WO2013057962A1 - 微生物の培養方法、および微生物代謝産物の製造方法 - Google Patents

微生物の培養方法、および微生物代謝産物の製造方法 Download PDF

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WO2013057962A1
WO2013057962A1 PCT/JP2012/006741 JP2012006741W WO2013057962A1 WO 2013057962 A1 WO2013057962 A1 WO 2013057962A1 JP 2012006741 W JP2012006741 W JP 2012006741W WO 2013057962 A1 WO2013057962 A1 WO 2013057962A1
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carbon source
microorganism
culture
culture method
pha
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PCT/JP2012/006741
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俊輔 佐藤
中島　淳
松本　圭司
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株式会社カネカ
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for industrially efficiently producing microorganisms and producing microorganism metabolites such as polyhydroxyalkanoate (hereinafter referred to as PHA) by microorganisms.
  • PHA polyhydroxyalkanoate
  • a carbon source (carbon source for culture, fermentation, etc.) that is suitably assimilated by microorganisms is required.
  • the carbon source include carbohydrates, fats and oils (for example, animal and vegetable fats and oils), fatty acids (for example, fatty acids derived from animals and plants), and the like.
  • the utilization of microorganisms is low and is preferably used.
  • the solubility of fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid and stearic acid, which have a high melting point, is 0.1 g / L or less even for lauric acid having the highest solubility in water, and palmitic acid, stearic acid, etc. Will aggregate at a concentration of 1 ⁇ M or less (Non-patent Document 1). These properties are a cause of reducing the utilization by microorganisms.
  • Non-patent Document 2 Non-patent Document 2 in which Aeromonas hydrophila was cultured using lauric acid alone as a carbon source to produce PHA, but the dry cell mass is suitably used as about 8 g / L. However, it is described that lauric acid is solid at the culture temperature, which increases the difficulty of the culture.
  • PHA productivity has been reported. Since it is as low as 1 g / L or less, it cannot be said that it is suitably used as a carbon source.
  • Non-patent Document 3 in which Escherichia coli was cultured using a fatty acid metal salt such as sodium laurate alone as a carbon source to produce PHA, but the amount of sodium laurate used is about 2 g / L. Met.
  • Palm oil having a melting point higher than the culture temperature (30 ° C.) is used, but the dry cell mass is as low as 4.1 g / L in 72 hours of culture, and it cannot be said that it is suitably used ( Non-patent document 4). Palm oil is a solid fat having a melting point of about 36 ° C., and it is desired to develop a technique that suitably uses palm oil and its constituent fatty acids and derivatives as carbon sources for microorganisms.
  • Non-Patent Document 5 a method of finely dispersing oil with low solubility in a medium by using sunflower oil in a culture solution while passing through a ceramic membrane is reported.
  • Non-Patent Document 5 production examples of surfactants and PHA using Pseudomonas bacteria are described. Since this technology has the feature of using a membrane, there is a problem that the scope of application is limited to a liquid carbon source at the culture temperature, and since it is not an emulsified state, the particles are fused to form a finely dispersed state. Is not expected to be maintained.
  • Patent Document 2 examples of improving the fermentation productivity of L-threonine and L-lysine from the fatty acids by emulsifying lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, and linoleic acid have been reported.
  • Patent Document 2 The technique describes a culture method using lauric acid, myristic acid, palmitic acid, and stearic acid having a melting point higher than the culture temperature.
  • the productivity of amino acids improved, there were cases where the number of viable bacteria decreased, which was unsuitable for this production technique for accumulating PHA in cells.
  • a decrease in the content ratio of oleic acid to palmitic acid causes a decrease in productivity, so that the application range is limited.
  • Non-patent Document 6 an attempt to shorten the lag time at the start of culture by adding gum arabic (GA) as an emulsifier to palm oil and emulsifying has been reported (Non-patent Document 6).
  • GA gum arabic
  • fatty acid-based emulsifiers such as SDS and TritonX-100 inhibit the growth of microorganisms.
  • SDS and TritonX-100 inhibit the growth of microorganisms.
  • the growth rate of microorganisms has been improved by using an emulsified carbon source.
  • emulsification using GA is difficult to apply to industrial production from the viewpoint of economy. It is described that there is.
  • Examples of culture techniques for controlling the melting point of a carbon source include an efficient production example of PHA using oils and fats, fatty acids, or a mixture thereof as a raw material (Patent Document 3).
  • the technique describes a method of lowering the melting point of a carbon source by using a mixture of a plurality of fatty acids and fats and oils. If the melting point of the carbon source is higher than the culture temperature, the melting point of the carbon source and the temperature of the culture temperature are described. The greater the difference, the lower the assimilation by microorganisms, and the usable carbon sources were limited.
  • the present invention uses a carbon source having a melting point higher than the culture temperature and low solubility in water at 25 ° C. to efficiently produce microorganisms and produce microorganism metabolites by microorganisms industrially efficiently. It is an object to provide a method. Another object of the present invention is to provide a method for producing microbial metabolites such as PHA industrially efficiently using the above carbon source.
  • the present inventors use a carbon source having a melting point higher than the culture temperature and low solubility in water at 25 ° C. to efficiently produce microorganisms and produce substances using microorganisms industrially.
  • a carbon source having a melting point higher than the culture temperature and low solubility in water at 25 ° C. We made an intensive study. As a result, it was found that microorganisms can suitably assimilate a carbon source having a melting point higher than the culture temperature by adjusting the carbon source to a certain specific surface area or more, and using the carbon source.
  • the present invention was completed by discovering that the production of microorganisms and the production of substances such as PHA by microorganisms can be carried out industrially and efficiently.
  • One of the characteristics of the present invention is a step of adjusting the specific surface area of a carbon source having a melting point higher than the culture temperature and having a solubility in water at 25 ° C. of 10 g / L or less to 20 cm 2 / g or more, And culturing the microorganism in the presence of a carbon source.
  • Another feature of the present invention is the culturing method described above, wherein the microorganism is a polyhydroxyalkanoate-producing microorganism, and the culture produces polyhydroxyalkanoate.
  • the step of adjusting the specific surface area of the carbon source to 20 cm 2 / g or more comprises emulsifying the carbon source in advance before adding the carbon source to the medium.
  • the above-mentioned culturing method is characterized by forming an emulsion.
  • Another feature of the present invention is the culture method described above, wherein the oil content in the carbon source emulsion is 10 wt% to 70 wt%.
  • Another feature of the present invention is the culturing method described above, wherein the carbon source is a carbon source having emulsifying activity.
  • Another feature of the present invention is the culture method described above, wherein the carbon source contains an emulsifier that can be assimilated by the microorganism.
  • Another feature of the present invention is the culturing method described above, wherein the carbon source contains monoglyceride and / or diglyceride in a total amount of 0.1% by weight or more based on the total amount of the carbon source.
  • Another feature of the present invention is the culturing method described above, wherein the carbon source contains 0.01 to 10% by weight of lecithin.
  • Another feature of the present invention is the culture method described above, wherein the carbon source has a melting point higher by 2 ° C. than the culture temperature.
  • Another feature of the present invention is the culturing method described above, wherein the carbon source is an oil or fat, a fatty acid, or a mixture thereof.
  • Another feature of the present invention is the culturing method described above, wherein the carbon source is derived from palm oil.
  • Another feature of the present invention is the culture method described above, wherein the microorganism is a bacterium.
  • Another feature of the present invention is the culture method described above, wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Cupriavidus or Esherichia.
  • Another feature of the present invention is the culturing method described above, wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Cupriavidus.
  • Another feature of the present invention is the culture method described above, wherein the microorganism is Cupriavidus necator.
  • Another feature of the present invention is the culture method described above, wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Esherichia.
  • Another feature of the present invention is the culture method described above, wherein the microorganism is Esherichia coli.
  • Another feature of the present invention is the culture method described above, wherein the microorganism is yeast.
  • Another feature of the present invention is a method for producing a microbial metabolite characterized by obtaining a microbial metabolite produced by the microorganism after culturing the microorganism by any one of the culture methods described above. is there.
  • PHA poly-3-hydroxybutyric acid
  • 3HB 3-hydroxybutyric acid
  • 3HH 3-hydroxyhexanoic acid
  • PHBH polymer
  • the carbon source is derived from non-petroleum in consideration of environmental load.
  • vegetable oils include palm oil having a high melting point fatty acid as a structural unit, and fatty acid constituting palm oil.
  • microorganism used in the present invention may be archaea, bacteria, yeast, mold, actinomycetes, and the like.
  • the microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism that assimilate the carbon source, but microorganisms belonging to the genus Cupriavidus, Escherichia, or Aeromonas are preferable.
  • a carbon source having a low solubility in water at 25 ° C. and a melting point higher than the culture temperature is used to industrially produce microorganisms and microorganism metabolites such as PHA by microorganisms. It becomes possible to carry out efficiently.
  • the carbon source In the production of microorganisms and the production of substances using microorganisms, in general, when using a carbon source with high solubility in water, such as sugars such as glucose and sucrose, the carbon source is cultured under normal operating conditions. It is dissolved in a liquid such as a culture solution used in the above, and can be easily used as a carbon source.
  • animal and plant-derived fatty acids and oils and fats which are renewable resources, are useful carbon sources for the production of microorganisms and the production of substances such as PHA by microorganisms.
  • a carbon source having a melting point higher than the culture temperature and showing a solid property in the culture solution is difficult to use suitably for microorganisms. .
  • these carbon sources can be used very effectively by using the present invention.
  • a carbon source having a solubility in water at 25 ° C. of 10 g / L or less can be suitably used.
  • a carbon source having a solubility in water at 25 ° C. of 1 ⁇ g / L or less can be suitably used.
  • a carbon source having a solubility in water at 25 ° C. of 0.1 g / L or less can be suitably used.
  • the carbon source in the present invention When the carbon source in the present invention is added to the culture so as to increase the specific surface area, the dispersibility in the medium is improved and it is suitably assimilated by the microorganism.
  • Carbon sources can be used.
  • emulsification refers to a state in which one or more substances that are not soluble in each other are dispersed in one into the other by stirring.
  • the substance include water and fats and oils, water and fatty acids, and a mixture of water, fats and fats and fatty acids.
  • the emulsification according to the present invention does not require that two or more substances have the same phase. For example, the emulsification is defined even when the continuous phase is liquid and the dispersed phase is solid.
