPLC 스테이션(station)을 이용하여 배양 배지 중의 글루코스와 자일로스의 잔류 농도를 측정하였다. HPLC-등급의 깨끗한 물을 0.6 mL/분의 유속으로, 이동상으로 사용하였다. 오븐 온도는 80℃로 유지하였다. 다양한 농도의 글루코스 및 자일로스를 이용하여 표준 곡선을 결정하였다. 모든 실험은 3회 반복 수행하여 평균표준편차로 나타내었다.
상기 실험결과를 도 6에 나타내었다. 도 6a는 글루코스 최소 배지에서의 성장률을 나타낸 것이고, 도 6b는 자일로스 최소 배지에서의 성장률을 나타낸 것으로서, 상기 그래프에서 마름모(◆)는 야생형 대장균(WT)을, 정사각형(■)은 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하되, 진화적 적응을 거치지 않은 균주(AXcp)를, X는 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 1의 균주(AXcpX50)를, 별표(*)는 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 아라비노스 및 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 2의 균주(AXcpAX50)를 가리킨다.
상기 결과에서 보는 바와 같이, araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 1의 균주(AXcpX50) 및 araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 아라비노스 및 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 2의 균주(AXcpAX50)가 야생형 대장균에 비해 자일로스 상에서 더 높은 성장을 나타내었다.
상기 결과는 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 프로모터 치환 및 진화적 적응을 통해 자일로스의 이용률을 증가시킬 수 있음을 보여준다.
실험예 2: 변이대장균의 글루코스 및 자일로스 동시 이용 여부 확인
실시예 1 및 2에서 제조된 변이대장균의 글루코스 및 자일로스의 동시 이용 여부를 하기와 같이 측정하였다.
실험 균주를 각각 2 g/L의 글루코스 및 자일로스를 함유하는 50 mL의 M9-최소 배지에 접종하였다. 2시간마다 1 mL의 배양 배지를 회수하여, 원심분리하여 상층액을 회수한 다음, 1시간 동안 80℃에서 멸균시켰다. 그리고 나서, 한번 더 원심분리하여 상층액 200 μL를 카나마이신 50 μg/mL 이 첨가된 3차 증류수 800 μL에 섞어, HPC-87P 컬럼(Bio-Rad) 및 굴절율 검출기(Shimadzu)가 장착된 시마주(Shimadzu) HPLC 스테이션(station)을 이용하여 배양 배지 중의 글루코스와 자일로스의 잔류 농도를 측정하였다. HPLC-등급의 깨끗한 물을 0.6 mL/분의 유속으로, 이동상으로 사용하였다. 오븐 온도는 80℃로 유지하였다. 다양한 농도의 글루코스 및 자일로스를 이용하여 표준 곡선을 결정하였다. 모든 실험은 3회 반복 수행하여 평균표준편차로 나타내었다.
측정된 결과를 도 7a 내지 7d에 나타내었다. 도 7a는 야생형 대장균(WT)을 이용한 실험 결과이고, 도 7b는 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환하되, 진화적 적응을 거치지 않은 균주(AXcp)를 이용한 실험 결과이며, 도 7c는 araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 1의 균주(AXcpX50)를 이용한 실험 결과이고, 도 7d는 araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 아라비노스 및 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 2의 균주(AXcpAX50)를 이용한 실험 결과이다. 또한, 각 도에서 마름모(◆)는 글루코스의 잔류 농도를, 사각형(■)은 자일로스의 잔류 농도를 가리킨다.
상기 도 7a 내지 7d에서 보는 바와 같이, araBAD 오페론, araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 1의 균주(AXcpX50) 및 araFGH 오페론 및 araE 유전자의 유도성 프로모터 및 xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 항시성 프로모터로 치환한 후 아라비노스 및 자일로스 최소 배지에서 진화적 적응을 거친 실시예 2의 균주(AXcpAX50)는 모두 16시간 이내에 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용하는 반면, 야생형 대장균은 자일로스를 거의 이용하지 못하였다.
