JP2022144466A - 新規微生物及び３－ヒドロキシ酪酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】従来よりも優れた３ＨＢ生産能を有する新規微生物を提供する。【解決手段】この新規微生物は、３－ヒドロキシ酪酸生産能を有するハロモナス・エスピーＫ７Ｆ２株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３４１５）である。【選択図】図３

Description

本発明は、３－ヒドロキシ酪酸生産能を有する新規微生物及び当該新規微生物を用いた３－ヒドロキシ酪酸の製造方法に関する。

３－ヒドロキシ酪酸やその塩（以下、単に「３ＨＢ」とも称する）は、もともと人の体内に存在する物質であるため生体親和性が高く、糖質に代わる画期的なエネルギー源として期待されている。また、３ＨＢは、単なるエネルギー源という役割だけでなく、様々な遺伝子の発現やタンパク質の活性に影響するシグナル伝達物質としての作用があることがわかってきた。３ＨＢは、例えば、遺伝子発現調節作用によって、ヒストン脱アセチル化酵素を阻害することによって認知機能や、長期持続記憶を改善することが知られ、アルツハイマーの予防に有効性が確認されている。また、ココナッツオイルに多く含まれる中鎖脂肪酸の摂取及び体内での代謝により生産される３ＨＢが、脳や体内において糖質をうまく利用できないアルツハイマー病や糖尿病の患者の症状を改善させる効果を持つことが知られている。更に、３ＨＢは、体内において糖質より速やかにエネルギーに変換されること、細胞への脂肪や糖の吸収を抑制する効果を有することから、アスリート向けのエネルギー物質や、ダイエット・健康食品分野などへの応用も盛んに行われている。

また、これらの用途の他、３ＨＢは、生分解性樹脂の原料としての利用が可能であることが知られており、工業的用途においても利用価値が高まりつつある物質である。

このような３ＨＢは、各種微生物にポリ３－ヒドロキシ酪酸（以下、単に「ＰＨＢ」と称する）を生産させた後、得られたＰＨＢを酵素等により分解することにより得ることができる（特許文献１）。また、このような微生物としてハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ－１株が、好気条件でＰＨＢを菌体内に蓄積し、微好気条件に移行することでＰＨＢを分解して生成した３ＨＢを培養液中に分泌産生することが見出されている（特許文献２）。尚、ハロモナス・エスピーＫＭ－１株（以下、「ＫＭ－１株」とも称する）は、平成１９年７月１０日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６茨城県つくば市東１－１－１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ－２１３１６として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ－１０９９５である。当該ハロモナス・エスピーＫＭ－１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、ＤＤＪＢにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ４７７０１５として登録されている。

特開２０１０－１６８５９５号公報 特開２０１３－８１４０３号公報

ところで、上記のような微生物を用いて３ＨＢを生産しようとした場合、当該微生物が生産したＰＨＢを一旦体内に蓄積した後、この蓄積されたＰＨＢが３ＨＢに分解される必要がある。しかしながら、上記微生物における菌体での蓄積量には限界があるため、３ＨＢの生産量を向上させるためには、ＰＨＢの蓄積量を向上させる必要がある。

本発明は以上の実情に鑑みなされたものであり、従来よりも優れた３ＨＢ生産能を有する新規微生物、及び当該新規微生物を用いた３ＨＢの製造方法の提供を、その目的とする。

上記目的を達成するための本発明に係る新規微生物は、
３－ヒドロキシ酪酸生産能を有するハロモナス・エスピーＫ７Ｆ２株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３４１５）である。

ハロモナス・エスピーＫ７Ｆ２株（以下、「Ｋ７Ｆ２株」とも称する）の菌学的性質を調べたところ、上記ＫＭ－１と比較して、菌体内へのＰＨＢ蓄積能が大きく向上し、３ＨＢ生産能も向上していることを確認できた。