  • the carbon source used in the present invention is not particularly limited as long as it has a melting point higher than the culture temperature of the microorganism and is usually in a form in which the microorganism is difficult to use, and a carbon source having a melting point higher by 2 ° C. or more than the culture temperature.
  • a carbon source having a melting point of 5 ° C. or higher than the culture temperature more preferably a carbon source having a melting point of 10 ° C. or higher than the culture temperature is more effective because the carbon source medium has poor dispersibility in a general method. It is.
  • a carbon source having a melting point of 32 ° C. or higher can be suitably used.
  • a carbon source having a melting point of 35 ° C. or higher can be suitably used.
  • a carbon source having a melting point of 36 ° C or higher, 39 ° C or higher, 40 ° C or higher, 42 ° C or higher, or 44 ° C or higher can be suitably used.
  • the carbon source in the present invention differs depending on the type of microorganism used, the type of metabolite such as PHA produced by the microorganism, and various culture conditions (medium components, pH, culture temperature, etc.), and is always defined uniformly.
  • the carbon source can assimilate microorganisms, has extremely low solubility in water, and has a melting point higher than the culture temperature, the effects of the present invention can be exhibited.
  • the carbon source having a melting point higher than the culture temperature and having a solubility in water at 25 ° C. of 10 g / L or less preferably, fats and oils, fatty acids, or a mixture thereof is used.
  • the carbon source of the present invention can be used in combination with a carbon source having a melting point lower than the culture temperature or a carbon source having a solubility in water at 25 ° C. exceeding 10 g / L.
  • the fats and oils include fatty acid glycerin esters such as triglyceride, diglyceride, and monoglyceride, and these may be used alone or as a mixture. If the microorganisms used are fats and oils having a metabolic pathway, they can be suitably used in the present invention.
  • fatty acids examples include free fatty acids, fatty acid salts, fatty acid esters and the like, and these may be used alone or as a mixture. If the microorganism to be used is a fatty acid having a metabolic pathway, it can be suitably used in the present invention. Since it is not necessary to hydrolyze when the microorganism is used, fatty acids are more preferable than fats and oils as a form that the microorganism can easily use.
  • the fats and oils, fatty acids, or a mixture thereof is preferably non-petroleum in consideration of environmental burden, and is more preferably animal or vegetable oils or fatty acids derived from animal or vegetable oils. preferable. More preferably, it is more desirable to use non-edible fats and oils or fatty acids in consideration of the influence on food problems.
  • animal and vegetable oils examples include beef tallow, pork tallow, milk fat, fish oil, soybean oil, rapeseed oil, sunflower oil, olive oil, sesame oil, canola oil, cottonseed oil, rice oil, safflower oil, coconut oil, palm oil, palm kernel oil , Shea fat, monkey fat, iripe fat, cacao butter, Jatropha oil, fractionated oils of these fats, hardened oil, and transesterified oil.
  • fatty acids derived from animal and vegetable oils include fatty acids, fatty acid salts, and fatty acid esters that are constituents of the aforementioned animal and vegetable oils. These can be used alone or in combination of two or more.
  • a component generated as a by-product in the process of refining the above fats and oils in order to avoid competition with food.
  • Examples of by-products in the purification treatment include fatty acid salts produced in the alkaline deoxidation process, distillation residues produced in the distillation deoxidation process, and distillation residues produced in the deodorization process.
  • fatty acid salts include fatty acid sodium, fatty acid potassium, fatty acid calcium, and fatty acid magnesium.
  • the distillation residue may contain monoglyceride, diglyceride and the like in addition to the main fatty acid.
  • the ratio of fatty acids in the carbon source is high, and it is preferable that the fatty acids are contained in an amount of 5% by weight or more based on the total amount of the carbon source, more preferably 30% by weight.
  • the content is preferably 50% by weight or more, more preferably 70% by weight or more.
  • composition is merely an example of a suitable carbon source, and the present invention is not limited to the above carbon source. Moreover, you may add another component to the said carbon source as needed.
  • the present invention by increasing the specific surface area of the carbon source, it becomes possible to suitably assimilate the carbon source having a melting point higher than the culture temperature and low solubility in water by the microorganism.
  • the method for increasing the specific surface area of the carbon source is not particularly limited, but is a method for increasing the specific surface area of the solidified carbon source or the ratio of the carbon source by adjusting the carbon source to an oil-in-water emulsion form.
  • the method of adding to a culture solution after enlarging a surface area is mentioned.
  • the specific surface area of the carbon source is adjusted to 20 cm 2 / g or more in order to suitably assimilate the carbon source having a melting point higher than the culture temperature and low solubility in water by the microorganism.
  • the specific surface area is preferably 300 cm 2 / g or more, more preferably 1000 cm 2 / g, particularly preferably 3000 cm 2 / g, most preferably 40,000 cm 2 / g or more.
  • the specific surface area of the carbon source is less than 20 cm 2 / g, the dispersibility of the carbon source in the medium is not good and may not be used well by microorganisms.
  • Specific surface area can be measured by the following method in the case of a solidified carbon source. After taking an image of the solidified carbon source dispersed in the medium using a microscope, the number of particles and the area of each particle were converted into data using image processing software, and the average equivalent circle diameter obtained from the average area of the obtained dispersed particles was used. Based on this, the specific surface area of the solidified carbon source is calculated.
  • the specific surface area can be measured by the following method.
  • the particle size distribution is measured using a laser diffraction / scattering particle size distribution measuring device, and the specific surface area of the carbon source is calculated based on the obtained average particle size.
  • the carbon source As a method of solidifying the carbon source, it may be solidified by lowering the temperature below the melting point of the carbon source, or by reacting oils and fats and fatty acids with an alkali metal salt to form a fatty acid metal salt. It may be solidified.
  • Examples of a method for increasing the specific surface area of the solidified carbon source include a method of cutting the solidified carbon source with a blade or the like so as to obtain a desired specific surface area while passing through fine holes. Moreover, the method of dripping the solidified carbon source to the culture medium of the temperature below melting
  • the carbon source may be added to the culture tank after performing the treatment in advance, or the treatment may be performed in the culture tank.
  • the method of increasing the specific surface area by dripping a melted carbon source into a medium having a melting point or lower it is efficient and preferable to perform the treatment directly in a culture tank.
  • a carbon source that has been adjusted in advance to an oil-in-water emulsion to increase the specific surface area can be used for culturing microorganisms.
  • the oil content in the oil-in-water emulsion prepared in advance is preferably 3% by weight to 70% by weight in consideration of the stability of the emulsion.
  • a medium is often added intermittently or continuously to a culture tank during the culture period. At that time, if the carbon source concentration in the medium added additionally is low, the amount of the culture solution may increase and the productivity may be impaired, so the oil content in the oil-in-water emulsion prepared in advance is more
  • the content is preferably 10% to 65% by weight, more preferably 20% to 60% by weight, and particularly preferably 40% to 60% by weight. Moreover, even if the oil content in the oil-in-water emulsion is 60% by weight or more, it can be used very effectively as a carbon source.
  • the manufacturing method of an oil-in-water emulsion is not specifically limited, the conventionally well-known manufacturing method of an oil-in-water emulsion can be utilized.
  • a method using an agitator using a propeller or the like a method using an in-line mixer such as a static mixer, a method of emulsifying by combining a plurality of dispersers, a preliminary emulsification in advance, TK, an ultra mixer, and a CLEARMIX
  • a method using a homogenizer such as a colloid mill, a high-pressure homogenizer, a microfluidizer, an optimizer, a nanomizer, or an emulder can be used. Such a homogenization process may be performed twice or more.
  • An ultrasonic emulsifier can also be used.
  • the method of using an oil-in-water emulsion containing a carbon source having a higher melting point than the culture temperature and low solubility in water in the oil phase is not particularly limited, but an oil-in-water emulsion is prepared in advance. However, it may be added to the medium after being held in a tank or the like, or the water phase and the oil phase may be supplied from the separately prepared raw material tank to the same line, emulsified in-line, and then added to the medium. good.
  • an emulsifier can be used for the purpose of stabilizing the emulsification.
  • the emulsifier examples include glycerin fatty acid esters such as monoglyceride and diglyceride; acetic acid monoglyceride, lactic acid monoglyceride, citric acid monoglyceride, succinic acid monoglyceride, organic acid monoglyceride such as diacetyl monoglyceride; polyglycerin fatty acid ester, polyglycerin condensed ricinoleic acid ester , Sucrose fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, lecithin, fractionated lecithin, enzyme-treated lecithin, polysaccharides such as saponin, gum arabic and xanthan gum; proteins such as sodium caseinate, soy protein, and gluten partial degradation products Etc.
  • glycerin fatty acid esters such as monoglyceride and diglyceride
  • acetic acid monoglyceride lactic acid monoglyceride, cit
  • the emulsifier selected in the present invention is preferably one that can be assimilated by the microorganism used, and from the viewpoint that the carbon source is fats and oils and / or fatty acids, An emulsifier composed of the same glycerin or fatty acid as that of the fats and oils and / or fatty acids and capable of being assimilated by microorganisms is preferable, and monoglyceride, diglyceride, and lecithin are particularly preferable.
  • the carbon source contains monoglyceride and / or diglyceride derived from the carbon source.
  • Monoglyceride and / or diglyceride may be added separately to the carbon source.
  • Monoglyceride and / or diglyceride is preferably contained in a total amount of 0.1% by weight or more, more preferably 0.3% by weight or more, still more preferably 0.5% by weight, particularly preferably 0.7% by weight or more, based on the total amount of carbon source. Most preferably, it is 1% by weight or more.
  • an emulsifier such as monoglyceride, diglyceride, lecithin and the like may be added separately.
  • the lecithin in the present invention is a phospholipid and refers to lecithin, fractionated lecithin, enzyme-treated lecithin and the like.
  • the amount of lecithin added to the carbon source in the present invention is preferably 0.01 to 10% by weight in consideration of economy, more preferably 1% by weight or less, still more preferably 0.5% by weight or less, and particularly preferably 0.3% by weight for the upper limit. % Or less.
  • the present invention can constitute a method for producing a microbial metabolite by obtaining a microbial metabolite produced by a microorganism after culturing the microorganism by the microorganism culturing method of the present invention.
  • a microbial metabolite Preferably PHA is mentioned.
  • PHA is a thermoplastic polyester produced and stored as an energy storage substance in cells of many microbial species and has biodegradability.
  • non-petroleum-derived plastics are attracting attention due to the growing awareness of the environment.