상기 결과는, ara 오페론 및 xyl 오페론의 프로모터 치환 및 진화적 적응을 통해 대장균이 글루코스와 자일로스를 동시에 이용할 수 있게 변이시킬 수 있음을 보여준다.
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SIMULTANEOUSLY UTILIZING GLUCOSE AND XYLOSE
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<160> 31
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 73
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
cggatcctac ctgacgcttt ttatcgcaac tctctactgt ttctccatac ccgttttttt 60
ggatggagtg aaa 73
<210> 2
<211> 85
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
aattctgcga tgtgatattg ctctcctatg gagaattaat ttctcgctaa aactatgtca 60
acacagtcac ttatctttta gttaa 85
<210> 3
<211> 85
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
catatttatg ctgtttccga cctgacacct gcgtgagttg ttcacgtatt ttttcactat 60
gtcttactct ctgctggcag gaaaa 85
<210> 4
<211> 85
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 4
ggtaatgccg cgggtgatgg atgatgtcgt aatattgggc actccctttc agttgctcaa 60
ttatgttatt tcacactgct attga 85
<210> 5
<211> 85
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
cgtaatcgaa agataaaaat ctgtaattgt tttcccctgt ttagttgcta aaaattggtt 60
acgtttatcg cggtgattgt tactt 85
<210> 6
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CP25 promoter
<400> 6
ctttggcagt ttattcttga catgtagtga gggggctggt ataatcacat agtactgttc 60
acacaggaaa cagct 75
<210> 7
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CP6 promoter
<400> 7
catgtgggag tttattcttg acacagatat ttccggatga tataataact gagtactgtt 60
cacacaggaa acagct 76
<210> 8
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 8
ccctatgcta ctccgtcaag ccgtcaattg tctgattcgt taccaagtgt aggctggagc 60
tgcttcg 67
<210> 9
<211> 98
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 9
catagctgtt tcctgtgtga acagtactat gtgattatac cagccccctc actacatgtc 60
aagaataaac tgccaaagat tccggggatc cgtcgacc 98
<210> 10
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 10
cccgcaaaga acgtggcgtt aaagcagatt ccgtattgat agtaaccata gctgtttcct 60
gtgtgaacag tact 74
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequencing primer
<400> 11
aactggttat tcggggcatc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequencing primer
<400> 12
aggcgtgcca gaaacttaac 20
<210> 13
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 13
ggtaatgcgg cctattgact ggttaaaaag aagacatccc gcatgggtag tgtaggctgg 60
agctgcttcg 70
<210> 14
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 14
catagctgtt tcctgtgtga acagtactca gttattatat catccggaaa tatctgtgtc 60
aagaataaac tcccacatga ttccggggat ccgtcgacc 99
<210> 15
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 15
gacataacgg ctgccagacc aatggctgcc agggctttag taaatttgtg catagctgtt 60
tcctgtgtga acagtact 78
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequencing primer
<400> 16
gctctcatta tacgtgttct g 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequencing primer
<400> 17
cctcaaaccc taaatccttc c 21
<210> 18
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 18
tatctgctgt aaaattaggt ggttaataat aatctcaata attcaacgtg taggctggag 60
ctgcttcg 68
<210> 19
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 19
catagctgtt tcctgtgtga acagtactca gttattatat catccggaaa tatctgtgtc 60
aagaataaac tcccacatga ttccggggat ccgtcgacc 99
<210> 20
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 20
cccgcaaaga acgtggcgtt aaagcagatt ccgtattgat agtaaccata gctgtttcct 60
gtgtgaacag tact 74
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequencing primer
<400> 21
cattcttctt acttttatg 19
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequencing primer
<400> 22
ctggtcagca caaagtgatc 20
<210> 23
<211> 144
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 23
cgaagcagct ccagcctaca cctttggcag tttattcttg acatgtagtg agggggctgg 60
tataatcaca tagtactgtt cacacaggaa acagctatgc aagcctattt tgaccagctc 120