また、上記目的を達成するための本発明に係る３－ヒドロキシ酪酸の製造方法の特徴構成は、
ハロモナス・エスピーＫ７Ｆ２株を、無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源とを含む培地で好気培養する好気発酵工程と、
好気発酵工程の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記ハロモナス・エスピーＫ７Ｆ２株を培養し、培養液にて３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生する微好気発酵工程と、
微好気発酵工程で得られる培養液から、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する回収工程と、を順に行う点にある。

上記特徴構成によれば、ハロモナス・エスピーＫ７Ｆ２株を用いることで、ＫＭ－１株を用いた場合と比較して、多量のＰＨＢが蓄積され、当該ＰＨＢが分解された際に分泌生産される３ＨＢの量も多くなる。つまり、上記特徴構成によれば、従来よりも３ＨＢの生産性を大きく向上させることができる。

Ｋ７Ｆ２株及びＫＭ－１株の３ＨＢ培地における増殖性を示すグラフである。 Ｋ７Ｆ２株及びＫＭ－１株のＰＨＢ蓄積量を示すグラフである。 Ｋ７Ｆ２株及びＫＭ－１株の３ＨＢ生産量を示すグラフである。

以下、本発明に係るハロモナス・エスピーＫ７Ｆ２株について説明する。尚、以下に好適な実施例を記すが、これら実施例はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。また、以下において、特に言及しない限り、「％」とは質量体積パーセントを指す。

〔ハロモナス・エスピーＫ７Ｆ２株〕
本願発明者らは、以下のようにして、親株であるＫＭ－１株に対して変異原性基質アナログであるＮ^４－アミノシチジン処理によって突然変異導入を行い、変異体ライブラリを得た。得られた変異体ライブラリの一つを用いて、密度勾配遠心法によりＫＭ－１株よりも沈殿性の高い区分をグルコースを単一炭素源として含むＳＯＴ固体培地上にプレーティングし、複数の高沈殿性候補株を単離した。得られた複数の高沈殿性候補株からＫＭ－１株よりも増殖性に優れたＫ７Ｆ２株を得た。以下、Ｋ７Ｆ２株の単離方法について具体的に示す。

〔突然変異導入〕
基質アナログ処理は、以下の手順にて行った。
０．１ｍＭのＮ^４－アミノシチジンを含むグルコースを単一炭素源とするＳＯＴ培地（培地１）を用いてＫＭ－１株の振とう培養を行った後、得られた培養液の最下層側１／１００体積量を同じくＮ^４－アミノシチジンを含有する同組成の新しいＳＯＴ培地（培地１）に植え継ぎ、１回目と同様の条件にて振とう培養を行った。同様の継代培養操作を１４回繰り返し実施した後、得られた培養液を変異体ライブラリとした。

〔密度勾配遠心〕
上記の得られた変異体ライブラリの一つを遠心チューブに移して密度勾配遠心を行い、主要分離層よりチューブ底側の菌体を回収した。その後、回収した菌体をグルコースを単一炭素源として含むＳＯＴ固体培地（培地１）上にプレーティングして静置培養することで、複数の高沈殿性候補株を単離した。

〔増殖性評価〕
上記のように得られた複数の高沈殿性候補株について、スクロースを単一炭素源として含有し、培地中のスクロースの終濃度が０．１％、１％及び２５％である３種類のＳＯＴ液体培地（培地２）を用いて振とう培養を行い、ＫＭ－１株よりも優れた増殖性を示した１株（Ｋ７Ｆ２株）を選抜した。尚、図１は、ＫＭ－１株及びＫ７Ｆ２株を上記各培地で培養した際のＯＤ値（ＯＤ６００）を示すグラフである。

