JP2006501851A - 生物資源の生産に対するグルコース輸送変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年10月4日に提出されたU.S.仮出願No.60/414,166及び、2002年10月4日に提出されたU.S.仮出願No.60/374,931に対し優先権を主張する。これらの全ては、参照によりここに組み込まれる。
本発明は、細菌宿主細胞内の遺伝工学的代謝経路に関係し、遺伝工学的に改造された宿主細胞内の目的生成物の生産に関連する、方法およびシステムを提供する。具体的には、本発明は、芳香環アミノ酸経路等の目的とする代謝経路内へのPTSフォスフォエンエノールピルビン酸(PEP)の消費を抑え、PEP及びPEP前駆体へ転化することによって、フォスフォエノールピルビン酸(PEP)を利用する能力、すなわち、グルコース輸送に関するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を用いる能力を有する宿主細胞内において、グルコース輸送を高めることに関係する。
a) pkr変異体の生産によるピルビン酸キナーゼ活性の排除。ピルビン酸キナーゼはPEPからピルビン酸への転化を触媒する(Mori et al., (1987) Agric. Biol. Chem. 51: 129-138)
b) ppc変異体の生産によるPEPカルボキシラーゼ活性の排除。PEPカルボキシラーゼはPEPからオキサロ酢酸への転化を触媒する(Miller et al., (1987) J. Ind. Microbiol. 2: 143-149)
c) PEPシンターゼをエンコードするppsの発現の増幅。PEPシンターゼはピルビン酸塩からPEPの転化を触媒する(USSN 08/307,371)及び
d) 例えば、トランスケトラーゼ遺伝子(tktA及びtktB)の過剰発現又は、トランスアルドラーゼ遺伝子(talA)の過剰発現(lida et al., (1983) J.Bacteriol. 175:5375- 5383)によるD-エリトロース-4-リン酸 (E4P)の供給の増加。トランスケトラーゼはD-フルクトース6リン酸のE4Pへの転化を触媒し、トランスアルドラーゼは、D-セドヘプツロース7リン酸+グリセルアルデヒド3リン酸のE4P+フルクトース6リン酸への転化を触媒する。
a) ザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)由来のグルコース促進拡散タンパク質及びグルコキナーゼをコードしたglf及びglk遺伝子の導入による、pstHlcrrオペロンの欠失によるPTS不活性大腸菌細胞内でのGlu+表現型の復元(USP 5,602, 030 及び Snoep et al., (1994) J. Bact. 176: 2133-2135)、及び
b) PTS-/Glu-大腸菌系統に対して、グルコース含有培地上での培養を継続することによる選択を行い、野生型PTS-/Glu-系統よりも成長速度が速いGlu+復帰突然変異体(PTS-/Glu+)の獲得(Flores etal., (2002) Metab. Eng 4 : 124-137; Flores et al., (1996) Nature Biotechnol. 14: 620-623 及びW096/34961)
しかしながら、これらのアプローチは各種の制限を有していた。通常、異種遺伝子の使用は、新宿主の中では効果的に機能しない。加えて、グルコース促進拡散タンパク質等の膜タンパク質は通常、細胞膜内の脂質と密に関係しており、これらは種間において多様である。導入されたグルコキナーゼ等の可溶性タンパク質は、プロアーゼの分解作用を受けるであろう。さらに、ある表現型を取り戻した自然発生変異体を使用することは、予測不可能な結果を招来する。工業的生産に用いるには、完全に特徴付けられている系統が好ましい。
本発明は、本来糖質輸送に関するPTS利用能力を有する細菌宿主細胞の代謝経路への炭素流量を増やす方法を提供する。この方法は、PTS-/Glu-表現型を有する細菌宿主細胞の選択及び、Glu+表現型の復元のためのグルコース同化に関するタンパク質をエンコードした核酸に作動可能に結合する内生染色体調節領域の修飾からなる。
本発明の実施は、違った形で示されない限り、本技術分野の範囲内である、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学及び生化学の従来の技術を使用する。そのような技術は、MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al., eds., 1987 and annual updates); GENE EXPRESSION TECHNOLOGY, (Goeddel, D. ed., 1991, METHODS IN ENZYMOLOGY Vol. 185 Academic Press, San Diego, CA); GUIDE To PROTEIN PURIFICATION (Deutshcer M. P. ed., 1989, METHODS INENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego, CA); PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS ANDAPPLICATIONS (Innis et al., 1990, Academic Press, San Diego, CA);OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait, ed., 1984); PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION,(Mullis et al., eds. , 1994); MANUAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Second Edition (A. L. Demain, et al., eds. 1999); MANUAL OF METHODS FOR GENERALBACTERIOLOGY (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N.Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Philips, eds), pp. 210-213 American Society for Microbiology, Washington, DC.; 及び BIOTECHNOLOGY : A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, (Thomas D. Brock) Second Edition (1989)Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massに詳細に説明されている。
