WO2022080282A1 - ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法 - Google Patents

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WO2022080282A1
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fat
weight
fats
pha
poly
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PCT/JP2021/037464
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憲 原田
俊輔 佐藤
Original Assignee
株式会社カネカ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing poly (3-hydroxy alkanoate) by culturing a poly (3-hydroxy alkanoate) -producing microorganism.
  • Poly (3-hydroxyalkanoate) (hereinafter sometimes referred to as PHA) is a biopolyester stored in cells by microorganisms. Since it is used as a plastic material and has biodegradability after use, it has been attracting attention in recent years as a material having a low environmental load.
  • a method of culturing a microorganism capable of producing PHA and accumulating PHA in the microorganism is performed.
  • a carbon source suitably assimilated by the microorganism.
  • the carbon source include sugars, fats and oils, and free fatty acids.
  • Patent Document 1 describes that palm oil is used as a carbon source to culture a microorganism having a PHA-producing ability.
  • PHA can be efficiently produced by culturing PHA-producing microorganisms using palm oil as a carbon source.
  • palm oil is a relatively expensive fat and oil, it is required to produce PHA by using easily available fat and oil other than palm oil as a carbon source.
  • the fats and oils whose production rate of PHA is slowed down are generally fats and oils having a relatively high content ratio of unsaturated fatty acids in the constituent fatty acids of the fats and oils.
  • Such fats and oils having a relatively high content of unsaturated fatty acids are widely used in food applications such as rapeseed oil, and a large amount of edible oil after use is discarded. From the viewpoint of effective utilization of such cooking oil, it is desired to use fats and oils having a relatively high content of unsaturated fatty acids as a carbon source in PHA production.
  • the present inventors utilize both fats and oils A having a relatively low content of unsaturated fatty acids such as palm oil and fats and oils B having a relatively high content of unsaturated fatty acids such as rapeseed oil as carbon sources for PHA-producing microorganisms.
  • unsaturated fatty acids such as palm oil
  • fats and oils B having a relatively high content of unsaturated fatty acids such as rapeseed oil
  • oil A in the initial stage of cultivation, it is possible to achieve a high level of PHA production rate comparable to that of oil A alone, even though oil B is used.
  • the present invention has been reached.
  • the present invention is a method for producing poly (3-hydroxyalkanoate) by culturing a poly (3-hydroxyalkanoate) -producing microorganism in the presence of a carbon source, and in the above culture, the fat A as a carbon source.
  • the present invention relates to a production method in which the fat and oil B is used, and the amount of the fat and oil B used is 10% by weight or more with respect to the total amount of the fat and oil A and the fat and oil B used in the entire culture.
  • Fats and oils A Refers to the total amount of fats and oils used until the amount of poly (3-hydroxyalkanoate) accumulated in the poly (3-hydroxyalkanoate) -producing microorganism reaches 16% by weight, and is a constituent fatty acid in the whole fats and oils A.
  • the average content of certain unsaturated fatty acids is 25% by weight or more and less than 75% by weight.
  • Fat B The content ratio of unsaturated fatty acid, which is a constituent fatty acid in fat B, is higher than the average content ratio of unsaturated fatty acid in the whole fat A.
  • the carbon source used after a certain point in time when the amount of poly (3-hydroxy alkanoate) accumulated in the poly (3-hydroxy alkanoate) -producing microorganism exceeds 16% by weight and is less than 85% by weight is fat B.
  • the fat and oil B is a fat and oil having an unsaturated fatty acid content of 60% by weight or more and 98% by weight or less.
  • the amount of fat B used is 40% by weight or more with respect to the total amount of fat A and fat B used in the entire culture.
  • the culture of the poly (3-hydroxy alkanoate) -producing microorganism is carried out until the amount of poly (3-hydroxy alkanoate) accumulated in the poly (3-hydroxy alkanoate) -producing microorganism reaches 80% by weight or more. do.
  • the culture medium containing the poly (3-hydroxyalkanoate) -producing microorganism is cultured while continuously adding the fat A and / or the fat B.
  • the culture medium containing the poly (3-hydroxyalkanoate) -producing microorganism is continuously added with the fat and oil A, and then the culture is continued with the continuous addition of the fat and oil B.
  • the poly (3-hydroxyalkanoate) comprises at least 3-hydroxybutyrate units.
  • the poly (3-hydroxyalkanoate) comprises a homopolymer of 3-hydroxybutyrate units or a copolymer of 3-hydroxybutyrate units and other hydroxyalkanoate units. More preferably, the other hydroxyalkanoate unit is a 3-hydroxyhexanoate unit.
  • the poly (3-hydroxyalkanoate) producing microorganism is a bacterium. More preferably, the poly (3-hydroxyalkanoate) -producing microorganism is a bacterium belonging to the genus Cupriavidus.
  • a high PHA production rate can be achieved while using fats and oils having a relatively high content of unsaturated fatty acids as a carbon source.
  • the present embodiment relates to a method for producing PHA by culturing a PHA-producing microorganism in the presence of a carbon source.
  • the PHA in the present disclosure is not particularly limited as long as it is a poly (3-hydroxyalkanoate) that can be produced by a microorganism, but the single weight of one monomer selected from 3-hydroxyalkanoates having 4 to 16 carbon atoms.
  • Combined polymer of at least one monomer selected from 3-hydroxyalkanoic acid having 4 to 16 carbon atoms and other hydroxyalkanoic acid (eg, 4-hydroxyalkanoic acid having 4 to 16 carbon atoms, lactic acid, etc.) eg, 4-hydroxyalkanoic acid having 4 to 16 carbon atoms, lactic acid, etc.
  • a polymer of two or more monomers selected from 3-hydroxyalkanoic acid having 4 to 16 carbon atoms is preferable.
  • P (3HB) which is a homopolymer of 3-hydroxybutyric acid (abbreviation: 3HB), and a copolymer P (3HB-co-3HV) (abbreviation) of 3HB and 3-hydroxyvaleric acid (abbreviation: 3HV).
  • PHBV a copolymer P of 3HB and 3-hydroxyhexanoic acid (abbreviation: 3HH) (abbreviation: PHBH) (abbreviation: PHBH), and a copolymer P of 3HB and 4-hydroxybutyric acid (abbreviation: 4HB).
  • 3HB-co-4HB and PHA containing lactic acid (abbreviation: LA) as a constituent component for example, a copolymer P of 3HB and LA (LA-co-3HB), and the like, but are not limited thereto.
  • PHA is preferably PHA containing at least 3-hydroxybutyrate units, a homopolymer of 3-hydroxybutyrate units, or 3-hydroxybutyrate units and other hydroxys.
  • Copolymers with alkanoate units are more preferred.
  • PHBV and PHBH are more preferable, and PHBH is particularly preferable.
  • the type of PHA produced can be appropriately selected depending on the type of PHA synthase gene possessed or separately introduced by the microorganism to be used, the type of metabolic gene involved in the synthesis, the culture conditions, and the like.
  • the PHA-producing microorganism is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of producing PHA, and may be a microorganism found in nature, or may be a mutant or a transformant.
  • Capiliavidas such as Cupriavidus necator, Pseudomonas putida, Pseudomonas putida, Pseudomonas pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa), Pseudomonas Rejinoboransu (Pseudomonas resinovorans), Pseudomonas oleovorans (Pseudomonas oleovorans
  • a modified biological cell that artificially produces PHA by introducing a PHA synthase gene or the like using a genetic engineering technique.
  • gram-negative bacteria such as Eshherichia
  • gram-positive bacteria such as Bacillus
  • yeasts such as Saccharomyces, Yarrowia, and Candida
  • Higher organism cells are also available.
  • Bacteria are preferred because they can accumulate large amounts of PHA, and bacteria belonging to the genus Capiliavidas are particularly preferred.
  • the PHA synthase gene introduced by transformation is not particularly limited, and examples thereof include Aeromonas hydrophila, Aeromonas SP 61-3, Cupriavidus necator-derived PHA synthase gene, and variants thereof.