〔ＰＨＢ及び３ＨＢの生産性評価〕
上記選抜した１株及びＫＭ－１株について、炭素源としてスクロースを含有するＰＨＢ・３ＨＢ生産用培地（培地３）を用いて、後述するＰＨＢ生産性試験及び３ＨＢ生産性試験を行い、ＰＨＢ蓄積量及び３ＨＢ生産性を評価した。その結果、図２及び図３により、選抜した１株は、ＫＭ－１株よりも高いＰＨＢ蓄積量及び３ＨＢ生産性を示すことを確認した。この選抜した１株を３－ヒドロキシ酪酸生産能を有する新規微生物ハロモナス・エスピーＫ７Ｆ２株として得た。このＫ７Ｆ２株は、下記菌学的性質により、親株のＫＭ－１株から変異した新規菌株であることが明らかであり、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、新規微生物Ｋ７Ｆ２株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３４１５）として寄託されている。

上記各培地は、以下の組成のものを用いた。

（培地１）グルコースを単一炭素源として含有するＳＯＴ培地
成分 ： 培地中の終濃度
グルコース ： １０．０ ｇ／Ｌ
ＮａＨＣＯ_３ ： １２．６ ｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＣＯ_３ ： ５．３ ｇ／Ｌ
Ｋ_２ＨＰＯ_４ ： ２．０ ｇ／Ｌ
ＮａＮＯ_３ ： １２．５ ｇ／Ｌ
Ｋ_２ＳＯ_４ ： １．０ ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ： ０．２ ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ： ０．０５３ ｇ／Ｌ
Ｆｅ_２ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ： ０．０１ ｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＥＤＴＡ ： ０．０８ ｇ／Ｌ
Ｈ_３ＢＯ_３ ： ２．８６ ｍｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ_４ ： １．８１ ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ_４ ： ０．２２２ ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ： ０．０７９ ｍｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ： ０．３９ ｍｇ／Ｌ
Ｃｏ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ ： ０．０４９ ｍｇ／Ｌ

（培地２）スクロースを単一炭素源として含有するＳＯＴ培地
成分 ： 培地中の終濃度
スクロース ：１．０ ｇ／Ｌ、１０．０ ｇ／Ｌ又は２５０．０ ｇ／Ｌ
ＮａＨＣＯ_３ ： １２．６ ｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＣＯ_３ ： ５．３ ｇ／Ｌ
Ｋ_２ＨＰＯ_４ ： ２．０ ｇ／Ｌ
ＮａＮＯ_３ ： １２．５ ｇ／Ｌ
Ｋ_２ＳＯ_４ ： １．０ ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ： ０．２ ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ： ０．０５３ ｇ／Ｌ
Ｆｅ_２ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ： ０．０１ ｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＥＤＴＡ ： ０．０８ ｇ／Ｌ
Ｈ_３ＢＯ_３ ： ２．８６ ｍｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ_４ ： １．８１ ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ_４ ： ０．２２２ ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ： ０．０７９ ｍｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ： ０．３９ ｍｇ／Ｌ
Ｃｏ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ ： ０．０４９ ｍｇ／Ｌ

（培地３）炭素源としてスクロースを含有するＰＨＢ・３ＨＢ生産用培地
成分 ： 培地中の終濃度
スクロース ： ３００ ｇ／Ｌ
ＮａＨＣＯ_３ ： ２．５２ ｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＣＯ_３ ： １０．６ ｇ／Ｌ
Ｋ_２ＨＰＯ_４ ： ２．０ ｇ／Ｌ
Ｋ_２ＳＯ_４ ： １．０ ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ： ０．２ ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ： ０．０５３ ｇ／Ｌ
Ｆｅ_２ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ： ０．０１ ｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＥＤＴＡ ： ０．０８ ｇ／Ｌ
グルタミン酸ナトリウム ： ２５ ｇ／Ｌ
酵母エキス ： ０．１ｇ／Ｌ

（Ｋ７Ｆ２株の分類学上の位置）
得られたＫ７Ｆ２株は、親株ＫＭ－１株の突然変異体である。
ＫＭ－１株の分類学的性質は、好気性、生育温度２０～３７℃、生育可能ｐＨ８．０～１１．０であり、Ｋ７Ｆ２株も同様の性質を持つことを確認した。また、１６Ｓリボゾーム配列（１５３５ｂｐの塩基配列）について、ＤＤＪＢにてＢＬＡＳＴプログラムを用いた分析結果から、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ属の菌株の１０種類以上と９６～９９％の相同性を示したことからＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．と同定した。