  • PHA produced and accumulated by microorganisms in the fungus body has a negative impact on the ecosystem because it is incorporated into the natural carbon cycle process. Since it is expected to be small and its practical application is eagerly desired, it is a good example of a substance produced using the present invention.
  • the microorganism used for the production of the PHA of the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism that can assimilate the above-mentioned carbon source and can produce PHA.
  • the microorganisms that have been used can be preferably used.
  • the following microorganisms can also be applied to the culture method of the present invention.
  • the genus Capyrididas such as Capriavidus necator
  • the genus Algenigenes such as Alcaligenes latas
  • Pseudomonas putida Pseudomonas fluorescens P aeruginosa
  • Pseudomonas resinovorans Pseudomonas oleovorans
  • Bacillus genus Bacillus megaterium etc.
  • Aeromonas genus such as Aeromonas hydrophila, Ralstonia genus, Wautersia genus, Comamonas (Comamo) nas) genus (Microbiological Reviews, 54 (4), 450-472 (1990)).
  • biological cells that have been artificially modified to produce PHA by introducing a PHA synthase gene or the like using genetic engineering techniques can also be used.
  • biological cells belonging to the genus Capyrididas, Alkaligenes, Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter, Nocardia, Aeromonas, Ralstonia, Wautersia, Comamonas, etc. Escherichia ( Preferably, gram-negative bacteria such as Escherichia, Gram-positive bacteria such as Bacillus, yeasts such as Saccharomyces, Yarrowia, and Candida are used. Biological cells that have been artificially modified to produce PHA can be obtained.
  • PHBH production among PHA for example, a method using a microorganism that originally produces PHBH, such as Aeromonas caviae or Aeromonas hydrophila, or a PHA synthase gene using a genetic engineering technique for a microorganism that does not originally produce PHBH It is also possible to use biological cells that have been artificially modified to produce PHBH.
  • the host microorganism into which the gene is introduced for example, Cupriavidus necator can be preferably used.
  • the PHA synthase gene there can be used PHA synthase genes derived from Aeromonas via caviae, Aeromonas hydrophila, Chromobacterium sp.
  • a base sequence encoding PHA synthase in which an amino acid group is deleted, added, inserted, or substituted can be used.
  • the type of PHA is not particularly limited as long as it is a PHA produced by a microorganism, but is preferably a homopolymer of a component selected from 3-hydroxyalkanoic acids having 4 to 16 carbon atoms, or 4 to 16 carbon atoms.
  • a copolymer of two or more components selected from 3-hydroxyalkanoic acid is preferable.
  • poly-3-hydroxybutyrate (PHB) which is a homopolymer of 4-hydroxyalkanoic acid having 4 carbon atoms
  • poly (3-hydroxybutyrate-co-- which is a copolymer of 3-hydroxyalkanoic acids having 4 and 6 carbon atoms.
  • PHBH 3-hydroxyhexanoate
  • PHBV poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)
  • PHBV poly(2-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)
  • the medium composition, the method of adding the carbon source, the culture scale, the aeration and stirring conditions, the culture temperature, the culture time, etc. are not limited.
  • a culture method in which a carbon source is added to the medium continuously or intermittently is more preferable.
  • the medium to be used needs to be in a state where it can be stirred in the culture tank. As long as this condition is satisfied, a liquid medium, a medium that is separated into two phases, or a medium in a suspension state can be used in the present invention.
  • PHA may be accumulated in microorganisms by the culture method described above, and then PHA may be recovered from the cells using a well-known method. For example, it can be performed by the following method. After completion of the culture, the cells are separated from the culture solution with a centrifuge, and the cells are washed with distilled water, methanol, or the like and dried. PHA is extracted from the dried cells using an organic solvent such as chloroform. The bacterial cell component is removed from the solution containing PHA by filtration or the like, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate PHA. Furthermore, the supernatant is removed by filtration and centrifugation, and dried to recover PHA.
  • a well-known method for example, it can be performed by the following method. After completion of the culture, the cells are separated from the culture solution with a centrifuge, and the cells are washed with distilled water, methanol, or the like and dried. PHA is extracted from the dried
  • the melting point in the present invention refers to the rising melting point.
  • the rising melting point of the carbon source can be measured by the following method. (1) Place one end of a capillary tube with an inner diameter of 1 mm, an outer diameter of 2 mm or less, a length of 50 to 80 mm, and open at both ends on a completely thawed sample, view the sample to a height of 10 mm, and quickly solidify with ice pieces. (2) Leave at 10 ° C or lower for 24 hours or on ice for 1 hour before use in the test. (3) Set a capillary tube on the rising melting point measuring instrument (EX-871A manufactured by ELEX SCIENTIFIC).
  • the improvement of assimilation means that the consumption of the carbon source per hour increases, and as a result, the production of microbial cells and the production of substances produced by the microorganisms increase.
  • the carbon source in the present invention may be a mixture when added to the medium, or may be added separately and mixed in the medium.
  • the production amount of microbial cells can be measured by a known method such as an absorbance method or a dry cell weight measurement method, and the production amount of a substance produced by the microorganism can be measured by a known method such as a GC method or an HPLC method.
  • the content of PHA accumulated in the cells was determined according to the method of Kato et al. (Appl. MicroBiol. Biotechnol., 45, 363, (1996); Bull. Chem. Soc., 69, 515 (1996)). It can be measured by extracting from a cultured cell using an organic solvent such as chloroform and drying.
  • Example 2 Measurement of specific surface area of solidified carbon source An image of the solidified carbon source dispersed in the medium was taken using a digital microscope VHX (manufactured by Keyence Corporation), and then image processing software (Image-J (National American) The number of particles and the area of each particle were converted into data using the National Institutes of Health (NIH)), and the specific surface area of the solidified carbon source was calculated based on the equivalent circle average diameter obtained from the average area of the obtained dispersed particles.
  • VHX digital microscope
  • Image-J National American
  • Example 3 Measurement of specific surface area of emulsified carbon source Measurement of the specific surface area of a carbon source that had been pre-emulsified was performed using a laser diffraction / scattering particle size distribution analyzer LA-920 (manufactured by Horiba). Distribution measurement was performed, and the specific surface area was calculated based on the obtained average particle diameter.
  • Carbon source PFAD (Palm ⁇ ⁇ Fatty Acid Distillate, obtained from MALAYSIAN BIOTECHNOLOGY CORPORATION SDN BDH) and CPO (Crude Palm Oil, MALAYSIAN BIOTECHNOLOGY CORPORATION SDN BDH) diglyceride (DG, DG)
  • Table 1 shows the triglyceride (TG) content, free fatty acid (FFA) content and fatty acid composition.
  • the solubility of PFAD and CPO in water at 25 ° C. was both less than 0.1 g / L.
  • Table 2 shows the analysis results of the carbon sources produced in Production Examples 1 to 15.
  • the oil content in Tables 2 to 6 refers to the oil content (W / W (%)) in the emulsion.
  • Production Example 1 Production of Solidified PFAD PFAD heated to 70 ° C. was supplied dropwise to the medium used in Examples 1, 8, 19 and 29 using a line having an outlet diameter of 2 mm to produce solidified PFAD.
  • the specific surface area of PFAD in the medium was measured by the method described in Experimental Example 2, it was 22 cm 2 / g.
  • this preliminary emulsion was emulsified with a high-pressure homogenizer (PANDA2K type, manufactured by Niro Soabi) at a pressure of 10 barr to obtain an emulsion.
  • PANDA2K type manufactured by Niro Soabi
  • the specific surface area of the emulsified carbon source in the emulsion was measured by the method described in Experimental Example 3, and found to be 25000 cm 2 / g.
  • this preliminary emulsion was emulsified with a high-pressure homogenizer (PANDA2K type, manufactured by Niro Soabi) at a pressure of 10 barr to obtain an emulsion.
  • PANDA2K type manufactured by Niro Soabi
  • the specific surface area of the emulsified carbon source in the emulsion was measured by the method described in Experimental Example 3, it was 22000 cm 2 / g.
  • this preliminary emulsion was emulsified with a high-pressure homogenizer (PANDA2K type, manufactured by Niro Soabi) at a pressure of 10 barr to obtain an emulsion.
  • PANDA2K type manufactured by Niro Soabi
  • the specific surface area of the emulsified carbon source in the emulsion was measured by the method described in Experimental Example 3, it was 44000 cm 2 / g.
  • Example 1 Culture using E. coli Culture was examined using E. coli HB101 strain (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • LB medium (10 g / L Bacto-tryptone, 5 g / L Bacto-yeast extract, 5 g / L NaCl) was used.
  • M9 medium (6 g / L Na 2 HPO 4 , 3 g / L KH 2 PO 4 , 0.5 g / L NaCl, 1 g / L NH 4 Cl, 1 mM MgSO 4 , 0.001 w / v% Thiamine, 0.1 mM CaCl 2 ) was used.
  • a glycerol stock of E. coli HB101 strain was inoculated into the pre-culture medium and cultured at 37 ° C. for 12 hours, and pre-culture was performed.
  • the preculture solution was added to a 500 ml Sakaguchi flask containing 50 mL of M9 medium containing the solidified carbon source or emulsified carbon source of Production Example 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, or 14. Inoculated at v% and cultured with shaking at 37 ° C. for 96 hours.
  • the solidified carbon source was prepared by dropping directly into the M9 medium. Further, separately prepared emulsified carbon sources were added all at once into the Sakaguchi flask.
  • Culturing was performed at a carbon source concentration of 0.5 w / v%. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, washed with methanol, freeze-dried, and the dry cell weight was measured. The results are shown in Table 4.
  • the composition of the growth test medium is 1.1 w / v% Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.19 w / v% KH 2 PO 4 , 1.29 w / v% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1 w / v% MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.5v / v% trace metal salt solution (1.6w / v% FeCl 3 ⁇ 6H 2 O in 0.1N hydrochloric acid, 1w / v% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.02w / v% CoCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0.016 w / v% CuSO 4 .5H 2 O, 0.012 w / v% NiCl 2 .6H 2 O).
  • a glycerol stock of Cupriavidus necator PHB-4 was inoculated into the pre-culture medium and cultured for 12 hours for pre-culture.
  • the pre-culture liquid was added to a 500 ml Sakaguchi flask containing 50 ml of a growth test medium containing the solidified carbon source, emulsified carbon source or fatty acid mixture of any of Production Examples 1 to 11, 13, and 14. And inoculated with shaking at 30 ° C. for 24 hours.