  • the variant refers to a base sequence encoding a PHA synthase having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added, inserted, or substituted.
  • PHA By culturing PHA-producing microorganisms in the presence of a carbon source, PHA can be accumulated in the cells.
  • Oils and fats are used as the carbon source.
  • a carbon source other than fats and oils may be used in combination with fats and oils.
  • the fat and oil contains triglyceride, which is an ester compound of a constituent fatty acid and glycerin.
  • Constituent fatty acids can include unsaturated fatty acids with one or more carbon-carbon unsaturated bonds and / or saturated fatty acids without carbon-carbon unsaturated bonds.
  • animal fats and oils, vegetable fats and oils, mixed fats and oils thereof, transesterified oils, fractionated oils and the like can be used and are not particularly limited.
  • specific examples of vegetable oils and fats include rapeseed oil, sunflower oil, soybean oil, olive oil, corn oil, palm oil, palm kernel oil, cottonseed oil, sesame oil, nut oil, yatrofa oil, rice oil and the like.
  • Specific examples of animal fats and oils include lard and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
  • the constituent fatty acids of the fats and oils include short-chain fatty acids having 2 to 4 carbon atoms, medium-chain fatty acids having 5 to 12 carbon atoms, and long-chain fatty acids having 12 or more carbon atoms.
  • at least three constituent fatty acids selected from the group consisting of lauric acid, myristic acid, myristoleic acid, pentadecanoic acid, palmitic acid, margaric acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, erucic acid, and linolenic acid. Oils and fats containing are preferable.
  • fats and oils containing at least two constituent fatty acids selected from the group consisting of palmitoleic acid, heptadecanoic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, and erucic acid are particularly preferable.
  • fats and oils used as the carbon source two kinds of fats and oils having different content ratios of unsaturated fatty acids in the constituent fatty acids are used.
  • the two types of fats and oils are classified into fats and oils A and fats and oils B, and are defined as follows.
  • Fat A Refers to the total amount of fat used until the accumulated amount of poly (3-hydroxy alkanoate) in the poly (3-hydroxy alkanoate) -producing microorganism reaches 16% by weight, and is a constituent fatty acid in the whole fat A.
  • the average content of unsaturated fatty acids is 25% by weight or more and less than 75% by weight.
  • Fat B The content ratio of unsaturated fatty acid, which is a constituent fatty acid in fat B, is higher than the average content ratio of unsaturated fatty acid in the whole fat A.
  • the content ratio of unsaturated fatty acids is the ratio of the weight of unsaturated fatty acids to the total weight of fatty acids constituting fats and oils, and can be calculated by measuring the weight of the constituent fatty acids.
  • the measurement method is to saponify fats and oils with a strong alkali to make them free fatty acids, and then methyl-esterify the carboxyl groups of the fatty acids to increase their volatility. Can be identified.
  • Fat A refers to the total amount of fat used until the amount of poly (3-hydroxy alkanoate) accumulated in the poly (3-hydroxy alkanoate) -producing microorganism reaches 16% by weight, and is not present in the whole fat A.
  • the average content of saturated fatty acids is in the range of 25% by weight or more and less than 75% by weight.
  • the average content of the unsaturated fatty acid is preferably 30% by weight or more and 70% by weight or less, more preferably 40% by weight or more and 65% by weight or less, and 50% by weight or more and 60% by weight or less. Is even more preferable.
  • the average content of palmitic acid in the whole fat A is preferably 20% by weight or more and 65% by weight or less, more preferably 25% by weight or more and 60% by weight or less, and 30% by weight or more and 55% by weight. % Or less is more preferable.
  • the fat A may be composed of one available fat or oil, such as vegetable fat or oil, as long as the average content ratio of the unsaturated fatty acid is satisfied, or two or more kinds of fat or oil that can be obtained. It may be composed of. Examples of the fat and oil corresponding to the fat and oil A alone include palm oil and lard.
  • the fat A is composed of two or more kinds of fats and oils
  • the fats and oils A as a whole satisfy the above-mentioned average content ratio of unsaturated fatty acids.
  • the content ratio of unsaturated fatty acids in the individual fats and oils constituting the fats and oils A is not particularly limited, and may not be in the range of 25% by weight or more and less than 75% by weight.
  • the two or more kinds of fats and oils may be mixed and added to the medium, or they may be added to the medium simultaneously or sequentially without mixing. May be good.
  • culture of poly (3-hydroxy alkanoate) -producing microorganism means that poly (3-hydroxy alkanoate) is accumulated in a high concentration in the poly (3-hydroxy alkanoate) -producing microorganism. Refers to the final stage of "main culture” performed for the purpose. The "pre-culture” and “seed mother culture” performed before the “main culture” are not included in the "culture” in the present embodiment. Therefore, the carbon source used in the "preculture” and the "seed mother culture” is not included in the "fat A”.
  • Fat B is a carbon source used after a certain point in time when the amount of poly (3-hydroxy alkanoate) accumulated in a poly (3-hydroxy alkanoate) producing microorganism exceeds 16% by weight, and is not found in fat B. It means that the content ratio of saturated fatty acid is higher than the average content ratio of unsaturated fatty acid in the whole fat and oil A.
  • the difference between the content ratio of unsaturated fatty acids in fats and oils B (% by weight) and the average content ratio of unsaturated fatty acids in fats and oils A (% by weight) is not particularly limited, but the effect of using fats and oils A and fats and oils B in combination can be obtained. From the viewpoint of better achievement, it is preferably 5% by weight or more, more preferably 10% by weight or more, and further preferably 20% by weight or more.
  • the content ratio of unsaturated fatty acid in fat B is defined in relation to the average content ratio of unsaturated fatty acid in the entire specific fat A used in combination with this, and the specific value is not limited.
  • the specific value of the content ratio of the unsaturated fatty acid in the fat B is not particularly limited as long as it is higher than the average content ratio of the unsaturated fatty acid in the entire specific fat A used in combination therewith, and is 75% by weight or more. It may be in the range of 25% by weight or more and less than 75% by weight.
  • an oil / fat B having an unsaturated fatty acid content of 66% by weight can be used with respect to an oil / fat A having an unsaturated fatty acid content of 58% by weight.
  • the content of the unsaturated fatty acid in the fat B is preferably 60% by weight or more and 98% by weight or less, more preferably 65% by weight or more and 96% by weight or less, and 70% by weight or more. It is more preferably 95% by weight or less, and particularly preferably 75% by weight or more and 94% by weight or less.
  • the fat B may be composed of one kind of available fat such as vegetable fat. , It may be composed of two or more kinds of available fats and oils.
  • available fat such as vegetable fat.
  • rapeseed oil can be mentioned.
  • the oil / fat B may be discarded cooking oil or the like as long as the above requirements are satisfied.
  • the fat B which has a relatively high content of unsaturated fatty acids, slows down the PHA production rate when the PHA-producing microorganism is cultured by using this alone as a carbon source.
  • a good PHA production rate can be achieved by using the fat A and the fat B in combination under specific conditions. Therefore, the fat and oil B can be effectively used as a carbon source for PHA-producing microorganisms. From the viewpoint of effective use of fats and oils B, the larger the proportion of fats and oils B used, the more preferable.
  • the amount of fat / fat B used is 10% by weight or more, 40% by weight or more, and 60% by weight or more with respect to the total amount of fat / fat A and fat / fat B used in the entire culture. It may be 80% by weight or more.
  • the upper limit of the amount of fat and oil B used is not particularly limited, but is preferably 97% by weight or less, more preferably 95% by weight or less, and further preferably 90% by weight or less. Even if the fat and oil B is used in a high proportion as described above, it is possible to achieve a high PHA production rate equivalent to that when the fat and oil A is used alone.
  • the amount of fat A used with respect to the total amount of fat A and fat B used in the entire culture is not particularly limited, but is preferably 3% by weight or more from the viewpoint of achieving improvement in the PHA production rate. 5% by weight or more is more preferable, and 10% by weight or more is further preferable.