ここに違った形で定義されない限り、ここに使ったすべての技術の、そして科学用語は、一般的に、当業者によって理解されているのと同じ意味を持っている。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., JohnWiley and Sons, New York (1994) 及び Hale and Marham, THE HARPER DICTIONARY OF BIOLoGY, Harper Perennial, New York (1991)は、本発明で用いられる数多くの用語の一般的な辞書である。
本発明は、糖質輸送に対するPTSを利用する能力を本来有する宿主細胞の目的代謝経路に炭素流量を増やす方法に関係する。前記方法は、有効なPTS-表現型を有する宿主細胞の選択、グルコース同化に関するポリペプチドをエンコードする染色体核酸と作動可能に結合している、少なくとも1の染色体調節領域の変性、及び、結果的にGlu+表現型を復元すること、及びそれゆえ、目的代謝経路内への炭素流量が増えることを含んでいる。
PTSの一般的な概説は、(Postma et al.,1993, Microbiol. Rev. 57:543-594; Romano et al., 1979, J.Bacteriol. 139: 93-97 and Saier et al. 1990, In: BACTERIAL ENERGETICS pp. 273-299, T. A.Krulwich, Ed. Academic Press, NY)である。本発明に有用な、宿主細胞又は系統は、糖質輸送に対するPTSシステムを用いる能力を有する任意の有機体を含む。これは、エシェリキア、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、バチルス、シュードモナス、放線菌、パンテア、またはブドウ球菌の類に属している原核生物を含む。表1に適切な有機体の一覧を挙げる。これらの有機体中のPTSの不活性化は、代替的な代謝経路に対する細胞内の、炭素流及びPRP(及びPEP前駆体)の利用度を、潜在的に増やし、引き続き、それらの細胞から、目的化合物(例えば、芳香族化合物)の生成を増やす。
PTS-細胞の選択は、本技術分野で知られている技術を用いて行うことができる。不活性化は、PEPリン酸化を測定不可能なレベルまで低める(Gachelin, G. (1969)による Biochem.Biophys. Acta. 34: 382-387; Romero, et al., (1979) J. Bact. 139: 93-97; 又は Bouvet and Grimont., (1987)Ann. Inst. PasteurlMicrobiol. 138: 3-13に記載の方法を用いた、2-デオキシ-D-グルコースのPEP-依存性リン酸化の測定による)。PEPリン酸化の測定もまた、PTS-発現のレベルを測定するのに有用である。
理論により限定することは意図してはいないが、選択的グルコース同化経路の修飾は、PTSの活性型輸送の能力のなさを補うと考えられてきた、それゆえに、この修飾により、宿主細胞は、他の目的のためにグルコースの輸送中に違った形で代謝されるPEPを用いることができるようになる。
PTS-/Glu-宿主内の内生染色体調節領域修飾に有用な、本発明に応じた、典型的なDNAセット又は構築物は、プロモーターのような調節配列を含む。他の態様では、DNAカセットはさらに、自律増殖またはリコンビナーゼ認識部位などの染色体上への組込みを成す選択マーカー及びその配列を含む。別の態様においては、DNAカセットはさらにリコンビナーゼ認識部位の上流(5’)及び下流(3’)に位置する、フランキング配列を含む。
ある態様では、DNAカセットを含む調節領域はプロモーターを含む。さらなる態様では、このプロモーターは外来のプロモーターである。他の態様では、この外来プロモーターは、非天然プロモーター又はその誘導体である。さらなる態様では、このプロモーターは、本来グルコース同化タンパク質をエンコードしているポリヌクレオチドと作動可能に結合していない天然プロモーターである。いくつかの態様において、天然プロモーターを変性して、宿主細胞内へ再導入される、外来プロモーターは、本来グルコース同化タンパク質をエンコードしているポリヌクレオチドと操作可能に結合している、修飾された自然発生プロモーターである。例えば、天然プロモーターが-35領域、-10領域又は結合領域に修飾を受けている、又は天然プロモーターがリプレッサー結合領域の修飾を含んでいる場合である。他の態様では、天然プロモーターは、ガラクトースシンポーター等のグルコーストランスポーターをエンコードするポリヌクレオチドと、より具体的にはgalPと結合していないものである。さらに他の態様では、天然プロモーターは、グルコキナーゼ等のリン酸化タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、より具体的にはglkと、結合していないものである。調節領域及び、特に発明に応じた有益なDNAカセット内に含まれるプロモーターは、約20から200bp、約20から150bp及び約20から100bpの配列を含む。
5’ CGAGCCGTCACGCCCTTGACAATGCCACATCCTGAGCAAATAAT 3’
ここで、-35ボックスはTTGACAで表され、-10ボックスは、AATAATで表される。