  • the solidified carbon source was prepared by dropping directly into the growth test medium (described in Production Examples 1 and 2). Further, separately prepared emulsified carbon source and fatty acid mixture were added into the Sakaguchi flask.
  • the culture was performed at a carbon source concentration of 1.0 w / v%. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, washed with methanol, freeze-dried, and the dry cell weight was measured. The results are shown in Table 5.
  • Example 19 to 28, Reference Examples 4 to 5 PHA production using Candida maltosa AHU-71 pARR-149 / 171NSx2-phbB strain Solidified carbon source, emulsified carbon of any one of Production Examples 1 to 10, 13, and 14 The PHA was produced using the source or fatty acid composition as the carbon source.
  • Candida maltosa AHU-71 pARR-149 / 171NSx2-phbB strain was used.
  • PHA production medium includes M2 medium (12.75 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 1.56 g / L KH 2 PO 4 , 0.33 g / L K 2 HPO 4 ⁇ 3H 2 O, 0.08 g / L KCl, 0.5 g / L NaCl, 0.41 g / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.4 g / L Ca (NO3) 2 ⁇ 4H 2 O, 0.01 g / L FeCl 3 ⁇ 4H 2 O), 0.45 ml / L trace metal salt solution (1g / L FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 8g / L ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O, 6.4g / L MnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 0.8g / L CuSO 4 ⁇ 5
  • Candida ⁇ maltosa AHU-71 pARR-149 / 171NSx2-phbB strain glycerol stock was inoculated into a 500 ml Sakaguchi flask containing 50 ml of the previous medium. This was cultured at a culture temperature of 30 ° C. for 20 hours. Next, the culture solution was inoculated at 10 v / v% into a 2 L Sakaguchi flask containing 300 ml of PHA production medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 48 hours.
  • the solidified carbon source was prepared by dropping directly into the M9 medium. Further, separately prepared emulsified carbon source and fatty acid mixture were added into the Sakaguchi flask. The culture was performed at a carbon source concentration of 2.0 w / v%. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, washed with methanol, lyophilized, and the weight of the obtained dry cells was measured.
  • the monomer composition analysis of the produced PHA was measured by gas chromatography as follows. To 20 mg of dry PHA, 2 ml of a sulfuric acid-methanol mixture (15:85) and 2 ml of chloroform were added and sealed, and heated at 100 ° C. for 140 minutes to obtain a methyl ester of a PHA decomposition product. After cooling, 1.5 g of sodium hydrogen carbonate was added little by little to neutralize, and the mixture was allowed to stand until the generation of carbon dioxide gas stopped. After adding 4 ml of diisopropyl ether and mixing well, the mixture was centrifuged, and the monomer unit composition of the PHA degradation product in the supernatant was analyzed by capillary gas chromatography.
  • the composition of the seed medium is 1 w / v% Meat-extract, 1 w / v% Bacto-tryptone, 0.2 w / v% Yeast extract, 0.9 w / v% Na 2 HPO 4 / 12H 2 O, 0.15 w / v% KH 2 PO 4 (pH 6.8).
  • the composition of the preculture medium is 1.1 w / v% Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.19 w / v% KH 2 PO 4 , 1.29 w / v% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1 w / v% MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 2.5w / v% Palm olein oil, 0.5v / v% trace metal salt solution (1.6w / v% FeCl 3 ⁇ 6H 2 O in 0.1N hydrochloric acid, 1w / v% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O 0.02 w / v% CoCl 2 .6H 2 O, 0.016 w / v% CuSO 4 .5H 2 O, 0.012 w / v% NiCl 2 .6H 2 O).
  • palm olein oil was added at a concentration of 10 g / L.
  • the composition of PHA production medium is 0.385 w / v% Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.067 w / v% KH 2 PO 4 , 0.291 w / v% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1 w / v% MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.5v / v% trace metal salt solution (1.6w / v% FeCl 3 ⁇ 6H 2 O in 0.1N hydrochloric acid, 1w / v% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.02w / v% CoCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0.016 w / v% CuSO 4 .5H 2 O, 0.012 w / v% NiCl 2 .6H 2 O).
  • a glycerol stock (50 ⁇ l) of KNK-005 strain was inoculated into a seed medium (10 ml) and cultured for 24 hours to perform seed culture.
  • the seed culture solution was inoculated at 1.0 v / v% into a 3 L jar fermenter (MDL-300, manufactured by Maruhishi Bioengine) containing 1.8 L of a preculture medium.
  • the operating conditions were a culture temperature of 28 ° C., a stirring speed of 500 rpm, an aeration rate of 1.8 L / min, and a culture was performed for 28 hours while controlling the pH between 6.7 and 6.8, followed by preculture.
  • a 14% aqueous ammonium hydroxide solution was used for pH control.
  • 5v jar fermenter (MDS-U50 type, manufactured by Maruhishi Bioengine) containing 2.5L of PHA production medium was inoculated with 5.0v / v% of the preculture.
  • the operating conditions were a culture temperature of 28 ° C., a stirring speed of 400 rpm, an aeration rate of 2.1 L / min, and a pH controlled between 6.7 and 6.8.
  • a 14% aqueous ammonium hydroxide solution was used for pH control.
  • the carbon source (Production Examples 1, 2, and 4-13) was added intermittently. Culturing was carried out for 64 hours. After completion of the cultivation, the cells were collected by centrifugation, washed with methanol, lyophilized, and the weight of the dried cells was measured.
  • Table 7 shows the dry cell weight and PHA production.

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Abstract

　培養温度よりも融点が高く、且つ２５℃での水への溶解度が低い炭素源を用いて、微生物の生産や微生物による微生物代謝産物の製造を、工業的に効率よく行う方法を提供する。培養温度よりも融点が高く、且つ２５℃での水への溶解度が10g/L以下の炭素源の比表面積を20cm2/g以上に調節する工程と、前記炭素源の存在下で微生物を培養する工程とを含む、微生物の培養方法。また、該培養方法により微生物を培養した後、当該微生物が産生した微生物代謝産物を取得する、微生物代謝産物の製造方法。

Description

微生物の培養方法、および微生物代謝産物の製造方法
　本発明は、微生物の生産、及び、微生物によるポリヒドロキシアルカノエート（以下、PHA）等の微生物代謝産物の生産を工業的に効率よく行う方法に関する。
　環境問題、食糧問題、健康・安全に対する意識の高まり、天然／自然志向の高まりなどを背景に、微生物の生産や微生物による物質製造（発酵生産、バイオ変換など）の意義・重要性が益々高まっている。
　微生物の生産や微生物による物質の製造においては、微生物によって好適に資化される炭素源（培養、発酵などのための炭素源）が必要である。その炭素源の代表的なものとして、糖質、油脂（例えば、動植物油脂）、脂肪酸（例えば、動植物由来の脂肪酸）などが挙げられる。