  • the upper limit of the amount of the fat and oil A used is 90% by weight or less, 60% by weight or less, 40% by weight or less, or 20% by weight or less.
  • fats and oils A having a relatively low content of unsaturated fatty acids as a carbon source at least until the amount of poly (3-hydroxyalkanoate) accumulated reaches 16% by weight.
  • fat B having a relatively high content of unsaturated fatty acid is used as a carbon source.
  • fat A in the initial stage of culturing and then using fat B, a high level of PHA production rate is achieved while using fat B, which slows down PHA production rate when used alone. can do.
  • the mechanism is unknown, but in the early stage of culture, the growth of PHA-producing microorganisms is prioritized over the accumulation of PHA, and in this cell growth stage, fat A, which has a relatively low content of unsaturated fatty acids, is the carbon source. However, when the growth progresses to some extent and the accumulation of PHA is prioritized, the influence of the type of carbon source is reduced, and it is presumed that the fat B is also effective as a carbon source.
  • the carbon source used after a certain point in time when the amount of PHA accumulated in the PHA-producing microorganism is more than 16% by weight and less than 85% by weight is preferably fat B.
  • the amount of PHA accumulated in the PHA-producing microorganism is preferably 20% by weight or more and 80% by weight or less, more preferably 25% by weight or more and 50% by weight or less, further preferably 25% by weight or more and 45% by weight or less, and more preferably 30% by weight or more. 40% by weight or less is particularly preferable.
  • the amount of PHA accumulated in the PHA-producing microorganism is the same as the weight of the dried cells obtained by recovering a certain amount from the culture solution, mixing it with an organic solvent to remove oils and fats, washing with water, and drying.
  • the weight of PHA recovered from the culture broth can be measured and calculated by the following formula.
  • PHA accumulated amount (%) [weight of PHA recovered from a certain amount of culture solution (g)] / [weight of dried cells obtained from a certain amount of culture solution (g)] ⁇ 100
  • the culture is initiated in the presence of fat A and during the culture (before the PHA accumulation in the PHA-producing microorganism reaches the final level) of the carbon source. It is preferable to change the type, continue the culture in the presence of fat and oil B, and end the culture when the amount of PHA accumulated in the PHA-producing microorganism reaches the final level.
  • the fat A is used as a carbon source in the initial stage of culturing
  • the fat B is used as a carbon source in the middle of the culture, so that the fat B whose PHA production rate becomes slow when used alone is used as a carbon source. Nevertheless, high levels of PHA production rate can be easily achieved.
  • the timing of changing the carbon source from the fat A to the fat B is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the amount of PHA accumulated in the PHA-producing microorganism and the ratio of the fat B used.
  • the amount of PHA accumulated in the PHA-producing microorganism may be more than 16% by weight and less than 85% by weight, preferably 20% by weight or more and 80% by weight or less, preferably 25% by weight or more and 50% by weight. % Or less is more preferable, 30% by weight or more and 45% by weight or less is further preferable, and 30% by weight or more and 40% by weight or less is particularly preferable.
  • the amount of PHA accumulated in the PHA-producing microorganism at the end of culturing is not particularly limited and may be appropriately determined, but is preferably 80% by weight or more, and more preferably 90% by weight or more.
  • the method of adding the fat A or the fat B to the medium containing the PHA-producing microorganism may be a batch addition or a continuous addition, but the continuous addition is preferable. That is, it is preferable to culture the PHA-producing microorganism while continuously adding the fat A and / or the fat B to the medium containing the PHA-producing microorganism.
  • the "continuous addition” includes not only a mode of continuous addition without interruption over time, but also a mode of intermittent addition with a temporary rest period.
  • the type of carbon source is changed and fat and oil B is continuously added. It is preferable to continue the culture while dispersing the cells.
  • the medium used for culturing the PHA-producing microorganism may be a liquid medium containing a nutrient source that contributes to the growth and growth of the microorganism.
  • a nutrient source that contributes to the growth and growth of the microorganism.
  • Examples of the nitrogen source include ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, as well as peptone, meat extract, yeast extract, and the like.
  • Examples of the inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride and the like.
  • Examples of other organic nutrient sources include amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine and proline, and vitamins such as vitamin B1, vitamin B12 and vitamin C.
  • a culture solution can be obtained by dispersing a medium containing such a nutrient source, a carbon source, and a PHA-producing microorganism in a container.
  • the culture conditions can follow the usual microbial culture method except for the carbon source described above and the method for adding the carbon source thereof, and the culture scale, aeration and stirring conditions, culture temperature, pH during culture, culture time and the like are not particularly limited.
  • PHA recovery After culturing for an appropriate time to accumulate PHA in the cells, PHA may be recovered from the cells using a well-known method.
  • the recovery method is not particularly limited, but can be carried out by, for example, the following method.
  • the cells are separated from the culture solution by a centrifuge or the like, and the cells are washed with distilled water, methanol or the like and dried.
  • PHA is extracted from the dried cells using an organic solvent such as chloroform.
  • the bacterial cell component is removed from the solution containing PHA by filtration or the like, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate PHA. Further, the supernatant can be removed by filtration or centrifugation and dried to recover PHA.
  • the cells are separated from the culture solution by a centrifuge or the like, and the cells are washed with distilled water, methanol, or the like. Subsequently, the washed sample is mixed with a solution of sodium lauryl sulfate (SDS), the cell membrane is destroyed by ultrasonic crushing, the bacterial cell component and PHA are separated by a centrifuge or the like, and PHA is recovered by drying the PHA. You can also do it.
  • SDS sodium lauryl sulfate
  • Table 1 shows the content ratio of fatty acids constituting each fat and oil, the total content ratio of saturated fatty acids, and the total content ratio of unsaturated fatty acids for the fats and oils 1 to 11 used in the following Examples, Comparative Examples, and Reference Examples. Shown in.
  • the fat 1 is palm oil
  • the fat 3 is rapeseed oil
  • the fat 10 is lard.
  • the amount of PHA accumulated (% by weight) is the weight of dried cells obtained by mixing a certain amount of culture solution with an organic solvent, washing with water and drying, and the weight of PHA recovered from the same amount of culture solution. It was measured and calculated by the following formula.
  • PHA accumulated amount (% by weight) [PHA weight (g) obtained in each Example, Comparative Example, or Reference Example] / [Dried cell weight (g) in each Example, Comparative Example, or Reference Example] ⁇ 100
  • the PHA productivity (%) is determined by the following formula with respect to the PHA weight (g) obtained from 1 liter of the culture solution in Reference Example 1 or Reference Example 5 in which PHA was produced using only fat and oil 1 in each Example. , The ratio of PHA weight (g) obtained from 1 liter of culture solution in Comparative Example or Reference Example. As the reference example, the reference example using the same PHA-producing microorganism is selected from Reference Example 1 or 5.
  • PHA productivity (%) [PHA weight (g) obtained in each Example, Comparative Example, or Reference Example] / [PHA weight (g) obtained in Reference Example 1 or Reference Example 5] ⁇ 100
  • Pre-culture First 20 ⁇ L of glycerol stock of KNK-005 strain was inoculated into 20 mL of pre-culture medium and cultured at 30 ° C. for 18 hours.
  • the preculture medium was 1w / v% Meat-extract, 1w / v% Bacto-Tryptone, 0.2w / v% Yeast-extract, 0.9w / v% Na 2 HPO 4.12H 2 O, 0. It was set to 15 w / v% KH 2 PO 4 , (pH 6.8).
  • the obtained preculture solution was inoculated at 1.0 v / v% into a 3 L jar fermenter (MDL-8C manufactured by Maruhishi Bioengine) containing 1.8 L of seed mother culture medium.
  • the operating conditions were a culture temperature of 30 ° C., a stirring speed of 500 rpm, an aeration rate of 1.8 L / min, and the cells were cultured for 24 hours while controlling the pH between 6.5 and 6.6, and the seed mother was cultured.
  • a 14% aqueous ammonium hydroxide solution was used for pH control.