（Ｋ７Ｆ２株の科学的性質）
Ｋ７Ｆ２株は、ＫＭ－１とともに、各種炭素源（グルコース、スクロース、グリセロール、エタノール等）の資化能を有し、高濃度塩存在下で培養可能であり、好気培養によって著量のポリ３－ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を菌体内に蓄積する。更に、好気条件から微好気条件への移行により、蓄積したＰＨＢを加水分解し、３－ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）を菌体外に分泌する。このＫ７Ｆ２株は、ＫＭ－１株と比較して、好気培養終了時のＰＨＢ蓄積量及び微好気培養終了時の３ＨＢ分泌量が向上した菌株として単離された。

〔３ＨＢの製造方法〕
以下、Ｋ７Ｆ２株を用いた３－ヒドロキシ酪酸の製造方法を説明する。尚、以下に好適な実施例を記すが、これら実施例はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。

具体的には、以下の工程に従って培養を行う。
（１）Ｋ７Ｆ２株を、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源とを含む培地で好気培養する好気発酵工程と、
（２）好気発酵工程の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、Ｋ７Ｆ２株を培養し、培養液にて３ＨＢ又はその塩を産生する微好気発酵工程と、
（３）微好気発酵工程で得られる培養液から、３ＨＢ又はその塩を回収する回収工程。

＜Ａ：３ＨＢ生産菌＞
３ＨＢ生産菌としては、上記Ｋ７Ｆ２株を下記により培養したものを用いる。

＜Ｂ：培地＞
好気発酵工程にて用いる培地は、無機塩及び有機炭素源を含有する。培地のｐＨは上記Ｋ７Ｆ２株の生育条件を満たすｐＨであれば特に限定されないが、具体的には、ｐＨ５～１２程度にすればよく、ｐＨ８～１１であることがより好ましい。尚、アルカリ性の培地を用いれば、他の菌のコンタミネーションを効果的に防止でき、また、分泌された３ＨＢがクロトン酸へ変化するのを抑制できるので好ましい。

また、培地は、液体培地であってもよいし、固体培地であってもよい。

好気発酵工程にて用いる培地に配合する無機塩は、特に限定されることはなく、例えば、リン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。

例えば、ナトリウムを無機塩として用いる場合は、ＮａＣｌ、ＮａＮＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３等を用いればよい。

これらの無機塩は、上記Ｋ７Ｆ２株にとって窒素源やリン源となるような化合物を用いることが好ましい。

窒素源は、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、アンモニウム塩、グルタミン酸等を用いればよく、特に限定されないが、例えば、ＮａＮＯ_３、ＮａＮＯ_２、ＮＨ_４Ｃｌ等の化合物を用いればよい。

窒素源の使用量は、菌体の生育に影響を及ぼすことなく、本発明の実施形態に係る３ＨＢ又はその塩の生産目的が達成される範囲において適宜設定すればよく、具体的には、培養初期の培地１００ｍｌ当たり通常であれば硝酸塩として５００ｍｇ程度以上とすればよく、より好ましくは１０００ｍｇ程度以上、更に好ましくは１２５０ｍｇ程度以上である。

リン源は、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等を用いればよく、特に限定はされないが、例えば、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４等の化合物を用いればよい。

リン源の使用量も、上記の窒素源の使用量と同様の観点から適宜設定すればよく、具体的には、リン酸二水素塩として培地１００ｍｌ当たり通常は５０～４００ｍｇ程度とすればよく、より好ましくは１００～２００ｍｇ程度である。