gatcgcgttc gttatgaagg ctca 144
<210> 24
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 24
ttgttgcgca attgtactta ttgcattttt ctcttcgagg aattacccag tttcatcaat 60
tccggggatc cgtcgacc 78
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 25
aactcaaatg cgacatctgc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequencing primer
<400> 26
atgccttctt gtttggcttc 20
<210> 27
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 27
tgatgaaact gggtaattcc tcgaagagaa aaatgcaata agtacaattg cgcaacaagt 60
gtaggctgga gctgcttcg 79
<210> 28
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 28
catagctgtt tcctgtgtga acagtactca gttattatat catccggaaa tatctgtgtc 60
aagaataaac tcccacatga ttccggggat ccgtcgacc 99
<210> 29
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOEing primer
<400> 29
gacttctttg gcgtgtgcag caacgttggt aagcaggagt gaggtgcaaa gggtgagtag 60
aatgttcttt attttcatag ctgtttcctg tgtgaac 97
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequencing primer
<400> 30
aactcaaatg cgacatctgc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequencing primer
<400> 31
atgccttctt gtttggcttc 20
Claims (9)
- (1) 야생형 대장균의 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터를 각각 항시성 프로모터로 치환하는 단계; 및
(2) 상기 대장균을 자일로스 최소 배지 또는 아라비노스 및 자일로스의 최소 배지에서 10일 이상 배양시키는 단계
를 포함하는, 야생형 대장균으로부터 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터가 각각 서열번호 1 내지 5로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 서열번호 6 또는 7로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 자일로스 최소 배지가 자일로스 4 g/L, 인산수소이나트륨 6.78 g/L, 인산칼륨일염기성 3.0 g/L, 염화나트륨 0.5 g/L, 염화암모늄 1.0 g/L, 황산마그네슘 2 mM 및 염화칼슘 0.1 mM 이 첨가된 M9 최소 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 아라비노스 및 자일로스 최소 배지가 아라비노스 2 g/L, 자일로즈 2 g/L, 인산수소이나트륨 6.78 g/L, 인산칼륨일염기성 3.0 g/L, 염화나트륨 0.5 g/L, 염화암모늄 1.0 g/L, 황산마그네슘 2 mM 및 염화칼슘 0.1 mM 이 첨가된 M9 최소 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
- 야생형 대장균의 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터가 각각 항시성 프로모터로 치환되고, 자일로스 최소 배지 또는 아라비노스 및 자일로스의 최소 배지에서 10일 이상 배양된 것을 특징으로 하는, 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균.
- 제6항에 있어서, 상기 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터가 각각 서열번호 1 내지 5로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 변이대장균.
- 제6항에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 서열번호 6 또는 7로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 변이대장균.
- 야생형 대장균의 araBAD 오페론, araFGH 오페론, araE 유전자, xylAB 오페론 및 xylFGH 오페론의 유도성 프로모터가 각각 항시성 프로모터로 치환되고, 자일로스 최소 배지 또는 아라비노스 및 자일로스의 최소 배지에서 10일 이상 배양된 것을 특징으로 하는 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균을 이용하여, 바이오매스로부터 바이오연료, 생리활성기능물질, 의약용 물질 또는 화학산업 기반 화학물질을 생산하는 방법.
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2014
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- 2014-08-08 CN CN201410389340.8A patent/CN104371963B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012170440A (ja) | 2011-02-24 | 2012-09-10 | Univ Of Miyazaki | キシロース代謝を改善した形質転換大腸菌 |
| KR101278910B1 (ko) | 2011-06-21 | 2013-06-26 | 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 | 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 미생물의 제조방법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 논문1:MICROBIOLOGY * |
| 염기서열(2010) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110564659A (zh) * | 2019-09-17 | 2019-12-13 | 天津大学 | 耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌及其构建方法 |
| CN110564659B (zh) * | 2019-09-17 | 2022-03-11 | 天津大学 | 耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌及其构建方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104371963B (zh) | 2019-07-12 |
| US20150050691A1 (en) | 2015-02-19 |
| US9284582B2 (en) | 2016-03-15 |
| CN104371963A (zh) | 2015-02-25 |
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