  • the seed mother culture medium was 1.1 w / v% Na 2 HPO 4.12H 2 O, 0.19 w / v% KH 2 PO 4 , 1.29 w / v% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0. 1w / v% sulfonyl 4.7H 2 O, 2.5w / v% palm olein oil, 0.5v / v% trace metal salt solution (1.6w / v% FeCl 3.6H 2 O in 0.1N hydrochloric acid , 1w / v% CaCl 2.2H 2 O, 0.02w / v% CoCl 2.6H 2 O, 0.016w / v% CuSO 4.5H 2 O, 0.012w / v% NiCl 2.6H 2 O It was melted).
  • palm olein oil was added all at once at a concentration of 10 g / L.
  • the main culture was carried out for 48 hours, and after the completion of the culture, a certain amount of the culture solution was collected, washed with distilled water and methanol, vacuum dried, and the weight of dried cells was measured. After washing the cells in the same manner as described above, the cells were dissolved using SDS, PHA and the cells were separated by ultrasonic crushing, and only PHA was recovered to measure the accumulated amount of PHA. Based on this, PHA productivity was calculated and shown in Table 2.
  • the main culture medium was 0.385w / v% Na 2 HPO 4.12H 2 O, 0.067w / v% KH 2 PO 4 , 0.291w / v% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1w.
  • the fats and oils used in Comparative Examples 1 to 7 had a high content of unsaturated fatty acids in the fats and oils, and as a result of using these fats and oils alone as a carbon source, the PHA productivity was as low as less than 80%. I understand.
  • the fats and oils used in Reference Examples 1 to 4 have a low content of unsaturated fatty acids of less than 75% by weight, and as a result of using these fats and oils alone as a carbon source, the PHA productivity is as good as 80% or more. It turns out that it was.
  • Example 1 Except for the points described below, (1) preculture, (2) seed mother culture, and (3) main culture were sequentially carried out under the same conditions as in Comparative Examples 1 to 7 and Reference Examples 1 to 4.
  • the main culture first, the main culture was started while intermittently adding the first fat (fat 1) as a carbon source.
  • the carbon source was switched to the second fat (fat 2), and the main culture was continued while intermittently adding the second fat.
  • the culture was terminated when 48 hours had passed from the start of the main culture.
  • Table 3 shows the ratios of the first fat and the second fat in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values.
  • the total amount of the fat and oil 1 and the trace amount of the fat and oil 2 used until the accumulated amount of PHA reaches from 15% by weight to 16% by weight correspond to the fat and oil A.
  • the average content ratio of the unsaturated fatty acid in the fat A is about 58%.
  • the oil / fat 2 corresponds to the oil / fat B.
  • Example 2 In the main culture, (1) preculture, (2) seed mother culture, and (3) main culture were sequentially carried out under the same conditions as in Example 1 except that the fat 8 was used as the second fat.
  • Table 3 shows the ratios of the first fat and the second fat in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values.
  • the total amount of the fat and oil 1 and the trace amount of the fat and oil 8 used until the accumulated amount of PHA reaches from 15% by weight to 16% by weight correspond to the fat and oil A.
  • the average content ratio of the unsaturated fatty acid in the fat A is about 56%.
  • the oil / fat 8 corresponds to the oil / fat B.
  • Examples 3 to 4 In this culture, the first fats and oils and the second fats and oils shown in Table 3 are used, respectively, and the switching from the first fats and oils to the second fats and oils is performed when the amount of PHA accumulated in the microorganism reaches 20% by weight. Except for what was carried out, (1) preculture, (2) seed mother culture, and (3) main culture were carried out in sequence under the same conditions as in Example 1. Table 3 shows the ratios of the first fat and the second fat in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values. In the embodiment, the first fat (fat 1) corresponds to the fat A, and the second fat (fat 2) corresponds to the fat B. The same applies to the following Examples 5 to 9.
  • Example 5 In this culture, the first and second fats and oils shown in Table 3 were used, respectively, and the switching from the first fat and oil to the second fat and oil reached 30 to 34% by weight of PHA accumulated in the microorganism. Under the same conditions as in Example 1, (1) preculture, (2) seed mother culture, and (3) main culture were sequentially carried out except that they were carried out at the time point. Table 3 shows the ratios of the first fat and the second fat in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values.
  • Example 9 In the main culture, (1) preculture under the same conditions as in Example 1 except that the switching from the first fat and oil to the second fat and oil was carried out when the amount of PHA accumulated in the microorganism reached 79% by weight. , (2) seed mother culture, and (3) main culture were carried out in sequence. Table 3 shows the ratios of the first fat and the second fat in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values.
  • Example 3 The following can be seen from Table 3.
  • the main culture was started using the first fat and oil having an unsaturated fatty acid content of 25% by weight or more and less than 75% by weight as the carbon source, and the carbon source was used in the middle of the main culture.
  • the main culture was continued by switching to the second fat and oil having a higher content ratio of unsaturated fatty acids than the first fat and oil.
  • the PHA productivity was as good as 80% or more in each case.
  • the PHA productivity is extremely high at 90% or more, even though 80% by weight or more of the second fat and oil, which has low PHA productivity when used alone, is used.
  • Fats and oils having a relatively high content of unsaturated fatty acids contain unsaturated fatty acids, although the PHA productivity decreases when used alone as shown in Comparative Examples 1 to 7 and Reference Example 4 in Table 2. It can be seen that good PHA productivity can be achieved by sequentially using in combination with fats and oils having a proportion of 25% by weight or more and less than 75% by weight.
  • Example 8 Except for the points described below, (1) preculture, (2) seed mother culture, and (3) main culture were sequentially carried out under the same conditions as in Example 1.
  • the order of adding the fats and oils 1 and the fats and oils 2 in the main culture of Example 1 was reversed, and first, the main culture was started while intermittently adding the fats and oils 2 as a carbon source.
  • the carbon source When the amount of PHA accumulated in the microorganism reached 30% by weight, the carbon source was switched to fat and oil 1, and the main culture was continued while adding fat and oil 1 intermittently.
  • the culture was terminated when 48 hours had passed from the start of the main culture.
  • Table 4 shows the ratios of fats and oils 1 and fats and oils 2 in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values.
  • Comparative Example 9 In the main culture, under the same conditions as in Comparative Example 8, (1) preculture, (1) preculture, except that the switching from the fat 2 to the fat 1 was carried out when the amount of PHA accumulated in the microorganism reached 80% by weight. 2) seed mother culture and (3) main culture were carried out in sequence. Table 4 shows the ratios of fats and oils 1 and fats and oils 2 in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values.
  • the carbon source used at the initial stage of culture is not a fat or oil having a relatively high content of unsaturated fatty acids, but contains unsaturated fatty acids as in Examples 1 to 9. It can be seen that it is desirable that the ratio is 25% by weight or more and less than 75% by weight.
  • Example 10 Except for the points described below, (1) preculture, (2) seed mother culture, and (3) main culture were sequentially carried out under the same conditions as in Comparative Examples 10 to 12 and Reference Examples 5 to 7.
  • the main culture first, the main culture was started while intermittently adding the first fat (fat 1) as a carbon source.
  • the carbon source was switched to the second fat (fat 2), and the main culture was continued while intermittently adding the second fat.
  • the culture was terminated when 48 hours had passed from the start of the main culture.
  • Table 6 shows the ratios of the first fat and the second fat in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values.
  • Example 11 In the main culture, (1) preculture, (2) seed mother culture, and (3) main culture were sequentially carried out under the same conditions as in Example 10 except that the fat 8 was used as the second fat.
  • Table 6 shows the ratios of the first fat and the second fat in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values.
  • Example 12 to 13 In this culture, the first fats and oils and the second fats and oils shown in Table 6 are used, respectively, and the switching from the first fats and oils to the second fats and oils is performed when the amount of PHA accumulated in the microorganism reaches 20% by weight. Except for what was carried out, (1) preculture, (2) seed mother culture, and (3) main culture were carried out in sequence under the same conditions as in Example 10. Table 6 shows the ratios of the first fat and the second fat in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values.