これらの無機塩は単一で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

その他の化合物等も含めた無機塩は、総量で通常は０．１～２．５Ｍ程度となる濃度で
用いればよく、好ましくは０．２～１．０Ｍ程度、より好ましくは０．２～０．５Ｍ程度
である。

培地に配合する有機炭素源は、特に限定されない。例えば、トリプトン、酵母エキス、可溶性デンプン、エタノール、ｎ－プロパノール、酢酸、酢酸ナトリウム、プロピオン酸、廃グリセロール、廃蜜糖、木材糖化液、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等の六炭糖；リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボース等の五炭糖；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等の二糖；エリスリトール、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられる。

有機炭素源の濃度は、３ＨＢ又はその塩の生産量を確保できる範囲において適宜設定すればよい。

本発明に係る３ＨＢの製造方法では、塩濃度が比較的高い条件の培地で、Ｋ７Ｆ２株を培養するので、他の菌体の混入、増殖の恐れ等がほとんどない。したがって、培地に対して滅菌処理等を行っても行わなくてもよく、且つ、簡便な設備で培養することも可能である。

＜Ｃ：好気発酵工程＞
好気発酵工程における上記Ｋ７Ｆ２株の培養は、好気培養を採用する。好気培養の条件は、当該菌体が増殖し、且つ、当該菌体内にＰＨＢが著量蓄積するような条件であれば、特に限定されない。

具体的には、５ｍｌ程度の培地にＫ７Ｆ２株を植菌し、攪拌速度を１２０～２５０ｒｐｍとし、所定の温度にて１晩振とうしながら前培養を行う。続いて前培養して得られた菌体を、三角フラスコ、発酵槽、ジャーファーメンター等に入った培地中に１００倍程度に希釈し本培養する。

本培養の培養温度は、通常２０～４５℃程度の範囲内で設定可能であるが、３０～３７℃程度の範囲内で設定することが好ましい。

好気発酵工程では、このような培養条件でＫ７Ｆ２株を好気培養すればよい。具体的に好気培養時の培地中の溶存酸素濃度は、特に限定はされないが、通常は０ｍｇ／Ｌ以上とすればよく、７ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。

好気発酵工程での培養方法は、回分培養、半回分培養、連続培養等の培養方法が挙げられ、特に限定はされないが、Ｋ７Ｆ２株に他の菌が混入する可能性が極めて低いことを考慮すれば、３ＨＢ又はその塩を効率よく製造するための長期の連続培養も可能である。尚、培養環境は、培地が空気に触れる環境とすればよく、培地表面に積極的に酸素を含む気体を吹き付ける方法や当該気体を培地中に吹き込む方法により調整してもよい。また、培養環境は、非滅菌環境下であっても滅菌環境下であってもよい。

＜Ｄ：微好気発酵工程＞
本発明の製造方法における微好気発酵工程は、好気発酵工程の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、Ｋ７Ｆ２株を培養し、培養液にて３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生する工程である。

尚、「培養液にて３－ヒドロキシ酪酸を産生する」とは、Ｋ７Ｆ２株が培養液に３ＨＢを分泌することを意味する。また、「培養液にて３－ヒドロキシ酪酸の塩を産生する」とは、Ｋ７Ｆ２株が培養液に３ＨＢの塩を分泌することのみならず、Ｋ７Ｆ２株が培養液に分泌した３ＨＢが、培養液中に存在する陽イオン成分と反応して３ＨＢの塩を形成することも意味する。３ＨＢと反応して塩を形成する陽イオン成分としては、培養液中に含まれているものであれば、特に限定されないが、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、モリブデンイオン、アンモニウムイオン、マンガンイオン等が挙げられる。

具体的には、Ｋ７Ｆ２株をｐＨ８．０以上のアルカリ性領域に調整及び／又は維持して培養し、培養液にてＫ７Ｆ２株に酸素供給を積極的には行わない条件下で３ＨＢ又はその塩を産生する工程である。Ｋ７Ｆ２株に積極的に酸素供給を行わずに培養を継続すると、系内の酸素が消費され無酸素に近い状態となるが、絶対嫌気とまではならない酸素濃度数％の環境が維持されるため、微好気培養に適した環境を維持できる。