発明に含まれるDNAカセットは、選択マーカーを含むであろうし、大腸菌内の遺伝子の挿入を検出するために、数多くの遺伝子を使うことができる。これらの遺伝子のいくつかは、大腸菌に、選択的表現型を与える。このケースにおいて、活性化遺伝子の表現型を有するコロニーだけが成長するように、培地条件を調整する。他の遺伝子は、選択される表現型を大腸菌に与える。選択可能な表現型は、遺伝子の発現のレベルについての情報を提供することがある。任意の好ましいマーカーを使用することができるが、有用な抗生物質耐性(AnbR)マーカーは、その性質に基づいて、CmR、KmR 及びGmRを含むが、これらに限定されるわけではない。選択マーカーの好ましい非限定的な例は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子である。
本発明によるDNAカセットの組み込みは、グルコース同化タンパク質をエンコードする遺伝子の上流(5’)領域に対して相同な核酸配列を含んでいる。これらの相同配列は、このましくは、第一リコンビナーゼ認識部位(5’に向かって)及びプロモーター(3’に向かって)の側面に配置している。グルコース同化タンパク質をエンコードしている遺伝子の上流(5’)領域に相同な、核酸配列は、a)修飾を目的とした内生調節領域の5’配列及びb)修飾を目的とした内生調節領域の3’配列由来の配列を含んでいる。3’配列は、グルコース同化タンパク質コード配列の一部を含んでいる。相同フランキング配列は、約2から300bp、約5から200bp、約5から150bp、約5から100bp、約5から50bpの塩基を含む。
細菌細胞から目的遺伝子を得る方法は、一般的であり、該技術分野でよく知られている。例えば、ある遺伝子の配列が知られている場合、好適な遺伝子ライブラリーが作られ、スクリーニングされる。一旦ある配列が単離されると、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(USP 4,683,202)のような標準的な技術を用いて、所定のDNA量を得るために、DNAが増幅される。参考文献は、上記のSambrook et al.である。グルコース同化タンパク質をエンコードしている、任意の遺伝子の上記で定義されている上流配列は、本発明の方法の使用に有用である。
a) mglBCA遺伝子によりエンコードされている高親和性ガラクトース輸送システム(Hogg et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 229: 453-459 and Ferenci T. (1996)FEMS Microbiol. Rev. 18: 301-317);及び
b) 膜成分PtsMが広い基質特異性を持っていて、グルコースとフルクトースを輸送することが可能である、マンノースPTSシステム(Postma &Lengeler (1985) Microbial Rev. 49: 232-269 and Erni et al., (1987) J.Biol. Chem. 262: 5238-5247)
さらに、通常、グルコースPTSシステムの一部であるptsG遺伝子の生成物は、グルコース同化タンパク質として機能する、より具体的にはグルコース促進因子として機能するPTS依存性トランスポーターの突然変異誘発により、転化することができる(Ruijter et al (1992) J. Bact. 174: 2843-2850 and Erni et al(1986) J.Biol. Chem 261: 16398-16403)。
一旦好適なDNAカセットが構築されると、それらは、プラスミド内へ導入されるか、あるいは、直接適切なPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換に用いられる。微生物の中でベクターとして用いることができるプラスミドは、よく知られており、引用文献は、Maniais, et al., MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, 2d Edition (1989) AND MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, second edition (Sambrook et al., 1989) and Bron, S, Chapter 3, Plasmids, in MOLECULAR BIOLOGY METHODS FOR BACILLUS, Ed. Harwood and Cutting, (1990) JohnWiley & Sons Ltdである。
本発明の方法に従い得られたPTS-/Glu+細胞は、炭素流量を芳香環経路内へ及び、芳香環内を通るようにする1以上のタンパク質をエンコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。この異種ポリヌクレオチドは、Glu+表現型の復元の前、中、及び復元後のいずれかに、PTS-/Glu+細胞内に導入される。
細菌細胞の維持及び成長に適した方法は既知であり、参考文献は、MANUAL OF METHODS OF GENERAL BACTERIOLOGY, Eds. P. Gerhardt et al., American Society for Microbiology, Washington DC (1981) and T. D. Brock in BIOTECHNOLOGY : A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, 2nd ed. (1989)Sinauer Associates, Sunderland, MAである。
典型的な細胞培養は、25℃から32℃の間、好ましくは、約28℃又は29℃で、適切な培地内で培養される。本発明に有用な典型的な成長培地は、Luria Bertani (LB) ブロス, Sabouraud Dextrose (SD) ブロス 又は Yeast medium (YM) ブロス等の商業的に調製されている培地であるが、これらに限られない。これらは例えばGIBCO/BRL(ゲーサーズバーグ、MD)から入手できる。他に記載のある合成の増殖培地を用いてもよく、特定の細菌の成長に対して適切な培地は微生物学または発酵科学の当業者には知られている。発酵に適切なpHレンジはpH5からpH8の間である。種フラスコに対する好ましいレンジは、pH7.0からpH7.5であり、発酵管に対する好ましいpHレンジは、pH5からpH6である。発酵過程に影響する多くの因子は、アスコルビン酸中間体生産を最大化するために最適化され、制御される必要があるということは、当該技術分野においてよく知られている。pH、炭素源濃度、及び溶解酸素レベル等の因子の多くは、アスコルビン酸中間体生産に用いられる細胞のタイプに応じて、影響される。