  • Example 14 to 18 In this culture, the first and second fats and oils shown in Table 6 were used, respectively, and the switching from the first fat and oil to the second fat and oil reached 30 to 34% by weight of PHA accumulated in the microorganism. Under the same conditions as in Example 10, (1) preculture, (2) seed mother culture, and (3) main culture were sequentially carried out except that they were carried out at the time point. Table 6 shows the ratios of the first fat and the second fat in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values.
  • Example 19 In the main culture, (1) preculture under the same conditions as in Example 10 except that the switching from the first fat and oil to the second fat and oil was carried out when the amount of PHA accumulated in the microorganism reached 82% by weight. , (2) seed mother culture, and (3) main culture were carried out in sequence. Table 6 shows the ratios of the first fat and the second fat in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values.
  • Example 10 to 19 as in Examples 1 to 9, the main culture was started using the first fat and oil having an unsaturated fatty acid content of 25% by weight or more and less than 75% by weight as a carbon source.
  • the carbon source was switched to a secondary fat and oil having a relatively high content of unsaturated fatty acids, and the main culture was continued.
  • the PHA productivity was as good as 80% or more in each case.
  • the PHA productivity is extremely high at 90% or more, even though 80% by weight or more of the second fat and oil, which has low PHA productivity when used alone, is used.
  • Fats and oils having a relatively high content of unsaturated fatty acids contain unsaturated fatty acids, although the PHA productivity decreases when used alone as shown in Comparative Examples 10 to 12 and Reference Example 7 in Table 5. It can be seen that good PHA productivity can be achieved by sequentially using in combination with fats and oils having a proportion of 25% by weight or more and less than 75% by weight.
  • Example 13 Except for the points described below, (1) preculture, (2) seed mother culture, and (3) main culture were sequentially carried out under the same conditions as in Example 10.
  • the order of adding the fats and oils 1 and the fats and oils 2 in the main culture of Example 10 was reversed, and first, the main culture was started while intermittently adding the fats and oils 2 as a carbon source.
  • the carbon source When the amount of PHA accumulated in the microorganism reached 32% by weight, the carbon source was switched to fat and oil 1, and the main culture was continued while adding fat and oil 1 intermittently.
  • the culture was terminated when 48 hours had passed from the start of the main culture.
  • Table 7 shows the ratios of fats and oils 1 and fats and oils 2 in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values.
  • Comparative Example 14 In the main culture, under the same conditions as in Comparative Example 13, (1) preculture, (1) preculture, except that the switching from the fat 2 to the fat 1 was carried out when the amount of PHA accumulated in the microorganism reached 80% by weight. 2) seed mother culture and (3) main culture were carried out in sequence. Table 7 shows the ratios of fats and oils 1 and fats and oils 2 in the carbon source used in the main culture, and the calculated PHA productivity values.
  • the carbon source used at the initial stage of culture is not a fat or oil having a relatively high content of unsaturated fatty acids, but contains unsaturated fatty acids as in Examples 10 to 19. It can be seen that it is desirable that the ratio is 25% by weight or more and less than 75% by weight.

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Abstract

ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物の培養において、炭素源として油脂Ａ及び油脂Ｂを使用し、前記培養全体で油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ｂの使用量は１０重量％以上である。 油脂Ａ：前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまで使用する油脂の総体を指し、油脂Ａ全体において、構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の平均含有割合が２５重量％以上７５重量％未満である。 油脂Ｂ：油脂Ｂにおける構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の含有割合は、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の前記平均含有割合より高い。

Description

ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法
　本発明は、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を培養することによるポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法に関する。
　ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）（以下ではＰＨＡと称する場合がある）は微生物が菌体内に貯蔵するバイオポリエステルである。プラスチック材料として利用されており、使用後は生分解性を有するため、環境に与える負荷が低い材料として近年注目されている。
　ＰＨＡの製造には、ＰＨＡ産生能力を有する微生物を培養して当該微生物にＰＨＡを蓄積させる方法が行なわれている。その培養の際には、当該微生物によって好適に資化される炭素源を与えることが必要である。その炭素源の代表的なものとして、糖質、油脂、遊離脂肪酸などが挙げられる。
　例えば、特許文献１では、パーム油を炭素源として用いて、ＰＨＡ産生能力を有する微生物を培養することが記載されている。
特表２０１３－５１０５７２号公報
　パーム油を炭素源として用いてＰＨＡ産生微生物を培養すると、ＰＨＡを効率良く製造できることが知られている。しかしながら、パーム油は比較的高価な油脂であるため、パーム油以外の入手しやすい油脂を炭素源として用いてＰＨＡを製造することが求められている。
　そこで、各種油脂を炭素源として用いたＰＨＡ産生微生物の培養を試みたところ、パーム油と同程度のＰＨＡ生産速度を達成できる油脂と、パーム油よりも明らかにＰＨＡ生産速度が遅くなる油脂があることが判明した。そして、ＰＨＡの生産速度が遅くなる油脂は、概して、油脂の構成脂肪酸中の不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂であることが判明した。
　このような不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂は、例えば菜種油など、食品用途で広く使用されており、使用後の食用油は多量に廃棄されている。そのような食用油を有効利用する観点から、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂をＰＨＡ製造における炭素源として使用することが望まれる。
　本発明は、以上に鑑み、ＰＨＡ産生微生物を培養してＰＨＡを産生させるにあたって、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂を炭素源として使用しながら、高いＰＨＡ生産速度を達成することを目的とする。
　本発明者らは、ＰＨＡ産生微生物の炭素源として、パーム油など不飽和脂肪酸の含有割合が比較的低い油脂Ａと、菜種油など不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂Ｂの双方を利用し、かつ、培養の初期の段階では油脂Ａを使用することで、油脂Ｂを利用しているにも関わらず、油脂Ａの単独使用と同程度の高いレベルのＰＨＡ生産速度を達成できることを見出し、本発明に至った。