　しかしながら、培養温度よりも融点が高く、かつ、水への溶解度が極めて低い油脂や脂肪酸などの炭素源は培養液中で固化してしまうことから、微生物の資化性が低く、好適に利用することが出来なかった。例えば、高融点であるラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸などの脂肪酸の溶解度は、最も水への溶解度の高いラウリン酸でも0.1g/L以下であり、また、パルミチン酸、ステアリン酸などは1μM以下の濃度で凝集してしまう（非特許文献１）。これらの性質は、微生物による資化性を低下させてしまう原因である。培養温度よりも融点の高い炭素源を利用した例として、脂肪酸やその塩を利用したPHAの生産例が挙げられる。例えば、Aeromonas hydrophilaをラウリン酸を単独で炭素源として用いて培養し、PHAを生産した例（非特許文献２）が挙げられるが、乾燥菌体量は約8g/Lと好適に利用されているとは言えず、また、ラウリン酸は培養温度で固体であることが、培養の難易度を高めていると記載されている。
　また、Ralstonia eutropha（現在の分類でCupriavidus necator）をラウリン酸やミリスチン酸を単独で炭素源として用いて培養し、PHAを生産した例（特許文献１）が報告されているが、PHA生産性は1g/L以下と低く、炭素源として好適に利用しているとは言えない。
　さらに、Escherichia coliをラウリン酸ナトリウムなどの脂肪酸金属塩を単独で炭素源として用いて培養し、PHAを生産した例（非特許文献３）があるが、ラウリン酸ナトリウムの使用量は2g/L程度であった。
　また、Aeromonas caviaeのPHBH合成酵素遺伝子を導入したRalstonia eutropha（現在の分類でCupriavidus necator）を用い、低溶解度の油脂を用いたPHAの生産研究が行われている。該研究では、培養温度（30℃）よりも融点の高いパーム油を用いているが、乾燥菌体量は培養72時間で4.1g/Lと低く、好適に利用されているとは言えない（非特許文献４）。パーム油は融点36℃程度の固体油脂であり、パーム油やその構成成分である脂肪酸やその誘導体を微生物の炭素源として好適に利用する技術を開発することが望まれている。
　また、溶解度が低い炭素源を効率的に利用する技術として、サンフラワー油をセラミック製の膜を通しながら、培養液中に供すことで、溶解度の低い油を培地中で微分散させる方法が報告されている（非特許文献５）。該文献では、Pseudomonas属細菌を用いた、界面活性剤やPHAの製造例が記載されている。この技術は膜を使用するという特徴を有するため、培養温度で液体の炭素源に適用範囲が限られるといった課題があり、また、乳化状態ではないため、分散後に粒子が融合することで微分散状態が維持されないことが予想される。
　さらに、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸を乳化処理することによって、該脂肪酸からのＬ－スレオニン、Ｌ－リジンの発酵生産性を向上させた例も報告されている（特許文献２）。該技術では、培養温度よりも融点の高いラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸を用いた培養方法が記載されている。しかしながら、アミノ酸の生産性は改善するものの、生菌数が減る例があり、細胞中にPHAを蓄積させる本生産技術には不適であった。さらには、例えばパルミチン酸に対するオレイン酸の含有比が減少することにより、生産性の低下が引き起こされることが記載されていることから、適用範囲が限定される。
　さらに、パーム油に乳化剤としてアラビアガム（GA）を添加し、乳化することで、培養開始時のラグタイムを短縮する試みが報告されている（非特許文献６）。しかしながら、該研究におけるGAの効果は明確ではなく、また、脂肪酸系の乳化剤であるSDSや、TritonX-100は微生物の生育を阻害してしまうことが記載されている。また、該文献では、乳化した炭素源を用いることで微生物の生育速度が向上したとの記載はなく、さらに、GAを用いて乳化することは経済性の観点から工業生産への適用は困難であると記載されている。
　炭素源の融点を制御する培養技術としては、油脂や脂肪酸、またはそれらの混合物を原料に用いたPHAの効率的生産例が挙げられる（特許文献３）。該技術では複数の脂肪酸、油脂混合物を用いることで炭素源の融点を低下させる方法が記載されているが、炭素源の融点が培養温度よりも高い場合は、炭素源の融点と培養温度の温度差が大きいほど微生物による資化性低下が認められることから、使用可能な炭素源が限定的であった。上記のように、培養温度よりも融点が高く、且つ、水への溶解度の低い炭素源を好適に利用し、微生物の生産や微生物による物質の生産を工業的に効率よく行うには課題が残されていた。
米国特許出願公開第20020086377号明細書 特開2008-167746号公報 国際公開第2010/113497号
Henrik Vorum., et.al., .Biochmicaet Biophysica Acta, 1126: 135-142 (1992) Lee S., et.al., Biotechnol. Bioeng., 67:240-244 (2000) Regina V., et.al., FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, 111-117 (2000) T.Fukui., et.al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 49:333-336 (1998) Anuj Dhariwal, et.al., Bioprocess Biosyst. Eng., 31:401-409 (2008) Charles F.Budde, et.al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 89:1611-1619 (2011)
　本発明は、培養温度よりも融点が高く、且つ２５℃での水への溶解度の低い炭素源を利用して、微生物の生産や、微生物による微生物代謝産物の製造を、工業的に効率よく行う方法を提供することを課題とする。また、上記炭素源を用いて、工業的に効率よくPHA等の微生物代謝産物を製造する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、培養温度よりも融点が高く、且つ２５℃での水への溶解度の低い炭素源を利用し、微生物の生産や、微生物を用いた物質生産を工業的に効率よく行なうための検討を鋭意行なった。その結果、炭素源をある一定の比表面積以上に調整して培養に供することにより、培養温度よりも融点の高い炭素源を微生物が好適に資化できることを見出し、さらに該炭素源を利用して、微生物の生産や微生物によるPHA等の物質の生産を工業的に効率的に行なえることを発見し、本発明を完成させた。
　本発明の特徴の一つは、培養温度よりも融点が高く、且つ25℃での水への溶解度が10g/L以下の炭素源の比表面積を20cm2/g以上に調節する工程と、前記炭素源の存在下で微生物を培養する工程とを含むことを特徴とする、微生物の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記微生物は、ポリヒドロキシアルカノエート産生微生物であり、前記培養によって、ポリヒドロキシアルカノエートを産生することを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源の比表面積を20cm2/g以上に調節する工程が、前記炭素源を培地に添加する前に予め前記炭素源を乳化して前記炭素源の乳化物を形成することを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源の乳化物中における油分の含量が、10重量％～70重量％であることを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源が、乳化活性を有する炭素源であることを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源が、前記微生物によって資化可能な乳化剤を含むことを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源が、モノグリセライド及び／又はジグリセライドを、前記炭素源全量に対して合計で0.1重量％以上含むことを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源が、レシチンを0.01～10重量％含むことを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源の融点が、培養温度よりも２℃以上高いことを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源が、油脂類、脂肪酸類、又はそれらの混合物であることを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源が、パーム油に由来することを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、バクテリアであることを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、Cupriavidus属又はEsherichia属に属する微生物であることを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、Cupriavidus属に属する微生物であることを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、Cupriavidus necatorであることを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、Esherichia属に属する微生物であることを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、Esherichia coliであることを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、酵母であることを特徴とする上記の培養方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、上記のいずれかに記載の培養方法により微生物を培養した後、当該微生物が産生した微生物代謝産物を取得することを特徴とする微生物代謝産物の製造方法である。
　本発明の別の特徴の一つは、前記微生物代謝産物が、PHAであることを特徴とする上記の製造方法である。特にPHAとしては３－ヒドロキシ酪酸（以下、3HBと略す）のホモポリマーであるポリ－３－ヒドロキシ酪酸（以下、PHBと略す）、3HBと３－ヒドロキシヘキサン酸（以下、3HHと略す）の共重合体（以下、PHBHと略す）が挙げられる。
　また、本発明においては環境への負荷を考慮し、該炭素源が非石油由来であることが好ましい。例えば植物油としては高融点の脂肪酸をその構成単位とするパーム油、及びパーム油を構成する脂肪酸などが挙げられる。
　また、本発明に用いられる微生物は、古細菌、バクテリア、酵母、カビ、放線菌などが考えられる。
　また、本発明に用いる微生物としては該炭素源を資化する微生物であれば、特に限定されないが、Cupriavidus属、Escherichia属、または、Aeromonas属に属する微生物が好ましい。
　本発明によれば、２５℃での水への溶解度が低く、かつ、培養温度よりも融点の高い炭素源を利用し、微生物の生産や微生物によるＰＨＡ等の微生物代謝産物の生産を工業的に効率よく行うことが可能となる。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　微生物の生産や、微生物を用いた物質生産において、一般に、グルコースやシュークロースなどの糖質のように、水への溶解度が高い炭素源を用いる場合、通常の操作条件において炭素源は微生物の培養に用いる培養液等の液中に溶解しており、炭素源として利用しやすい。
　一方、再生可能資源である動植物由来の脂肪酸類や油脂類は、微生物の生産や、微生物によるPHA等の物質生産に有用な炭素源である。しかし、一般に、水への溶解度が低いために微生物培養の炭素源として利用し難く、特に培養温度より融点が高く、培養液中で固体の性状を示す炭素源は、微生物にとって好適に利用し難い。
　近年、常温で固体であるパーム油は、安定性が高く、価格競争力もあることから年々生産量が増加している。それに伴い、油脂の精製時に副産物として生成する脂肪酸類も年々増加している。こういった培養温度より融点が高く、かつ水への溶解性が低い油脂類または脂肪酸類を微生物の炭素源として利用することが望まれているが、融点が高いために培地中で固化してしまい培養槽内での分散性が悪くなり、微生物が有効に利用することは極めて困難であった。
　しかしながら、本発明を用いることにより、これら炭素源を極めて有効に利用できる。特に25℃での水への溶解度が10g/L以下の炭素源を好適に利用できる。また、25℃での水への溶解度が1 g/L以下の炭素源であっても好適に利用できる。更に、25℃での水への溶解度が0.1g/L以下の炭素源であっても好適に利用できる。
　本発明における炭素源は、培養に供される際に比表面積が大きくなるように調整して添加することにより、培地中での分散性が良好になり微生物によって好適に資化される。また、本発明では、水中油型乳化物の形態で炭素源の比表面積が大きくなるように事前に調整することがより好ましく、こういった処理によって、比表面積が20cm2/g以上に制御された炭素源を用いることができる。
　本発明における「乳化」とは、互いに溶け合わない２つ以上の物質を攪拌するなどして一方を他方の中へ分散させた状態を指す。例えば、水と油脂、水と脂肪酸、水と油脂と脂肪酸の混合物などが物質として挙げられる。また、本発明による乳化とは、２つ以上の物質が同相である必要は無く、例えば連続相が液体、分散相が固体などの状態においても乳化と定義する。
　本発明で用いられる炭素源としては、微生物の培養温度よりも融点が高く、通常では微生物が利用しにくい形態のものであれば特に限定されず、融点が培養温度よりも2℃以上高い炭素源は一般的には培地への分散性が悪いため本発明による分散性向上効果が高い。より好ましくは融点が培養温度より5℃以上高い炭素源、さらに好ましくは融点が培養温度より10℃以上高い炭素源は、一般的な方法では炭素源の培地での分散性が悪いためより効果的である。例えば融点が32℃以上の炭素源を好適に利用できる。また、融点が35℃以上の炭素源を好適に利用できる。さらには、融点が36℃以上、39℃以上、40℃以上、42℃以上、または44℃以上の炭素源を好適に利用できる。