本発明の発酵培地は、適切な炭素源、グルコース等の単糖類、ラクトース又はスクロースのような小糖類、スターチ又はセルロースのような多糖類、及び、再生可能資源由来のチーズ乳清浸透液、トウモロコシ浸透液、テンサイ糖ミツおよび大麦麦芽などのからの精製されていない混合を含まなければならないが、これらに限定されるわけではない。さらに、炭素基質は、炭素などの1炭素基質であるかもしれない。本発明で用いられる炭素源は、基質に含まれる各種幅広い炭素を包含し、それは、微生物の選択によってのみ制限される一方、好ましい炭素基質は、グルコース及び/又はフルクトース及びそれらの混合物をも含んでいる。本出願の他の所で説明される遺伝子修飾を組み合わせたグルコース及びフルクトースの混合物の使用により、代謝経路から酸化経路を切り離すことは、宿主細胞の代謝要求を満たすフルクトースが用いられる一方で、生成物の高められた生産性に対するグルコースの使用及び目的とするアスコルビン酸中間体への転化を促進する。
本発明のプロセスは、培養システムに関して、バッチ、フェドバッチ、連続培養のいずれかを用いる。これらの方法は、本発明の技術分野で既知であり、例は、上記のBrockである。旧来のバッチ発酵は、発酵の開始時に培地の成分がセットされ、発酵の間、成分の人工的な入れ替わりが起きない閉鎖系であった。従って、発酵の開始時に、培地は要求された1以上の微生物を接種され、発酵は、この間、何もシステムに追加しないで、行われる。しかし、一般に、「バッチ」発酵は炭素源の付加について回分であり、pHと酸素濃度などの要因を制御することは、発酵中においても、しばしば行われる。バッチシステムの中で、常に、発酵が停止する時間まで、システムの代謝産物と生物量組成は変わる。回分培養の中では、細胞は、静的誘導期から高成長誘導期及び最終的には、成長が減少するか停止する、定常期を通じて、適量になる。未処置ならば、定常期の中の細胞は結局死ぬであろう。遅滞期の中の細胞が一般に最終産物または中間体の生産の大きさに関係する。
A). loxP-CAT-loxPカセット、プラスミドpTrcM42の構築
線形DNAは、販売元(ニューイングランドバイオラド)の仕様に従い、HindIII及びNcol制限酵素を用いて消化されたプラスミドpTrc99a(ファルマシア)から得た。精製の後、消化DNAの端部は、TADNAポリメラーゼを用いて、Sambrookらの方法により、鈍化させられた。この鈍化端部を有する線形DNAは、一般的な方法により、環状にされ、大腸菌TOP-10コンポーネント細胞(インビトロジェン、カールズバッド、カナダ)内で形質転換された。細胞は、50μg/mlのカルベニリシンを含む、Luria-agar(LA)プレート(LB培地は、5g/L酵母抽出物;10g/Lトリプトン及び10g/L NaCl+2%アガーを含んでいる)上で平板培養された。37℃、16時間の培養の後、さらなる解析のために4のコロニーが選択された。精製プラスミドDNAは、これらのコロニーから得られた、そして、制限酵素を用いて解析された。4コロニーは同じプラスミドを含んでおり、HindIII及びNcolの間のDNA領域が欠失していることが確認された。このプラスミドはpTrc1と称された。
loxP-CAT-loxPカセットの上流にtrcプロモーター及びlacオペレーターを含むDNAカセットは、GalA/GalP2のプライマーセットを用いたpTrcm42からのPCRにより増幅された。
5’ TCGGTTTTCACAGTTGTTACATTTCTTTTCAGTAAAGTCTGGATGC ATATGGC GGCCGCAT 3’
GaIP2:(SEQ ID NO.7)
5’CATGATGCCCTCCAATATGGTTATTTTTTATTGTGAATTAGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTA 3’
このプライマーペアは、PCRプロダクトの各端部に対するgalP上流領域に対して相同な40bpを含んでいる。増幅は、Taqポリメラーゼ(ロシュ)を用いて、95℃1分;55℃1分;72℃2分を30サイクル行った。このDNAカセットは、Echo pUni/His5 R6Kベクター(インビトロジェン)内でクローン技術により増幅され、大腸菌Pir1細胞内で形質転換された。陽性コロニーは、断片を放出する制限酵素(解析)により、確認された。この構築物は、pR6KgalPとされた。
loxP-CAT-loxPカセットの上流にtrcプロモーター及びlacオペレーターを含むDNAカセットは、GlkA/Glk2のプライマーセットを用いたpTrcm42からのPCRにより増幅された。
Glk2 : (SEQ ID NO. 9) 5’-CATTCTTCAACTGCTCCGCTAAAGTCAAAATAATTCTTTCTCGTCTGTTTCCTGTGT GAAATTGTTA 3’
このプライマーペアは、PCRプロダクトの各端部に対するglk上流領域に対して相同な40bpを含んでいる。増幅は、Taqポリメラーゼ(ロシュ)を用いて、95℃1分;55℃1分;72℃2分を30サイクル行った。このDNAカセットは、Echo pUni/His5 R6Kベクター(インビトロジェン)内でクローン技術により増幅され、大腸菌Pir1細胞内で形質転換された。陽性コロニーは、制限酵素により、確認され、この構築物は、pR6Kglkとされた。
大腸菌KLndh81(KLp23ndh)のPTS-(△ptsHlcrr)系統は、カナマイシン耐性マーカーを用いて、ptsH、ptsl及びcrrを含むオペロン全体の置換により得られた(Levy et al.,(1990) Gene 86: 27-33)。これは、Flores et al., (1996) Nature Biotechnol., 14: 620-623に記載の方法により、ファージ溶解物2611NK9pykF::Gmを用いた、P1vir形質導入によりなされた。オペロンの欠失は、欠失部の上流又は下流領域にハイブリダイズする(ptsHF/crrR)プライマーを用いたPCRによる、この領域の増幅及びマックコンキー(ラクトース-)アガー+1%グルコース上の平板培養のコロニーの出現の有無により、確認された。
5’ AGAATTGCAACAGTAATGCCAGCTTGTTAAAAATGCGTA 3’
crrR (SEQ ID NO. 24)
5’ CCTGTTTTGTGCTCAGCTCATCAGTGGCTTGCTGAA 3’