　すなわち本発明は、炭素源の存在下でポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を培養することによるポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法であって、前記培養において、炭素源として油脂Ａ及び油脂Ｂを使用し、前記培養全体で油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ｂの使用量は１０重量％以上である、製造方法に関する。
油脂Ａ：前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまで使用する油脂の総体を指し、油脂Ａ全体において、構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の平均含有割合が２５重量％以上７５重量％未満である。
油脂Ｂ：油脂Ｂにおける構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の含有割合は、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の前記平均含有割合より高い。
　好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％を超えて８５重量％未満のある時点以降に使用する炭素源は、油脂Ｂである。
　好ましくは、油脂Ｂは、不飽和脂肪酸の含有割合が６０重量％以上９８重量％以下の油脂である。
　好ましくは、前記培養全体で油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ｂの使用量は４０重量％以上である。
　好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物の培養を、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が８０重量％以上に達するまで実施する。
　好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を含む培地に、油脂Ａ及び／又は油脂Ｂを連続添加しながら培養を行う。
　好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を含む培地に、油脂Ａを連続添加しながら培養を行った後、油脂Ｂを連続添加しながら培養を継続する。
　好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）は、少なくとも３－ヒドロキシブチレート単位を含む。
　好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）は、３－ヒドロキシブチレート単位の単独重合体、又は、３－ヒドロキシブチレート単位と他のヒドロキシアルカノエート単位との共重合体を含む。より好ましくは、前記他のヒドロキシアルカノエート単位が、３－ヒドロキシヘキサノエート単位である。
　好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物が細菌である。より好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物がカプリアビダス属に属する細菌である。
　本発明によれば、ＰＨＡ産生微生物を培養してＰＨＡを産生させるにあたって、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂を炭素源として使用しながら、高いＰＨＡ生産速度を達成することができる。
　以下に、本発明の具体的な実施態様を詳細に説明するが、本発明はこれら実施態様に限定されるものではない。
　本実施形態は、炭素源の存在下でＰＨＡ産生微生物を培養することによるＰＨＡの製造方法に関する。
　本開示におけるＰＨＡとは、微生物が生産し得るポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）である限り特に限定されないが、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーの単独重合体、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される少なくとも１種のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸（例えば、炭素数４～１６の４－ヒドロキシアルカン酸、乳酸等）の共重合体、及び、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーの共重合体が好ましい。具体的には、３－ヒドロキシ酪酸（略称：３ＨＢ）のホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）、３ＨＢと３－ヒドロキシ吉草酸（略称：３ＨＶ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）（略称：ＰＨＢＶ）、３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（略称：３ＨＨ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）（略称：ＰＨＢＨ）、３ＨＢと４－ヒドロキシ酪酸（略称：４ＨＢ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）、並びに、乳酸（略称：ＬＡ）を構成成分として含むＰＨＡ、例えば３ＨＢとＬＡの共重合体Ｐ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　ＰＨＡは、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、少なくとも３－ヒドロキシブチレート単位を含むＰＨＡが好ましく、３－ヒドロキシブチレート単位の単独重合体、又は、３－ヒドロキシブチレート単位と他のヒドロキシアルカノエート単位との共重合体がより好ましい。前記共重合体のなかでも、ＰＨＢＶ、ＰＨＢＨがさらに好ましく、ＰＨＢＨが特に好ましい。
　なお、生産されるＰＨＡの種類は、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
　ＰＨＡ産生微生物は、ＰＨＡ産生能を有する微生物である限り特に限定されず、自然界で見出される微生物であってもよいし、突然変異体または形質転換体であってもよい。具体的には、カピリアビダス・ネケータ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）等のカピリアビダス属、アルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｌａｔａｓ）等のアルカリゲネス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・レジノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）等のシュードモナス属、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）等のバチルス属、アゾトバクター属、ノカルディア属、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｏ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）等のアエロモナス属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属などが挙げられる（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、４５０－４７２項、１９９０年）。遺伝子工学的な手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にＰＨＡを生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。例えばエシェリキア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属等のグラム陰性の細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等のグラム陽性の細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の酵母類、植物などの高等生物細胞も利用できる。多量のＰＨＡを蓄積可能であるため、細菌が好ましく、カピリアビダス属に属する細菌が特に好ましい。
　形質転換により導入されるＰＨＡ合成酵素遺伝子としては特に限定されず、アエロモナス・キヤビエ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｒｏｍｏｎａｓ　ＳＰ　６１－３、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子や、それらの改変体などが挙げられる。前記改変体とは、１以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、又は置換されたアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする塩基配列のことをいう。
　ＰＨＡ産生微生物を炭素源の存在下で培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積させることができる。前記炭素源として油脂を使用する。但し、油脂以外の炭素源を油脂と併用してもよい。
　前記油脂は、構成脂肪酸とグリセリンとのエステル化合物であるトリグリセリドを含む。構成脂肪酸は、１つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有する不飽和脂肪酸、及び／又は、炭素－炭素不飽和結合を持たない飽和脂肪酸を含み得る。前記油脂としては、動物性油脂、植物性油脂、それらの混合油脂、エステル交換油、分別油などを使用でき、特に限定されない。植物性油脂の具体例としては、菜種油、ひまわり油、大豆油、オリーブ油、コーン油、パーム油、パーム核油、綿実油、ゴマ油、ナッツ油、ヤトロファ油、米油などが挙げられる。動物性油脂の具体例としては、ラードなどが挙げられる。これらを単独で、又は、２種以上を混合して使用することができる。
　前記油脂の構成脂肪酸は、炭素数２～４の短鎖脂肪酸、炭素数５～１２の中鎖脂肪酸、炭素数１２以上の長鎖脂肪酸を含む。中でも、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、エルカ酸、及びリノレン酸からなる群より選択される少なくとも３種類の構成脂肪酸を含む油脂が好ましい。更には、パルミトレイン酸、ヘプタデカン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、及びエルカ酸からなる群より選択される少なくとも２種類の構成脂肪酸を含む油脂が特に好ましい。
　本実施形態では、炭素源として使用する油脂として、構成脂肪酸中の不飽和脂肪酸の含有割合が互いに異なる２種類の油脂を使用する。２種類の油脂を、油脂Ａと、油脂Ｂに分類し、それぞれ以下のように定義する。
油脂Ａ：ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまで使用する油脂の総体を指し、油脂Ａ全体において、構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の平均含有割合が２５重量％以上７５重量％未満である。
油脂Ｂ：油脂Ｂにおける構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の含有割合は、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の前記平均含有割合より高い。
　尚、不飽和脂肪酸の含有割合は、油脂を構成する脂肪酸の総重量に対して不飽和脂肪酸重量が占める割合であり、構成される脂肪酸重量を測定することで算出できる。測定方法は、油脂を強アルカリによりケン化し、遊離脂肪酸とした後、揮発性を高めるために脂肪酸のカルボキシル基をメチルエステル化することで、ガスクロマトグラフィーにより揮発分離し、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸を同定できる。
　（油脂Ａ）
　油脂Ａは、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまで使用する油脂の総体を指すものであり、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の範囲内にある。当該不飽和脂肪酸の平均含有割合は、３０重量％以上７０重量％以下であることが好ましく、４０重量％以上６５重量％以下であることがより好ましく、５０重量％以上６０重量％以下であることがさらに好ましい。