　また、本発明における炭素源とは、使用する微生物の種類や、微生物によって製造するPHA等の代謝産物の種類、培養の諸条件（培地成分、pＨ、培養温度など）によって異なり、必ずしも一律に規定できないが、微生物が資化可能であり、水への溶解度が極めて低く、かつ融点が培養温度よりも高い炭素源であれば、本発明の効果を発揮可能である。
　また、培養温度よりも融点が高く、且つ25℃での水への溶解度が10g/L以下の炭素源としては、好ましくは油脂類、脂肪酸類、又はそれらの混合物が挙げられる。本発明の炭素源と、培養温度よりも融点が低い炭素源や、25℃での水への溶解度が10g/Lを超える炭素源とを併用することもできる。
　油脂類としては、トリグリセライド、ジグリセライド、モノグリセライド等の脂肪酸グリセリンエステル等が挙げられ、これらが単独又は混合物であっても良い。用いる微生物が代謝経路を持つ油脂類であれば本発明で好適に用い得る。
　脂肪酸類としては、遊離脂肪酸の他に、脂肪酸塩、脂肪酸エステル等が挙げられ、これらが単独又は混合物であっても良い。用いる微生物が代謝経路を持つ脂肪酸類であれば本発明で好適に用い得ることが可能である。微生物が利用する際に加水分解する必要が無いことから、微生物が利用しやすい形態としては油脂類より脂肪酸類の方がより好ましい。
　また、油脂類、脂肪酸類、又はそれらの混合物は、本発明においては環境への負荷を考慮し、非石油由来であることが好ましく、動植物油類または動植物油由来の脂肪酸類であることがより好ましい。さらに好ましくは、食料問題への影響を考慮し、非可食用途の油脂類または脂肪酸類を用いることがより望ましい。
　動植物油類の例としては、牛脂、豚脂、乳脂、魚油、大豆油、菜種油、ひまわり油、オリーブ油、ゴマ油、キャノーラ油、綿実油、米油、サフラワー油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、シア脂、サル脂、イリッペ脂、カカオ脂、ヤトロファ油、これらの油脂の分別油、硬化油、エステル交換油が挙げられる。動植物油由来の脂肪酸類の例としては、上述した動植物油類の構成成分である脂肪酸、脂肪酸塩、脂肪酸エステルなどが挙げられる。これらは単独又は２種類以上の組み合わせで用いることが出来る。
　また、上記油脂を精製処理する過程で副産物として生成する成分を利用することは、食糧との競合を避ける上で好ましい。
　精製処理における副産物としては、アルカリ脱酸工程で生成する脂肪酸塩類、蒸留脱酸工程で生成する蒸留残渣、脱臭工程で生成する蒸留残渣などが挙げられる。
　脂肪酸塩類としては脂肪酸ナトリウムや脂肪酸カリウム、脂肪酸カルシウム、脂肪酸マグネシウム等が挙げられる。
　蒸留残渣としては、主成分である脂肪酸の他に、モノグリセライド、ジグリセライド等を含んでも良い。
　更に、微生物が利用しやすいため、炭素源中の脂肪酸類の割合が高いことが好ましく、脂肪酸類が炭素源全量に対して5重量％以上含まれていることが好ましく、より好ましくは30重量％以上、更に好ましくは50重量％以上、特に好ましくは70重量％以上含まれていることが好ましい。
　しかしながら、上記組成はあくまで好適な炭素源の例であり、本発明は上記炭素源に限定されない。また、上記炭素源には必要に応じて他の成分を加えても良い。
　本発明において、炭素源の比表面積を大きくすることにより、培養温度よりも融点が高く、かつ水への溶解性が低い炭素源を微生物によって好適に資化させることが可能になる。
　炭素源の比表面積を大きくする方法としては、特に限定はしないが、固化させた炭素源の比表面積を大きくする方法や、炭素源を水中油型乳化物の形態に調整して炭素源の比表面積を大きくした後に培養液に添加する方法が挙げられる。
　本発明によれば、培養温度よりも融点が高く、かつ水への溶解性が低い炭素源を微生物によって好適に資化させるために、炭素源の比表面積を20cm2/g以上に調節する。当該比表面積は、好ましくは300cm2/g以上、更に好ましくは1000cm2/g、特に好ましくは3000cm2/g、最も好ましくは40000cm2/g以上である。炭素源の比表面積が20cm2/g未満の場合、炭素源の培地中における分散性が良好でなく、微生物によって良好に利用されないことがある。比表面積の大きさは大きいほど培地中における炭素源の分散性が良好になり、微生物によって好適に資化されるため、比表面積の大きさに特に上限は無いが、比表面積の大きい水中油型乳化物又は固化させた炭素源を製造する際の経済性を加味して最適な比表面積を選択することがより好ましい。
　比表面積は、固化した炭素源の場合、次の手法により測定できる。培地に分散した固化炭素源の画像を顕微鏡を用いて撮影した後、画像処理ソフトを用いて粒子個数と各粒子面積をデータ化し、得られた分散粒子の平均面積から求めた円相当平均径に基づき、固化炭素源の比表面積を算出する。
　水中油型乳化物の形態にある炭素源の場合、比表面積は次の手法により測定できる。レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置を用いて粒径分布測定を行い、得られた平均粒子径を基に炭素源の比表面積を算出する。
　炭素源を固化させる方法としては、温度を炭素源の融点以下に下げることにより固化させても良いし、油脂類や脂肪酸類をアルカリ金属塩と反応させることにより、脂肪酸の金属塩を形成させて固化させても良い。
　固化させた炭素源の比表面積を大きくする方法としては、固化した炭素源を微細な孔を通過させながら、所望の比表面積になるように刃などでカットする方法等が挙げられる。また、融解させた炭素源を融点以下の温度の培地に滴下、固化させる方法も挙げられる。
　炭素源を固化させ比表面積を大きくする処理を行なう時期に関しては、予め当該処理を行なってから炭素源を培養槽に添加しても良いし、培養槽内で当該処理を行なっても良い。融点以下の培地に融解した炭素源を滴下して比表面積を大きくする方法では、直接培養槽内で処理を行なうのが効率的であり好ましい。
　本発明においては、予め水中油型乳化物の形態に調整して比表面積を高めた炭素源を微生物の培養に用いることができる。
　予め作製する水中油型乳化物中の油分の含量は、乳化物の安定性を考慮すると、3重量％～70重量％であることが好ましい。一方、商業的な微生物生産、ならびに微生物を用いた物質生産においては、しばしば、培養期間中に培地を間欠的、または連続的に培養槽に添加することが行なわれる。その際、追加で添加される培地中の炭素源濃度が低いと、培養液量が増加し生産性が損なわれる恐れがあるため、予め作製される水中油型乳化物中の油分含量は、より好ましくは10重量％～65重量％、更に好ましくは20重量％～60重量％、特に好ましくは40重量％～60重量％である。また、水中油型乳化物中の油分含量が60重量％以上であっても炭素源として極めて有効に利用可能である。
　水中油型乳化物の製造方法は、特に限定しないが、従来公知の水中油型乳化物の製造方法が利用できる。
　例えば、プロペラ等を用いた攪拌機や、スタティックミキサーのようなインラインミキサーを用いた方法や、複数の分散盤を組み合わせることで乳化する方法、予め予備乳化を行なった後、TK、ウルトラミキサー、クレアミックス、コロイドミル、高圧ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー、アルティマイザー、ナノマイザー、エマルダー等の均質化処理機を用いた方法等が利用できる。こういった均質化処理は２回以上行なってもよい。また、超音波乳化機を用いることもできる。
　培養温度よりも融点が高く、かつ水への溶解性が低い炭素源を油相部に含む水中油型乳化物を培養に利用する方法は、特に限定しないが、予め水中油型乳化物を作製し、タンク等に保持した後培地に添加しても良いし、別々に用意した原料タンクから水相と油相を同一のラインに供給し、インラインで乳化を行なった後に培地に添加しても良い。
　また、本発明の水中油型乳化物の製造には、乳化を安定化させる目的で乳化剤を用いることができる。
　乳化剤としては、例えば、モノグリセライドやジグリセライドのようなグリセリン脂肪酸エステル；酢酸モノグリセライド、乳酸モノグリセライド、クエン酸モノグリセライド、コハク酸モノグリセライド、ジアセチルモノグリセライドのような有機酸モノグリセライド；ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン縮合リシノール酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、レシチン、分別レシチン、酵素処理レシチン、サポニン、アラビアガムやキサンタンガムのような多糖類；カゼインナトリウムや大豆タンパク質、グルテン部分分解物のようなたんぱく質等が利用できる。しかし、微生物による資化が不可能な乳化剤は培養後に不純物として残存するため好ましくない。そのため、本発明にて選択される乳化剤は使用する微生物によって資化可能なものが好ましく、また、炭素源が油脂類、及び／又は、脂肪酸類であるという観点から、本発明における乳化剤としては、前記油脂類、及び／又は、脂肪酸類と同じグリセリンや脂肪酸から構成され、微生物によって資化可能な乳化剤が好ましく、モノグリセライド、ジグリセライド、レシチンが特に好ましい。炭素源を水中油型乳化物の形態で利用するにあたっては、炭素源に、炭素源由来のモノグリセライド及び／又はジグリセライドが含まれていることが有効である。モノグリセライド及び／又はジグリセライドは炭素源に別途添加してもよい。モノグリセライド及び／又はジグリセライドは、炭素源全量に対して合計で0.1重量％以上含まれていることが好ましく、より好ましくは0.3重量％以上、更に好ましくは0.5重量％、特に好ましくは0.7重量％以上、最も好ましくは1重量％以上である。また、モノグリセライド、ジグリセライド、レシチン等の乳化剤は別途添加しても構わない。
　本発明におけるレシチンとは、リン脂質のことであり、レシチン、分別レシチン、酵素処理レシチンなどを指す。
　本発明における炭素源に対するレシチンの添加量は経済性も考慮して、0.01～10重量％が好ましく、上限値についてより好ましくは1重量％以下、さらに好ましくは0.5重量％以下、特に好ましくは0.3重量％以下である。
　しかしながら、経済性なども考慮すると、乳化剤等の添加を行なわないことがより好ましく、乳化剤を添加せずとも乳化活性を有する炭素源を用いることが好ましい。
　本発明は、本発明の微生物の培養方法により微生物を培養した後、微生物が産生した微生物代謝産物を取得することで、微生物代謝産物の製造方法を構成することができる。微生物代謝産物としては特に限定されないが、好ましくはＰＨＡが挙げられる。
　ＰＨＡは、多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として産生・蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、環境への意識の高まりから非石油由来のプラスチックが注目されるなか、特に、微生物が菌体内に産生・蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響が小さいと予想されており、その実用化が切望されているため、本発明を用いて生産する物質の好例の一つである。
　本発明のPHAの製造に用いられる微生物としては、上述した炭素源を資化可能で、かつＰＨＡを生産可能な微生物であれば特に限定はないが、天然から単離された微生物や、遺伝子操作された微生物等を好適に使用できる。また、以下の微生物は、本発明の培養方法にも適用することができる。
　具体的には、カピリアビダス・ネケータ（Cupriavidus necator）等のカピリアビダス属、アルカリゲネス・ラタス（Alcaligenes latas）等のアルカリゲネス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonasfluorescens）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・レジノボランス（Pseudomonas resinovorans）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）等のシュードモナス属、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）等のバチルス属、アゾトバクター属、ノカルディア属、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）等のアエロモナス属、ラルストニア（Ralstonia）属、ワウテルシア（Wautersia）属、コマモナス（Comamonas）属などが挙げられる（Microbiological Reviews, 54(4), 450-472 (1990)）。
　これら微生物等の他にも、遺伝子工学的な手法を用いて、PHA合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にPHAを生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。例えば、上記カピリアビダス属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、バチルス属、アゾトバクター属、ノカルディア属、アエロモナス属、ラルストニア属、ワウテルシア（Wautersia）属、コマモナス（Comamonas）属などに属する微生物のほかにも、エシェリキア（Escherichia）属等のグラム陰性の細菌、バチルス（Bacillus）属等のグラム陽性の細菌、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ヤロウィア（Yarrowia）属、キャンディダ（Candida）属等の酵母類などを好適に用いて人為的にPHAを生産させる改変を施した生物細胞を得ることができる。