グルコース::PTSシステム内の欠失を有するコロニーは、グルコース及び生成される酸を用いる能力がないことから、プレート上で、白いコロニーを形成する。これらの系統は、KLpst7とされた。
GaIC11 (SEQ ID NO.11) 5’ AGAAAGATAAGCACCGAGGATCCCGATA 3’
PCRパラメーターは、メーカーの指示に従い、TaqDNAポリメラーゼ又はrTthポリメラーゼを用いて、95℃1分、55℃2分、72℃2分を30サイクル行った。この系統、KLpts::galP-trcは、マックコンキー(ラクトース-)アガー+1%グルコース上で平板培養された。このコロニーは、白を示すKLptsと比較して、わずかに赤いコロニーを生成した、前者は酸からグルコースを作ることができるのに対して、後者(親系統)は、それができないということを示している。このことにより、galPが発現していること及びGalPがグルコースの取り込みをしてるということが確認された。プロモーター領域は、促進因子の存在を確認するために配列決定された。クロラムフェニコールマーカーは、Palmeros et al. (2000) Gene 247: 255-264 に記載されているように、Creリコンビナーゼを用いて取り除かれた、この除去は、GalB1/GalC11(SEQ ID NO.1)のプライマーセットを用いたPCRにより確認された。
glkの上流領域に相同な、DNAフランキング(領域)の40bpを有するloxP-CAT-loxP-ptrcを含むDNAカセットは、上記実施例1E)にて開示されたgalPDNAを用いて調整された。用いたプライマーセットは、glkATGの上流149-189から5’末端及びglkATGから3’末端に向かって ATGの上流37bpのDNAフランキングを付加するGlkA/Glk2(SEQ ID NO.8及びSEQ ID NO.9)である(glkの信託番号はEA000327)。PRC増幅に用いたテンプレートは、rTthポリメラーゼ(パーキンエルマー)及びpR6Kglkである。Glk-trcDNAカセットは、上記Datsenko 及び Wanner (2000)らの開示の方法に従い、pKD46プラスミドを含むエレクトロコンピテントKlgalP-trc細胞内で形質転換された。陽性コロニーは、10μg/mlクロラムフェニコールを含むLAアガープレート上で選択された。カセットの組換えは、GlkB1/GlkC11プライマーセットを用いたPCRにより確認された。このPCRプログラムは、KLgalP-trcの構築において開示されている。GlkB1は、glkATGの700bp上流に結合する前向きプライマーであり、GlkC11は、glkATG開示コドンの500bp下流に結合する。
5’ AACAGGAGTGCCAAACAGTGCGCCGA 3’
GlkC11 (SEQ ID NO. 13)
5’ CTATTCGGCGCAAAATCAACGTGACCGCCT 3’
コロニーはマックコンキーアガー(ラクトース-)+1%グルコースで平板培養された。コロニーは深紅を示した、ペアレントKLgalP-trcと比較して、グルコースを酸に転化する能力が増えたことを意味する。このクロラムフェニコールマーカーは、Creリコンビナーゼを用いて、上記Palmerosらの開示の方法により、取り除かれ、1.3kbpの生成物を与えるGlkB1/GlkC11プライマーセットを用いたPCRにより、除去が確認された。生じた1.3kb生成物はKLGGと称された。
trcプロモーター由来galP及びglkの発現をさせる適切なコピー数のプラスミドが構築された。trcプロモーターの制御下におかれたgalP及びgalkを含む3040bpのAccl断片はプラスミドpVHGalPglk11(図13)から単離された。プラスミドpVHGalPglk11は、スペクチノマイシン抗生物質耐性及びtrcプロモーターの制御下にある大腸菌由来galP及びglk遺伝子を運ぶ、pCL1920ベクター(Lerner et al. (1990) NAR 18: 4631)由来の低いコピー数のプラスミドである。Accl消化により得られる3040bpのDNA断片の核酸配列(SEQ ID NO.25)は、図14A-Eに示した。端部は通常の方法により鈍化された (Sambrook et al., 上記)。断片の鈍化された端部は、pACYC17(ニューイングランドバイオラド)のClal部位内でクローンされた 、このことにより、カナマイシン耐性遺伝子は不活性化された。コロニーはカルベニシリン(100μg/ml) 上で成長し、カナマイシン(10μg/ml) 上では成長しないことを確認するために、スクリーニングされた。プラスミドDNAは、標準的方法を用いて単離され、目的断片の存在は、クローン断片内で1度のみ切断するXbal及びプラスミド内の認識部位を2有するBamHlを用いた制限酵素消化により確認された。これは、発明者が挿入された破片の方向づけを決定することを可能にした。このプラスミドはpMCGGと称された。
グルコースから生成物への炭素転化するPTS-/Glu+系統(実施例1E-G)の利用は、DHAPから1,3プロパンジオールの転化を行う酵素をエンコードしている遺伝子を運ぶプラスミドにおいて試験された。このpSYCO構築物は、DHAP(ジヒドロキシアセトンP)の遺伝子変換のための遺伝子を、サッカロマイセス・セレヴィシエ (グリセロール経路と称される)由来のグリセロール(dar1とgpp2)に運び、続いてグリセロールから1,3-プロパンジオール(クレブシエラ由来dhaB1-3, dhaX, onW, X, 及びY )(1,3-プロパンジオール経路と云われる)に関する遺伝子を運ぶプラスミドに基づく、pSC101(ストラテゲン)である。この実施例に用いられているpSYCO構築物は、pSYCO101、130及び106で、図8及び図9に、それぞれ、核酸配列とプラスミドマップが記載されている。このpSYCO構築物は、グリセロール経路遺伝子及びpSYC0101のグリセロール経路遺伝子の逆の定位における2つのEcoR1サイトを除いてはpSYCO101と同一である。pSYCO106構築物は、図9に示されるようにEcoR1部位から10589-11145 bpの間の非コードプラスミド領域の126bpの除去を除いては、pSYCO103と同じである。ここに説明された実験においては、プラスミドは機能的に等しい。