　油脂Ａは、油脂Ａ全体におけるパルミチン酸の平均含有割合が２０重量％以上６５重量％以下であることが好ましく、２５重量％以上６０重量％以下であることがより好ましく、３０重量％以上５５重量％以下であることがさらに好ましい。
　油脂Ａは、前記不飽和脂肪酸の平均含有割合を満足する限り、例えば、植物性油脂など入手可能な油脂１種類から構成されるものであってもよいし、入手可能な油脂２種類以上の油脂から構成されるものであってもよい。単独で油脂Ａに該当する油脂の例として、パーム油や、ラードを挙げることができる。
　油脂Ａが２種類以上の油脂から構成される場合、油脂Ａ全体として、前述した不飽和脂肪酸の平均含有割合を満足すればよい。油脂Ａを構成する個々の油脂における不飽和脂肪酸の含有割合は特に限定されず、２５重量％以上７５重量％未満の範囲内になくてもよい。また、油脂Ａが２種類以上の油脂から構成される場合、２種類以上の油脂は混合して培地に添加してもよいし、また、混合せずに、同時に又は順次、培地に添加してもよい。
　尚、本実施形態における「ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物の培養」とは、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物にポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）を高濃度に蓄積させることを目的に行う最終段階の「本培養」を指す。「本培養」の前に行う「前培養」及び「種母培養」は、本実施形態における「培養」には含まれない。そのため、「前培養」及び「種母培養」で使用する炭素源は、「油脂Ａ」に包含されない。
　（油脂Ｂ）
　油脂Ｂは、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％を超えたある時点以降に使用される炭素源であって、油脂Ｂにおける不飽和脂肪酸の含有割合が、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合より高いものを指す。油脂Ｂの不飽和脂肪酸の含有割合（重量％）と油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合（重量％）の差分は、特に限定されないが、油脂Ａと油脂Ｂを併用することによる効果をより良く達成する観点から、５重量％以上であることが好ましく、１０重量％以上であることがより好ましく、２０重量％以上であることが更に好ましい。
　油脂Ｂの不飽和脂肪酸の含有割合は、これと併用する特定の油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合との関係において定義されており、具体的な数値は限定されない。油脂Ｂの不飽和脂肪酸の含有割合の具体的な数値は、これと併用する特定の油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合より高い数値である限り特に限定されず、７５重量％以上であってもよいし、２５重量％以上７５重量％未満の範囲内にあってもよい。例えば、後述する実施例８で示すように、不飽和脂肪酸の含有割合が５８重量％である油脂Ａに対し、不飽和脂肪酸の含有割合が６６重量％である油脂Ｂを使用することができる。
　好適な一態様では、油脂Ｂの不飽和脂肪酸の含有割合は、６０重量％以上９８重量％以下であることが好ましく、６５重量％以上９６重量％以下であることがより好ましく、７０重量％以上９５重量％以下であることがさらに好ましく、７５重量％以上９４重量％以下であることが特に好ましい。
　油脂Ｂは、その不飽和脂肪酸の含有割合が油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合より高い限り、例えば、植物性油脂など入手可能な油脂１種類から構成されるものであってもよいし、入手可能な油脂２種類以上から構成されるものであってもよい。油脂Ｂに該当する油脂の例として、菜種油を挙げることができる。また、油脂Ｂは、前記要件を満足する限り、廃棄された食用油等であってもよい。
　本発明者らの検討によって、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂Ｂは、これを炭素源として単独で使用してＰＨＡ産生微生物を培養すると、ＰＨＡ生産速度が遅くなることが判明している。
　しかし、本実施形態では特定条件で油脂Ａと油脂Ｂを併用することにより、良好なＰＨＡ生産速度を達成することができる。このため、油脂Ｂを、ＰＨＡ産生微生物の炭素源として有効利用することが可能となる。油脂Ｂを有効利用する観点から、油脂Ｂの使用割合は多いほど好ましい。具体的には、前記培養全体で使用する油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ｂの使用量は１０重量％以上であり、４０重量％以上であってもよく、６０重量％以上であってもよく、８０重量％以上であってもよい。油脂Ｂの使用量の上限値は特に限定されないが、９７重量％以下であることが好ましく、９５重量％以下がより好ましく、９０重量％以下がさらに好ましい。以上のように高い割合で油脂Ｂを使用しても、油脂Ａを単独使用した場合と同等レベルの高いＰＨＡ生産速度を達成することができる。
　また、培養全体で使用する油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ａの使用量は、特に限定されないが、ＰＨＡ生産速度の改善を達成する観点から、３重量％以上であることが好ましく、５重量％以上がより好ましく、１０重量％以上がさらに好ましい。前記油脂Ａの使用量の上限値は、９０重量％以下であり、６０重量％以下であってもよく、４０重量％以下であってもよく、２０重量％以下であってもよい。
　（炭素源の使用態様）
　本実施形態では、ＰＨＡ産生微生物の培養において、少なくとも、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまでは、炭素源として、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的低い油脂Ａを使用する。その後、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％を超えたある時点以降は、炭素源として、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂Ｂを使用する。
　このように培養の初期の段階で油脂Ａを使用し、その後、油脂Ｂを使用することで、単独使用ではＰＨＡ生産速度が遅くなる油脂Ｂを利用しながらも、高レベルのＰＨＡ生産速度を達成することができる。そのメカニズムは不明であるが、培養の初期の段階ではＰＨＡの蓄積よりもＰＨＡ産生微生物の増殖が優先し、この細胞増殖段階では、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的低い油脂Ａのほうが炭素源として適しているが、増殖がある程度進行しＰＨＡの蓄積が優先するようになると、炭素源の種類の影響は軽減され、油脂Ｂも炭素源として有効であるためと推測される。
　ＰＨＡ蓄積量が１６重量％を超えた後、ある程度の時間は、油脂Ａと同じ不飽和脂肪酸の含有割合を有する油脂を継続使用することが好ましいが、いずれかの時点で、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂Ｂに変更する。好適な一態様によると、ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量が１６重量％を超えて８５重量％未満のある時点以降に使用する炭素源は、油脂Ｂであることが好ましい。これにより、単独使用ではＰＨＡ生産速度が遅くなる油脂Ｂを、ＰＨＡ産生微生物を培養する際の炭素源として有効利用することができる。前記ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量は、２０重量％以上８０重量％以下が好ましく、２５重量％以上５０重量％以下がより好ましく、２５重量％以上４５重量％以下がさらに好ましく、３０重量％以上４０重量％以下が特に好ましい。
　尚、ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量は、培養液から一定量を回収し、油脂を取り除くため有機溶剤と混合後、水で洗浄して乾燥させて得た乾燥菌体の重量と、同量の培養液から回収したＰＨＡの重量を測定し、以下の式で算出することが可能である。
ＰＨＡ蓄積量（％）＝［一定量の培養液から回収したＰＨＡ重量（ｇ）］／［一定量の培養液から得られる乾燥菌体重量（ｇ）］×１００
　本実施形態の好適な一態様によると、油脂Ａの存在下で培養を開始し、培養の途中で（ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量が最終的なレベルに到達する前に）、炭素源の種類を変更して、油脂Ｂの存在下で培養を継続し、ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量が最終的なレベルに到達した時に培養を終了することが好ましい。このように培養の初期では油脂Ａを炭素源として利用し、培養の途中から油脂Ｂを炭素源として利用することで、単独使用ではＰＨＡ生産速度が遅くなる油脂Ｂを炭素源として利用しているにも関わらず、高レベルのＰＨＡ生産速度を容易に達成することができる。
　前記好適な一態様において、炭素源を油脂Ａから油脂Ｂに変更するタイミングは特に限定されず、ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量や、油脂Ｂの使用割合に応じて適宜決定することができるが、例えば、ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量が１６重量％を超えて８５重量％未満のある時点であってよく、２０重量％以上８０重量％以下のある時点が好ましく、２５重量％以上５０重量％以下のある時点がより好ましく、３０重量％以上４５重量％以下のある時点がさらに好ましく、３０重量％以上４０重量％以下の範囲内にある時点が特に好ましい。このようなタイミングで炭素源の種類を変更することによって、油脂Ｂの使用量を増加させつつ、高いＰＨＡ生産速度を達成することかできる。
　培養を終了する時のＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量は特に限定されず、適宜決定すればよいが、８０重量％以上であることが好ましく、９０重量％以上であることがより好ましい。
　ＰＨＡ産生微生物を含む培地への油脂Ａ又は油脂Ｂの添加方法は、一括添加であってもよく、連続添加であってもよいが、連続添加であることが好ましい。即ち、ＰＨＡ産生微生物の培養は、ＰＨＡ産生微生物を含む培地に、油脂Ａ及び／又は油脂Ｂを連続添加しながら行うことが好ましい。ここで「連続添加」とは、経時的に途切れることなく継続して添加する態様の他、断続的に、一時的な休止期間を置きながら繰り返し添加する態様も含む。
　連続添加の具体的な一態様によると、ＰＨＡ産生微生物を含む培地に、油脂Ａを連続添加して分散させつつ培養を行った後、炭素源の種類を変更して、油脂Ｂを連続添加して分散させつつ培養を継続することが好ましい。
　（培地）
　ＰＨＡ産生微生物の培養で使用する培地としては、微生物の成長増殖に資する栄養源を含んだ液体の培地であれば良い。上述した炭素源の他、炭素源以外の窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む液体にＰＨＡ産生微生物を混合して、攪拌、振とうなどにより分散させることが好ましい。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
　このような栄養源を含む培地、炭素源、及び、ＰＨＡ産生微生物を容器内で分散させることにより、培養液が得られる。培養の条件は、上述した炭素源及びその添加方法以外は、通常の微生物培養法に従うことができ、培養スケール、通気攪拌条件、培養温度、培養時ｐＨ、培養時間などは特に限定されない。
　（ＰＨＡ回収）
　培養を適切な時間行って菌体内にＰＨＡを蓄積させた後、周知の方法を用いて菌体からＰＨＡを回収すればよい。その回収方法は特に限定されないが、例えば、次のような方法によって実施することができる。一例として、培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収することができる。
　別の例として、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄する。続いて、洗浄サンプルをラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液と混合し、超音波破砕により細胞膜を破壊し、遠心分離機等で菌体成分とＰＨＡを分離し、ＰＨＡを乾燥させることによりＰＨＡを回収することもできる。
　本実施形態によると、単独使用ではＰＨＡ生産速度が遅くなる不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂を利用しながら、良好な生産速度でＰＨＡを製造することが可能になる。