　PHAの中でもPHBHの生産に関しては、例えばAeromonas caviaeやAeromonas hydrophilaなど元来PHBHを生産する微生物を用いる方法や、元来PHBHを生産しない微生物に遺伝子工学的な手法を用いて、PHA合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にPHBHを生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。遺伝子を導入するホスト微生物としては、たとえばCupriavidus necatorを好適に用いることができる。また、PHA合成酵素遺伝子としてはAeromonas caviae、Aeromonas hydrophilaやChromobacterium sp.由来のPHA合成酵素遺伝子やそれらの改変体などを用いることができる。改変体としてはアミノ酸基が欠失、付加、挿入、若しくは置換されたPHA合成酵素をコードする塩基配列などを用いることができる。
　PHAの種類としては、微生物が生産するPHAであれば特に限定されないが、好ましくは、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される構成成分の単独重合体や、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上の構成成分の共重合体が良い。例えば炭素数４の３－ヒドロキアルカン酸のホモポリマーであるポリ３－ヒドロキシブチレート（PHB）、炭素数４と６の３－ヒドロキシアルカン酸のコポリマーであるポリ（３－ヒドロキシブチレート‐コ‐３－ヒドロキシヘキサノエート）（PHBH）、炭素数４と５の３－ヒドロキシアルカン酸のコポリマーであるポリ（３－ヒドロキシブチレート‐コ‐３－ヒドロキシバレレート）（PHBV）、炭素数４～１４の３－ヒドロキシアルカン酸の重合体などが挙げられる。
　培養方法としては、培地に炭素源を添加する方法を用いる微生物の培養方法であれば、培地組成、炭素源の添加方法、培養スケール、通気攪拌条件や培養温度、培養時間などは限定されないが、連続的、または、間欠的に培地に炭素源を添加する培養方法がより好ましい。ただし、使用する培地は培養槽にて攪拌できる状態である必要がある。この条件を満たす限り、液体培地であっても、２相に分離する培地であっても、懸濁液状態の培地であっても、本発明に用いることができる。
　本発明のPHAの製造方法は、上述した培養方法によって微生物内にPHAを蓄積させ、その後、周知の方法を用いて菌体からPHAを回収すれば良い。例えば、次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてPHAを抽出する。このPHAを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてPHAを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてPHAを回収する。
　本発明における融点とは、上昇融点のことを指す。
　本発明において、炭素源の上昇融点は以下の方法で測定する事が出来る。
（１）内径1mm、外形2mm以下、長さ50～80mm、両端が開いている毛細管の一端を完全に融解した試料につけて10mmの高さまで試料をみたし、速やかに氷片等で固化させる。
（２）10℃以下で24h、あるいは氷上で1h放置した後試験に供する。
（３）上昇融点測定器（ELEX SCIENTIFIC社製 EX-871A）に毛細管をセットする。
（４）予想される融点よりも約20℃低い温度の水を満たした容器に毛細管を浸し、温度計の下端を水面下30mmの深さに置く。
（５）容器内の水を適当な方法でかき混ぜながら、最初は2℃/minずつ水温が上昇するように加熱する。
（６）予想される融点の約10℃低い温度に達した後は0.5℃/minずつ水温が上昇するように加熱する。
（７）試料が毛細管中で上昇を始める温度を上昇融点とする。
　本発明において、資化性の向上とは、時間当たりの炭素源の消費量が増加し、その結果、微生物菌体の生産量や微生物が産生する物質の生産量が増加することを意味する。また、本発明における炭素源は、培地に添加する際にすでに混合物であって良いし、別々に添加して培地内で混合しても良い。
　微生物菌体の生産量は吸光度法や乾燥菌体重量測定法などの公知の方法で測定でき、また、微生物が産生する物質の生産量はGC法、HPLC法などの公知の方法で測定できる。細胞中に蓄積されたPHAの含量は、加藤らの方法（Appl.MicroBiol.Biotechnol.,45巻、363頁、（1996）；Bull.Chem.Soc.,69巻、515頁（1996））に従い、培養細胞からクロロホルムなどの有機溶媒を用いて抽出し、乾燥することで測定出来る。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
　（実験例１）炭素源中のジグリセライド、モノグリセライド含量の測定
　基準油脂分析試験法「2.4.6.1-1996　トリアシルグリセリン組成（ガスクロマトグラフ法）」に準じて行なった。
　（実験例２）固化炭素源の比表面積の測定
　培地に分散した固化炭素源の画像を、デジタルマイクロスコープVHX（キーエンス社製）を用いて撮影した後、画像処理ソフト（Image-J（アメリカ国立衛生研究所(NIH)製））を用いて粒子個数と各粒子面積をデータ化し、得られた分散粒子の平均面積から求めた円相当平均径に基づき、固化炭素源の比表面積を算出した。
　（実験例３）乳化炭素源の比表面積の測定
　予め乳化処理を行なった炭素源の比表面積の測定は、レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置　LA-920（堀場製作所製）を用いて粒径分布測定を行い、得られた平均粒子径を基に比表面積を算出した。
　実施例にて使用した炭素源PFAD（Palm Fatty Acid Distillate、MALAYSIAN BIOTECHNOLOGY CORPORATION SDN BDHより入手）、及びCPO（Crude Palm Oil、MALAYSIAN BIOTECHNOLOGY CORPORATION SDN BDHより入手）のジグリセライド（DG）、モノグリセライド（MG）、トリグリセライド（TG）含量、及び遊離脂肪酸（FFA）含量とその脂肪酸組成を表１に示した。なお、PFAD及びCPOの25℃での水への溶解度はいずれも0.1g/L未満であった。また、製造例１～１５で製造した炭素源の分析結果を表２に示した。なお表２～６中の油分とは、乳化物中の油分（W/W（％））を指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　　　　　　　　　　　　　　　　　 
　（製造例１）固化PFADの作製
　70℃に加熱したPFADを、出口直径2mmのラインを用いて実施例１、８、１９及び２９で使用する培地に滴下供給して固化PFADを作製した。培地中のPFADの比表面積を実験例２に記載の方法にて測定したところ、22cm2/gであった。
　（製造例２）固化PFADの作製
　70℃に加熱したPFADを、出口直径4mmのラインを用いて参考例１、２、４及び６で使用する培地に滴下供給して固化PFADを作製した。培養液中のPFADの比表面積を実験例２に記載の方法にて測定したところ、10cm2/gであった。
　（製造例３）CPOの乳化
　60℃に加熱したCPO及び水各50gを等量混合後、ケミスターラーを用いて攪拌数500rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ300cm2/gであった。
　（製造例４）PFADの乳化
　60℃に加熱したPFAD及び水各50gを等量混合後、ケミスターラーを用いて攪拌数500rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ300cm2/gであった。
　（製造例５）CPOの乳化
　60℃に加熱したCPO及び水各50gを等量混合後、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数1800rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3300cm2/gであった。
　（製造例６）PFADの乳化
　60℃に加熱したPFAD及び水各50gを等量混合し、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数1800rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3000cm2/gであった。
　（製造例７）CPOの乳化
　60℃に加熱したCPO10g及び水90gを混合し、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数1800rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3400cm2/gであった。
　（製造例８）PFADの乳化
　60℃に加熱したPFAD10g及び水90gを混合し、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数1800rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3300cm2/gであった。
　（製造例９）CPOの乳化
　60℃に加熱したCPO及び水各200gを混合し、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数2500rpmにて予備乳化を行った。予備乳化後の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3200cm2/gであった。
　さらに、この予備乳化液を高圧ホモジナイザー（PANDA2K型、ニロ・ソアビ社製）にて圧力10barrにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ25000cm2/gであった。
　（製造例１０）PFADの乳化
　60℃に加熱したPFAD及び水各200gを混合後、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数2500rpmにて予備乳化を行った。予備乳化後の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3200cm2/gであった。
　さらに、この予備乳化液を高圧ホモジナイザー（PANDA2K型、ニロ・ソアビ社製）にて圧力10barrにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ22000cm2/gであった。
　（製造例１１）CPOの乳化
　60℃に加熱したCPO2gと水98gとを混合後、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数1800rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3600cm2/gであった。
　（製造例１２）PFADの乳化
60℃に加熱したPFAD,280g及び水120gを混合後、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数2500rpmにて予備乳化を行った。予備乳化後の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ2300cm2/gであった。
　（製造例13）MG、DG、非存在化での乳化検討
　表３に記載の脂肪酸混合物50gを60℃に加熱したのち、水50gを混合し、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数1800rpmにて乳化操作を行った。しかしながら、乳化状態を保持しにくく、乳化物を得ることは出来なかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　（製造例14）乳化剤を用いたPFADの乳化
　乳化剤としてレシチン（Yelikin TS、ARCHER DANIELS MIDLAND社製）0.2重量％を混合したPFAD、及び水、各200gを混合後、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数2500rpmにて予備乳化を行った。予備乳化後の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ4000cm2/gであった。
　さらに、この予備乳化液を高圧ホモジナイザー（PANDA2K型、ニロ・ソアビ社製）にて圧力10barrにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ44000cm2/gであった。
　（製造例15）乳化剤を用いたPFADの乳化
　乳化剤としてレシチン（Yelikin TS、ARCHER DANIELS MIDLAND社製）0.2重量％を混合したPFAD、280g及び水、120gを混合後、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数2500rpmにて予備乳化を行った。予備乳化後の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ29
00cm2/gであった。
　（実施例１～７、参考例１）大腸菌を用いた培養
　E. coli HB101株（タカラバイオ社製）を用いた培養検討を行なった。前培地はLB培地（10g/L Bacto-tryptone、5g/L Bacto-yeast extract、5g/L NaCl）を用いた。生育試験にはM9培地（6g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl、1mM MgSO4、0.001w/v% Thiamine、0.1mM CaCl2）を用いた。E. coli HB101株のグリセロールストックを前培地に接種して37℃にて12時間培養し、前培養を行なった。次に前培養液を、製造例１、２、４、６、８、１０、１１、又は１４の固化炭素源又は乳化炭素源を含む50mLのM9培地を入れた500ml用の坂口フラスコに2v/v％で接種し、37℃で96時間振とう培養した。固化炭素源は上記M9培地に直接滴下し作製した。また、乳化炭素源は別途作製したものを坂口フラスコ内に一括添加した。培養は炭素源濃度0.5w/v％にて行った。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。結果を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　（実施例８～１８、参考例２～３）C. necator PHB-4株を用いた培養