グルコースからグリセロール及び1,3-プロパンジオールの転化は、HPLCでモニターされた。解析は、クロマトグラフィーの分野において利用可能な標準的方法及び材料を用いて行われた。ある好適な利用可能な方法は、RI検出を用いたウォーターズアライアンスHPLCシステムである。サンプルは、Cation H Refill Cartridgeプレカラム (4.6 mm x 30 mm, バイオラド, ヘラクレス, CA)をつけた、AminexHPX87Hカラム(7.8mm×3000mm、バイオラド、ヘラクレス、カナダ)に付加され、温度は50℃に調整され、移動層として5 mMH2SO4を用い、流量0.4ml/分で分析された。通常、グルコース、グリセロール、1,3-プロパンジオール及び酢酸の保持時間はそれぞれ、12.7分、19.0分、25.2分及び21.5分である。
PTS-/Glu-系統であるKLpts7は、KLGG系統を作るために、galP及びglk標的部位でのtrcプロモーターの組み込みにより、Glu+になった。上記実施例1を参照のこと。この系統は、pSYCO101を用いた一般的な手順で形質転換された。この細胞集団の生成物、グリセロール及び1,3-プロパンジオールは、一般的な発酵によりテストされた(実施例2を参照のこと)。
上記実施例3において、KLGG系統の発酵実験において示したグリセロール及び、1,3-プロパンジオールの生産中の長い停滞期は、以下の表2に示す、KLGGの24時間と48時間における振とうフラスコ内の実験においても繰り返された。
この変異は、明らかに、結合する遺伝子の発現を増し、lacレセプターのオペレーターの親和性を減らすOCオペレーターの構成要素となる変異のひとつであることが、THE OPERON, Miller, JH and Reznikoff, WS eds. , 1980, p190-192 and references thereinに記載されている。このことは、事実上、プロモーターからのglkの転写を増やし、これは酵素活性の増加によって示された。代謝経路に入るグルコースをリン酸化する多くのグルコキナーゼがあり、多くのG-6-Pは主要な代謝経路の中に送られることから、この変異系統はより早く成長する。
100mMリン酸緩衝液pH7.2、5mM MgCl2、500mM NADP、5mMATP、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ2ユニット。このアッセイは、以下のスキームにより、NADHP2の出現をモニターすることにより、グルコース及びATPからグルコース-6-リン酸の転化を検出する。
GalP-R1 5'GTGTCTTCTTCCTGCCAGAC 3' (SEQ ID NO. 17)
GaIP-F1 5'CCTGCAACAGTACGCCAAG 3' (SEQ ID NO. 18)
For glk
Glk-R1 5'CATCTGGTCCATGTCGATAAGC 3' (SEQ ID NO. 19)
Glk-F1 5'GCGGTTGTCAGCTTTCACAA 3' (SEQ ID NO. 20)
For rrsH
rrsH-F1 5'AGCTGGTCTGAGAGGATG 3' (SEQ ID NO. 21)
rrsH-R1 5'AATTCCGATTAACGCTTGC 3' (SE ID NO. 22)
このライトサイクラー反応は、ライトサイクラーRNA増幅キットSYBR GreenI(ロシュ)を用いて、10μlに対する反応を修正して、この使用説明書に従い、行った。一反応あたり、500ngのRNAが用いられた。このプログラムの条件は:標的温度55℃;インキュベーション時間10分及び温度の変動速度は、20℃/秒であった。
Claims (48)
- a)グルコース同化タンパク質上流(5’)に対応するプロモータ及びDNAフランキング配列から成るDNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコース同化タンパク質と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾と、
b)Glu+表現型の復元のために該DNA構築物の組み込みをさせること、及び
c)適切な条件下における形質転換された宿主細胞の培養と、
から成り、宿主細胞内の該代謝経路への炭素流量が、実質的に同じ培養条件下で培養されたPTS細菌宿主細胞内の同じ代謝経路への炭素流量と比較して、増えていることを特徴とする、糖質輸送に対して本来ホスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用することができるPTS-/Glu-細菌宿主細胞の代謝経路への炭素流量を増やす方法。 - プロモーターが宿主細胞のプロモーターではない、請求項1の方法。
- プロモーターが変性内生プロモーターである請求項1の方法。
- グルコース同化タンパク質がグルコーストランスポーターである請求項1の方法。
- グルコーストランスポータが、大腸菌から得られたガラクトースパーミアーゼ又は、少なくともこれと80%以上の配列相同性を有するグルコーストランスポーターである請求項4の方法。
- グルコース同化タンパク質がリン酸化タンパク質である請求項1の方法。
- リン酸化タンパク質がグルコキナーゼである請求項6の方法。
- 請求項5の方法であって、さらに、グルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するプロモーター及びDNAフランキング配列から成る第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と操作可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾をさらに含むことを特徴とする方法。
- 細菌宿主細胞が大腸菌細胞、バシルス細胞、及びパンテア細胞からなる群より選択される、請求項1の方法。
- PTS-/Glu-宿主細胞が、ptsl、ptsH及びcrrからなる群より選択される1以上の遺伝子の欠失をさせることにより、PTS細胞より得られる、請求項1の方法。
- さらに、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ及びホスホエノールピルビン酸シンターゼからなる群より選択される、少なくとも1の酵素をエンコードしたポリヌクレオチドを用いたPTS-/Glu+宿主細胞の形質転換をさらに含む、請求項1の方法。