尚、微好気培養の条件は、菌体内に蓄積されたＰＨＢが３ＨＢとして培地中に分泌されるような条件であれば、特に限定されない。

微好気培養を継続した場合、有機酸の生成により、培地のｐＨは下がる傾向がある。この様な培地のｐＨは適宜公知のｐＨ測定用装置又はこれが付随したジャーファーメンター等によって確認することができる。

尚、「調整及び／又は維持」とは、上述のようなｐＨの確認を行いながら、ｐＨ調整剤を添加してｐＨの好適な状態を保つことや、単にｐＨ調整剤を添加して培養開始時のｐＨを調整し、その後はｐＨの調整を行わないことを意味する。

微好気発酵工程にて調整及び維持するｐＨは好ましくは８．０以上とする。これにより、Ｋ７Ｆ２株による３ＨＢ生産性を高く維持することができる。

尚、Ｋ７Ｆ２株は、中程度の高塩濃度且つアルカリ条件下で培養することが可能であるため、夾雑菌の混入・繁殖（コンタミネーション）が少ない。しかしながら、一部乳酸菌には、中程度の高塩濃度且つｐＨ８．４以下の環境下において増殖可能な菌も存在し、このような菌が本発明の培養系にコンタミネーションすると、Ｋ７Ｆ２株が分泌した３ＨＢ又はその塩を乳酸発酵の基質として消費してしまい、更には培地のｐＨの一段の低下を生じさせる恐れがある。

このため、本発明において培地を滅菌せず及び／又は非滅菌環境下でＫ７Ｆ２株を培養して、培地中に３ＨＢを分泌させるためには、微好気発酵工程における培地のｐＨの調整及び維持をｐＨ８．５程度以上とすることが好ましい。

ｐＨ調整剤としては、特に限定はされないが、例えば水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩等が挙げられる。より具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム、炭酸水素マグネシウム、アンモニア水等が挙げられる。

ｐＨの調整時期は、Ｋ７Ｆ２株内でのＰＨＢの蓄積量がほぼ一定となる時期であれば特に限定されないが、例えば、好気発酵工程によって得られるＫ７Ｆ２株の菌体中のＰＨＢの蓄積量が乾燥菌体１００重量部当たり１５重量部程度以上となる時期等が挙げられる。

具体的なＫ７Ｆ２株の菌体中のＰＨＢの蓄積量は、公知の手法を用いて測定することができる。

＜Ｅ：回収工程＞
本発明の製造方法における回収工程は、微好気発酵工程で得られる培養液から、３ＨＢ又はその塩を回収する工程である。

回収工程では、公知の手法を用いて３ＨＢ又はその塩を回収すればよい。回収とは、培養液中に３ＨＢ又はその塩が存在しているときに、微好気発酵工程の培養を停止し、３ＨＢ又はその塩を含む培養液と、Ｋ７Ｆ２株の菌体とを分離することである。例えば、液体培地を使用して微好気発酵工程を行う場合、当該工程で得られる培養液に分泌された３ＨＢ又はその塩が存在するため、当該工程の培養を停止し、必要に応じて培養液とＫ７Ｆ２株とを分離手段で分離し、培養液を得ることである。

具体的な分離の手法は、遠心操作やろ過等の公知の固液分離操作を採用できる。また、培養の停止方法も特に限定されない。例えば、微好気発酵工程後にＫ７Ｆ２株を含む培養液を加熱、酸処理等の方法によって殺菌する方法や固液分離操作を行って培養液とＫ７Ｆ２株とを分離する方法等を採用し得る。

培養液中の３ＨＢ又はその塩の存在を確認する方法は、菌種、培地成分、培養条件等により変わり得るものであるので、これらの要素を考慮して適宜決定する。例えば、継時的に培養液を採取し、これをＨＰＬＣ等の分析方法に供して、培養を停止する時間を決定することもできる。