　Cupriavidus necator PHB-4株（DSM541、DSMZより入手）を用いた培養検討を行なった。この株はPHAを合成しない株である。前培地組成は、1w/v% Meat-extract、1w/v% Bacto-tryptone、0.2w/v% Yeast extract、0.9 w/v% Na2HPO4・12H2O、0.15 w/v% KH2PO4、（pH6.8）とした。
　生育試験培地の組成は1.1w/v% Na2HPO4・12H2O、0.19 w/v% KH2PO4、1.29w/v% (NH4)2SO4、0.1w/v% MgSO4・7H2O、0.5v/v% 微量金属塩溶液（0.1N塩酸に1.6w/v% FeCl3・6H2O、1w/v% CaCl2・2H2O、0.02w/v% CoCl2・6H2O、0.016w/v%CuSO4・5H2O、0.012w/v%NiCl2・6H2Oを溶かしたもの）とした。
　Cupriavidus necator PHB-4株のグリセロールストックを前培地に接種して12時間培養し前培養を行なった。次に前培養液を製造例１～１１、１３、及び１４のいずれかの固化炭素源、乳化炭素源又は脂肪酸混合物を含む50mlの生育試験培地を入れた500ml用の坂口フラスコに2v/v％で接種し、30℃で24時間振とう培養した。固化炭素源は生育試験培地に直接滴下し作製した（製造例１、及び２に記載）。また、乳化炭素源および脂肪酸混合物は別途作製したものを坂口フラスコ内に一括添加した。培養は炭素源濃度1.0w/v％にて行った。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。結果を表５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　（実施例１９～２８、参考例４～５）Candida maltosaAHU-71 pARR-149/171NSx2　-phbB株を用いたPHA生産
　製造例１～１０、１３、及び１４のいずれかの固化炭素源、乳化炭素源又は脂肪酸組成物を炭素源に用いてPHAの生産を行なった。
　実験にはCandida maltosaAHU-71 pARR-149/171NSx2-phbB株（国際公開第2005/085415号参照）を用いた。
　前培地はYNB培地（0.67w/v% Yeast Nitrogen base without amino acid、2w/v% Glucose）を用いた。PHA生産培地にはM2培地（12.75g/L (NH4)2SO4、1.56g/L KH2PO4、0.33g/L K2HPO4・3H2O、0.08g/L KCl、0.5g/L NaCl、0.41g/L MgSO4・7H2O、0.4 g/L Ca(NO3)2・4H2O、0.01g/L FeCl3・4H2O）に、0.45ml/Lの微量金属塩溶液（0.1N塩酸に1g/L FeSO4・7H2O、8g/L ZnSO4・7H2O、6.4g/L MnSO4・4H2O、0.8g/L CuSO4・5H2Oを溶かしたもの）を添加した培地を用いた。
　Candida maltosa AHU-71 pARR-149/171NSx2-phbB株のグリセロールストックを50mlの前培地を入れた500ml用の坂口フラスコに500μl接種した。これを培養温度30℃で20時間培養した。次に培養液を300mlのPHA生産培地を入れた2L用の坂口フラスコに10v/v％で接種し、30℃で48時間振とう培養した。固化炭素源は上記M9培地に直接滴下し作製した。また、乳化炭素源および脂肪酸混合物は別途作製したものを坂口フラスコ内に一括添加した。培養は炭素源濃度2.0w/v％にて行った。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥し、得られた乾燥菌体重量を測定した。
　得られた乾燥菌体約1gに100mlのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のPHAを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約30mlになるまで濃縮し、その後、約90mlのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、1時間放置した。析出したPHAをろ別後、50℃で3時間真空乾燥した。乾燥PHAの重量を測定し、菌体内のポリマー含量を算出した。乾燥菌体重量、PHA生産量を表６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　生産されたPHAのモノマー組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥PHAの20mgに2mlの硫酸－メタノール混液（15:85）と2mlのクロロホルムを添加して密栓し、100℃で140分間加熱することでPHA分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに1.5gの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。4mlのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のPHA分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所GC-17Aを用い、キャピラリーカラムはGLサイエンス社製NEUTRA BOND-1（カラム長25m、カラム内径0.25mm、液膜厚０．４μm）を用いた。キャリアガスとしてHeを用い、カラム入口圧100kPaとし、サンプルは1μlを注入した。温度条件は、初発温度100～200℃まで8℃／分の速度で昇温、さらに200～290℃まで30℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、炭素数４及び６の３－ヒドロキシアルカン酸モノマーから構成されるPHA（PHBH）である事が確認された。
　（実施例２９～３７、参考例６～１０）KNK-005株を用いたＰＨＡ生産
　実験にはKNK-005株（米国特許7,384,766号明細書参照）を用いた。
　種母培地の組成は1w/v% Meat-extract、1w/v% Bacto-tryptone、0.2w/v% Yeast extract、0.9 w/v% Na2HPO4・12H2O、0.15 w/v% KH2PO4、（pH6.8）とした。
　前培養培地の組成は1.1w/v% Na2HPO4・12H2O、0.19 w/v% KH2PO4、1.29w/v% (NH4)2SO4、0.1w/v% MgSO4・7H2O、2.5w/v% パームオレインオイル、0.5v/v% 微量金属塩溶液（0.1N塩酸に1.6w/v% FeCl3・6H2O、1w/v% CaCl2・2H2O、0.02w/v% CoCl2・6H2O、0.016w/v%CuSO4・5H2O、0.012w/v%NiCl2・6H2Oを溶かしたもの）、とした。炭素源はパームオレインオイルを10g/Lの濃度で一括添加した。
　PHA生産培地の組成は0.385w/v% Na2HPO4・12H2O、0.067w/v% KH2PO4、0.291w/v% (NH4)2SO4、0.1w/v% MgSO4・7H2O、0.5v/v% 微量金属塩溶液（0.1N塩酸に1.6w/v% FeCl3・6H2O、1w/v% CaCl2・2H2O、0.02w/v% CoCl2・6H2O、0.016w/v%CuSO4・5H2O、0.012w/v%NiCl2・6H2Oを溶かしたもの）とした。
　まず、KNK-005株のグリセロールストック（50μl）を種母培地（10ml）に接種して24時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を1.8Lの前培養培地を入れた3Lジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製MDL-300型）に1.0v/v％接種した。運転条件は、培養温度28℃、攪拌速度500rpm、通気量1.8L/minとし、pHは6.7～6.8の間でコントロールしながら28時間培養し、前培養を行なった。pHコントロールには14％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
　次に、前培養液を2.5LのPHA生産培地を入れた5Lジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製MDS-U50型）に5.0v/v％接種した。運転条件は、培養温度28℃、攪拌速度400rpm、通気量2.1L/minとし、pHは6.7から6.8の間でコントロールした。pHコントロールには14％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源（製造例１、２、及び４～１３）は断続的に添加した。培養は64時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
　得られた乾燥菌体1gに100mlのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のPHAを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が30mlになるまで濃縮後、90mlのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、1時間放置した。析出したPHAをろ別後、50℃で3時間真空乾燥した。乾燥PHAの重量を測定し、菌体内のポリマー含量を算出した。
　乾燥菌体重量、PHA生産量を表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　生産されたPHAのモノマー組成分析は実施例１９～２８及び参考例４～５と同様の方法にて分析した。その結果、炭素数４及び６の３－ヒドロキシアルカン酸モノマーから構成されるPHA（PHBH）である事が確認された。
　以上の結果より、炭素源の比表面積が20cm2/g以上であれば、比較的良好な資化性が達成されることが明らかとなった。また、MG、DGが含まれていない場合は乳化物を形成できず、炭素源が比表面積20cm2/g以上を満足できないため、資化性が低下することが明らかとなった。また、乳化物中の油分含量（油脂、及び脂肪酸含量の合計）が少ないと、生産物量が低下することが明らかとなった。

Claims (21)

  1. 　培養温度よりも融点が高く、且つ25℃での水への溶解度が10g/L以下の炭素源の比表面積を20cm2/g以上に調節する工程と、
    　前記炭素源の存在下で微生物を培養する工程とを含むことを特徴とする、微生物の培養方法。
  2. 　前記微生物は、ポリヒドロキシアルカノエート産生微生物であり、前記培養によって、ポリヒドロキシアルカノエートを産生することを特徴とする請求項１に記載の微生物の培養方法。
  3. 　前記炭素源の比表面積を20cm2/g以上に調節する工程が、前記炭素源を培地に添加する前に予め前記炭素源を乳化して前記炭素源の乳化物を形成する工程であることを特徴とする請求項１又は２に記載の培養方法。
  4. 　前記炭素源の乳化物中における油分の含量が、10重量％～70重量％であることを特徴とする請求項３に記載の培養方法。
  5. 　前記炭素源が、乳化活性を有する炭素源であることを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の培養方法。
  6. 　前記炭素源が、前記微生物によって資化可能な乳化剤を含むことを特徴とする請求項５に記載の培養方法。
  7. 　前記炭素源が、モノグリセライド及び／又はジグリセライドを、前記炭素源全量に対して合計で0.1重量％以上含むことを特徴とする請求項１～６のいずれか一項に記載の培養方法。
  8. 　前記炭素源が、レシチンを0.01～10重量％含むことを特徴とする請求項５～７のいずれか一項に記載の培養方法。
  9. 　前記炭素源の融点が、培養温度よりも２℃以上高いことを特徴とする請求項１～８のいずれか一項に記載の培養方法。
  10. 　前記炭素源が、油脂類、脂肪酸類、又はそれらの混合物であることを特徴とする請求項１～９のいずれか一項に記載の培養方法。
  11. 　前記炭素源が、パーム油に由来することを特徴とする請求項１０に記載の培養方法。
  12. 　前記微生物が、バクテリアであることを特徴とする請求項１～１１のいずれか一項に記載の培養方法。
  13. 　前記微生物が、Cupriavidus属又はEsherichia属に属する微生物であることを特徴とする請求項１２に記載の培養方法。
  14. 　前記微生物が、Cupriavidus属に属する微生物であることを特徴とする請求項１３に記載の培養方法。
  15. 　前記微生物が、Cupriavidus necatorであることを特徴とする請求項１４に記載の培養方法。
  16. 　前記微生物が、Esherichia属に属する微生物であることを特徴とする請求項１３に記載の培養方法。
  17. 　前記微生物が、Esherichia coliであることを特徴とする請求項１６に記載の培養方法。
  18. 　前記微生物が、酵母であることを特徴とする請求項１～１１のいずれか一項に記載の培養方法。
  19. 　請求項１～１８のいずれか一項に記載の培養方法により微生物を培養した後、当該微生物が産生した微生物代謝産物を取得することを特徴とする微生物代謝産物の製造方法。
  20. 　前記微生物代謝産物が、ポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする請求項１９に記載の製造方法。
  21. 　前記ポリヒドロキシアルカノエートが、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸の共重合体であることを特徴とする請求項２０に記載の製造方法。
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