- 請求項1の方法であって、さらに、DHAPシンターゼ、DHQシンターゼ、DHQ脱水酵素、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、EPSPシンターゼ、及びコリスミ酸シンターゼからなる群より選択される、少なくとも1の酵素をエンコードしたポリヌクレオチドを用いてPTS-/Glu+宿主細胞の形質転換をさらに含む方法。
- 請求項1の方法により得られる、形質転換細菌細胞。
- a)プロモーターを含むグルコース同化タンパク質をエンコードしている核酸に作用可能に結合している内生プロモーターと置換されるPTS-/Glu-宿主細胞内で染色体上に組み込まれるDNA構築物を用いたPTS-/Glu-表現型を有する細菌宿主細胞の形質転換と、
b)適切な条件下での該形質転換された宿主細胞の培養と、
c)PTS-/Glu+表現型を有する宿主細胞を得るために、グルコース同化タンパク質を発現させること、及び
d)実質的に同じ培養条件の下でのPTS細菌細胞培養に対応する目的生成物の量と比較して、形質転換細菌宿主細胞内で増加した量の目的生成物を得ることからなり、前記目的生成物が、ピルビン酸、PEP、乳酸塩、酢酸塩、グリセロール、エタノール、コハク酸塩及びコリスミ酸塩からなる群より選択されることを特徴とする、糖質輸送に対するPTSを利用する能力を本来有しているPTS-/Glu-宿主細胞内で、目的とする生成物の生産を増加させる方法。 - 細菌宿主細胞が大腸菌細胞、バシルス細胞、及びパンテア細胞からなる群より選択される、請求項14の方法。
- グルコース同化タンパク質が、大腸菌から得られたガラクトースパーミアーゼ又は、少なくともこれと80%以上の配列相同性を有するグルコーストランスポーターである請求項14の方法。
- グルコース同化タンパク質が、大腸菌から得られたグルコキナーゼ又は、少なくともこれと70%以上の配列相同性を有するグルコキナーゼである請求項14の方法。
- 目的生成物が、コリスミ酸である請求項14の方法。
- 目的生成物が、コハク酸である請求項14の方法。
- 目的生成物が、エタノールである請求項14の方法。
- 目的生成物が、グリセロールである請求項14の方法。
- a)ガラクトースパーミアーゼの上流(5’)に対応するプロモーター及びDNAフランキング配列を含む第一DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、PTS-/Glu-宿主細胞内のガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾と、
b)グルコキナーゼの上流(5’)に対応するプロモーター及びDNAフランキング配列を含む第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾と、
c)第一DNA構築物が、ガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換され、第二DNA構築物が、グルコキナーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換され、ガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼがこの宿主細胞内で発現され、前記発現が、対応する置換の起きていないPTS-/Glu-宿主細胞内の同じ代謝経路内の炭素流量と比較して、形質転換された宿主細胞の代謝経路内への炭素流量を増やすように、第一及び第二DNA構築物の組み込みをさせることから成る、糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を用いる能力を本来有しているPTS-/Glu-細菌宿主細胞の代謝経路内へ、炭素流量を増やす方法。 - 細菌宿主細胞が大腸菌細胞、バシルス細胞、及びパンテア細胞からなる群より選択される、請求項22の方法。
- 代謝経路が芳香環経路である請求項22の方法。
- トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ及びフォスフォエノールピルビン酸シンターゼからなる群より選択されるタンパク質をエンコードするポチヌクレオチドを用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換をさらに含む、請求項22の方法。
- a) グルコーストランスポータの上流(5’)に対応するプロモーター及びDNAフランキング領域からなる第一DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコーストランスポーターをエンコードしている核酸配列と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾と、
b)グルコーストランスポーターをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換する、第一DNA構築物の組み込みをさせること、及び
c) PTS-/Glu-宿主細胞にGlu+表現型を復元させるグルコーストランスポーターの発現をさせること、から成る糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PST)を用いる能力を本来有しているPTS-/Glu-細菌宿主細胞にGlu+表現型を復元する方法。 - 細菌宿主細胞が大腸菌細胞、バシルス細胞、及びパンテア細胞からなる群より選択される、請求項26の方法。
- グルコキナーゼの上流(5’)領域に対応する外来プロモーター及びDNAフランキング領域からなる第二DNA構築物を用いて、PTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞のグルコキナーゼをエンコードしている核酸配列と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾と、
グルコキナーゼをエンコードしている核酸の外来プロモーターを置換する第二DNA構築物の組み込みをさせること、及び
グルコキナーゼの発現をさせることをさらに含む、請求項26の方法。 - 細菌宿主細胞が大腸菌細胞、バシルス細胞、及びパンテア細胞からなる群より選択される、請求項28の方法。
- Glu+を復元した細胞が、少なくとも0.4hr-1の特定の成長速度を有する、請求項26の方法。
- グルコーストランスポータがガラクトースパーミアーゼである、請求項26の方法。
- 請求項26の方法に従い、得られた、復元されたGlu+表現型を有する細菌系統。
- 請求項28の方法に従い、得られた、復元されたGlu+表現型を有する細菌系統。