尚、回収される３ＨＢの塩が、培養液中に含まれる無機塩に基づくナトリウム、カルシウム等のアルカリ金属；アルカリ土類金属陽イオン等と反応したアルカリ金属塩として回収された場合、３ＨＢを製造するには、回収した培養液を晶析等の常法に供すればよい。

また、回収した培養液を適切なカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製工程に供してもよい。これら以外の他の方法として、回収した培養液のｐＨを適宜変更して、所望の３ＨＢ又はその塩のいずれかを精製工程に供してもよい。また、回収した培養液に低級アルコール類を添加し、エステル化反応を経て、３ＨＢエステルとして蒸留等で精製することも可能である。

以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。尚、本発明が実施例に限定されないことは言うまでもない。

〔ＰＨＢ生産性試験〕
上記好気発酵工程を、Ｋ７Ｆ２株にて行った場合とＫＭ－１株にて行った場合とで、ＰＨＢの蓄積量がどの程度異なるかについて調べた。

具体的には、スクロースを炭素源として含む培地（培地３）を収容したバッフル付きのフラスコ培養容器に各菌株を添加して、２００ｒｐｍ以上の回転速度で振とうしつつ好気発酵工程を行った。これにより、各菌株により糖質が資化されてＰＨＢが生産され、各菌株体内にＰＨＢが蓄積された。

図２は、Ｋ７Ｆ２株及びＫＭ－１株のＰＨＢ蓄積量と培養時間との関係を示すグラフである。ＫＭ－１株のＰＨＢ蓄積量は、培養開始からおよそ６９時間後に最大値（７５ｇ／Ｌ）となったのに対し、Ｋ７Ｆ２株のＰＨＢ蓄積量は、培養開始からおよそ６０時間後に最大値（１２１ｇ／Ｌ）となっている。このことから、Ｋ７Ｆ２株は、ＫＭ－１株と比較してＰＨＢ蓄積量が極めて高いことが確認できた。

〔３ＨＢ生産性試験〕
次に、好気発酵工程から微好気発酵工程に移行することにより、各菌株体内に蓄積したＰＨＢを３ＨＢに変換し、培養液中への３ＨＢの分泌生産を行った。微好気培養への移行にあたっては、振とう速度を培養液の均一性を保つための必要最低限の速度まで低下させ、培地中の酸素濃度を十分に低いレベルに維持した。

図３は、Ｋ７Ｆ２株及びＫＭ－１株の３ＨＢ生産量と培養時間との関係を示すグラフである。ＫＭ－１株の３ＨＢ生産量は、最大で６１ｇ／Ｌであるのに対し、Ｋ７Ｆ２株の３ＨＢ生産量は、最大で８９ｇ／Ｌであった。このことから、Ｋ７Ｆ２株は、ＫＭ－１株と比較して３ＨＢ生産性も高いことが確認できた。

以上のことから、Ｋ７Ｆ２株は、ＫＭ－１株と比較して極めて高いＰＨＢ蓄積量及び３ＨＢ生産性を有し、当該Ｋ７Ｆ２株を用いることで、従来よりも３ＨＢの生産性を大きく向上させることができることが確認できた。

本発明は、３ＨＢ又はその塩の製造方法に適用することができる。

Claims (2)

1. ３－ヒドロキシ酪酸生産能を有するハロモナス・エスピーＫ７Ｆ２株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３４１５）。
2. ハロモナス・エスピーＫ７Ｆ２株を、無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源とを含む培地で好気培養する好気発酵工程と、
   前記好気発酵工程の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記ハロモナス・エスピーＫ７Ｆ２株を培養し、培養液にて３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生する微好気発酵工程と、
   前記微好気発酵工程で得られる培養液から、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する回収工程と、を順に行う３－ヒドロキシ酪酸の製造方法。

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