- a)糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を用いる能力を本来有している、PTS-/Glu-表現型を有する細菌宿主細胞の選択と、
b)プロモーターを含むグルコース同化タンパク質をエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生プロモーターと置換する、選択された細菌宿主細胞内の染色体上に組み込まれるDNA構築物を用いた、前記選択された宿主細胞の形質転換からなる、選択された宿主細胞の、内生染色体調節領域の修飾と、
c)適切な条件下における形質転換された宿主細胞の培養と、及び
d)PEP利用度が、実質的に同じ培養条件下における対応する修飾されていないPTS細菌宿主細胞のPEP利用度と比較して増えている、PTS-/Glu+表現型を有する修飾された宿主細胞を得るためのグルコース同化タンパク質の発現をさせることからなる、細菌宿主細胞内のフォスフォエノールピルビン酸(PEP)の利用度を増やす方法。 - グルコース同化タンパク質が、ガラクトースパーミアーゼ及びガラクトースパーミアーゼの内生プロモーターと置換される外生プロモーターを含むDNA構築物である、請求項34の方法。
- グルコース同化タンパク質が、グルコキナーゼ及びグルコキナーゼの内生プロモーターと置換される外生プロモーターを含むDNA構築物である、請求項34の方法。
- 選択された細菌宿主細胞内の染色体上に組み込まれる、プロモーターを含むグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生プロモーターと置換するDNA構築物を用いた細菌宿主細胞の形質転換から成る、選択された細菌宿主細胞の内生染色体調節領域の修飾をさらに含む、請求項35の方法。
- 細菌宿主細胞が大腸菌細胞、バシルス細胞、及びパンテア細胞からなる群より選択される、請求項34の方法。
- 請求項34の方法であって、さらに、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ及びフォスフォエノールピルビン酸シンターゼをエンコードする核酸を用いた、選択された宿主細胞の形質転換をさらに含む方法。
- 請求項34の方法に従い得られた、変性宿主細胞。
- a) ガラクトースパーミアーゼの上流(5’)に対応する外来プロモーター及びDNAフランキング領域からなる、第一DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸配列と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾と、
b) グルコキナーゼの上流(5’)に対応するプロモーター及びDNAフランキング配列を含む第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾と、
c) 第一DNA構築物が、ガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターを置換され、第二DNA構築物が、グルコキナーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換される、第一及び第二DNA構築物の組み込みをさせること、
d)適切な条件下における形質転換された細菌宿主細胞の培養と、及び
e)実質的に同じ培養条件下における対応する修飾されていないPTS細菌宿主細胞の特定の成長速度と比較して早い成長速度を有する修飾された宿主細胞を得るために、適切な調節領域からガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼの発現をさせることからなる、糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を用いる能力を本来有しているPTS-/Glu-細菌宿主細胞の成長速度を速める方法。 - 請求項41の方法に従い得られた、変性宿主細胞。
- 細菌細胞が、パンテア細胞である、請求項41の方法に従い得られた、変性宿主細胞。
- 細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項41の方法に従い得られた、変性宿主細胞。
- トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ及びフォスフォエノールピルビン酸シンターゼからなる群より選択されるタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを用いた、選択された宿主細胞の形質転換をさらに含む、請求項41の方法。
- a) ガラクトースパーミアーゼの上流(5’)に対応する、外生プロモーター及びDNAフランキング領域からなる、第一DNA構築物を用いた大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞内のガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸配列と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾と、
b) グルコキナーゼの上流(5’)に対応するプロモーター及びDNAフランキング配列を含む第二DNA構築物を用いた大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾と、
c)ガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼの発現をさせるための、適切条件下における形質転された大腸菌PTS-/Glu-の培養と、及び
d)実質的に同じ条件下で培養された対応する大腸菌PTS-/Glu-細胞内の目的生成物の量と比較して増量された、形質転換された大腸菌細胞内の目的生成物を得ることにおいて、該目的生成物が、エタノール、コリスミ酸及びコハク酸である、糖質輸送に対するPTSを用いる能力を生来有しているPTS-/Glu-大腸菌細胞内における、目的生成物の生産を増やす方法。 - 外生プロモーターが、Gl、trc、tac、及びこれらの誘導体からなる群より選択される非天然プロモーターである請求項46の方法。
- 請求項46の方法に従い得られた、大腸菌細胞。
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