　以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　（使用油脂）
　以下の実施例、比較例、及び参考例で使用した油脂１～１１について、各油脂を構成する脂肪酸の含有割合と、飽和脂肪酸の合計含有割合、及び、不飽和脂肪酸の合計含有割合を表１に示す。尚、油脂１はパーム油、油脂３は菜種油、油脂１０はラードである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　（ＰＨＡ蓄積量の算出方法）
　ＰＨＡ蓄積量（重量％）は、一定量の培養液を有機溶剤と混合後、水で洗浄して乾燥させて得た乾燥菌体の重量と、同量の培養液から回収したＰＨＡの重量を測定し、以下の式で算出した。
ＰＨＡ蓄積量（重量％）＝［各実施例、比較例、又は参考例で得られたＰＨＡ重量（ｇ）］／［各実施例、比較例、又は参考例における乾燥菌体重量（ｇ）］×１００
　（ＰＨＡ生産性の算出方法）
　ＰＨＡ生産性（％）は、下記式にて、油脂１のみを用いてＰＨＡを生産した参考例１又は参考例５における培養溶液１リットル当たりから得られたＰＨＡ重量（ｇ）に対する、各実施例、比較例、又は参考例における培養溶液１リットル当たりから得られたＰＨＡ重量（ｇ）の比率として算出した。尚、基準とする参考例は、参考例１又は５のうち、同じＰＨＡ産生微生物を用いた参考例を選択する。
ＰＨＡ生産性（％）＝［各実施例、比較例、又は参考例で得られたＰＨＡ重量（ｇ）］／［参考例１又は参考例５で得られたＰＨＡ重量（ｇ）］×１００
　（比較例１～７及び参考例１～４）
　ＰＨＡ産生微生物として、ＫＮＫ－００５株（米国特許第７３８４７６６号参照）を用いて、下記に示した方法で（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。本培養では、炭素源である油脂として、表２に示す各油脂を単独で使用した。
　（１）前培養
　まず、ＫＮＫ－００５株のグリセロールストック　２０μＬを前培養培地２０ｍＬに接種し、３０℃、１８時間培養した。
　尚、前培養培地は、１ｗ／ｖ％　Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％　Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％　Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％　ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
　（２）種母培養
　得られた前培養液を、１．８Ｌの種母培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－８Ｃ）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．５～６．６の間でコントロールしながら２４時間培養し、種母培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
　尚、種母培養培地は、１．１ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％　ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％　（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％　パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％　微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％　ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、とした。炭素源はパームオレインオイルを１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
　（３）本培養
　得られた種母培養液を、２．５Ｌの本培養培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製Ｂｉｏｎｅｅｒ－Ｎｅｏ）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３４℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．５から６．６の間でコントロールした。ｐＨコントロールには２５％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
　炭素源として、表２に示した各油脂を培養期間中、断続的に添加しながら本培養を行った。本培養は４８時間行い、培養終了後、培養液を一定量回収し、蒸留水、メタノールで洗浄後に真空乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。前記と同様に菌体を洗浄後、ＳＤＳを用いて菌体構成成分を溶かし、超音波破砕によりＰＨＡと菌体成分を分離し、ＰＨＡのみを回収することでＰＨＡ蓄積量を測定した。これに基づきＰＨＡ生産性を算出し、表２に示した。
　尚、本培養培地は、０．３８５ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％　ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％　（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％　微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％　ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、０．０５ｗ／ｖ％　ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　表２より次のことが分かる。比較例１～７で使用した各油脂は、油脂中の不飽和脂肪酸の含有割合が高く、これらの油脂を炭素源として単独で使用した結果、ＰＨＡ生産性が８０％未満と低くなったことが分かる。一方、参考例１～４で使用した各油脂は、不飽和脂肪酸の含有割合が７５重量％未満と低く、これらの油脂を炭素源として単独で使用した結果、ＰＨＡ生産性が８０％以上と良好であったことが分かる。
　（実施例１）
　次に記載する点以外は、比較例１～７及び参考例１～４と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。本培養では、炭素源として、まず、第一油脂（油脂１）を断続的に添加しながら本培養を開始した。微生物中のＰＨＡ蓄積量が１５重量％に達した時点で、炭素源を第二油脂（油脂２）に切り替えて、第二油脂を断続的に添加しながら本培養を継続した。本培養の開始から４８時間経過した時に培養を終了した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
　当該実施例では、油脂１全量と、ＰＨＡ蓄積量が１５重量％から１６重量％に達するまでに使用した微量の油脂２が、油脂Ａに該当する。この時、油脂Ａの不飽和脂肪酸の平均含有割合は、約５８％である。また、油脂２が油脂Ｂに該当する。
　（実施例２）
　本培養で、第二油脂として油脂８を使用したこと以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
　当該実施例では、油脂１全量と、ＰＨＡ蓄積量が１５重量％から１６重量％に達するまでに使用した微量の油脂８が、油脂Ａに該当する。この時、油脂Ａの不飽和脂肪酸の平均含有割合は、約５６％である。また、油脂８が油脂Ｂに該当する。
　（実施例３～４）
　本培養で、第一油脂及び第二油脂としてそれぞれ表３に記載のものを使用し、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が２０重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
　尚、当該実施例では、第一油脂（油脂１）が油脂Ａに該当し、第二油脂（油脂２）が油脂Ｂに該当する。以下の実施例５～９も同様である。
　（実施例５～８）
　本培養で、第一油脂及び第二油脂としてそれぞれ表３に記載のものを使用し、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が３０～３４重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
　（実施例９）
　本培養で、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が７９重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　表３より次のことが分かる。実施例１～９は、油脂中の不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の第一油脂を炭素源として用いて本培養を開始し、本培養の途中で、炭素源を、不飽和脂肪酸の含有割合が第一油脂より高い第二油脂に切り替えて本培養を継続したものである。いずれも、ＰＨＡ生産性が８０％以上と良好であったことが分かる。特に実施例３～８は、単独使用でのＰＨＡ生産性が低い第二油脂を８０重量％以上も使用しているにも関わらず、ＰＨＡ生産性が９０％以上と極めて高くなっている。
　不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂は、表２の比較例１～７や参考例４で示したように単独で使用するとＰＨＡ生産性が低くなるにも関わらず、不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂と組み合わせて順次使用することで良好なＰＨＡ生産性を達成できることが分かる。
　（比較例８）
　次に記載する点以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。実施例１の本培養での油脂１と油脂２の添加順序を逆にして、まず、炭素源として油脂２を断続的に添加しながら本培養を開始した。微生物中のＰＨＡ蓄積量が３０重量％に達した時点で、炭素源を油脂１に切り替えて、油脂１を断続的に添加しながら本培養を継続した。本培養の開始から４８時間経過した時に培養を終了した。表４に、本培養で使用した炭素源中の油脂１及び油脂２それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
　（比較例９）
　本培養で、油脂２から油脂１への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が８０重量％に達した時点で実施したこと以外は、比較例８と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表４に、本培養で使用した炭素源中の油脂１及び油脂２それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　表４より次のことが分かる。比較例８及び９では、実施例１～９とは異なり、油脂中の不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂（油脂２）を炭素源として用いて本培養を開始し、本培養の途中で、炭素源を、不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂（油脂１）に切り替えて本培養を継続したものである。結果、ＰＨＡ生産性が８０％未満と低く、比較例１～７と同程度であった。特に比較例８は、単独使用でＰＨＡ生産性が最も高い油脂１を８０重量％以上も使用しているにも関わらず、ＰＨＡ生産性が７６％と極めて低くなっている。
　以上より、良好なＰＨＡ生産性を得るには、培養の初期に使用する炭素源は、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂ではなく、実施例１～９のように不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂であることが望ましいことが分かる。
　（比較例１０～１２及び参考例５～７）
　ＰＨＡ産生微生物として、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株を用い、本培養の炭素源として、表５に示す各油脂を単独で使用したこと以外は、比較例１～７及び参考例１～４と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表５に、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　表５より次のことが分かる。油脂中の不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂を炭素源として単独で使用した比較例１０～１２では、ＰＨＡ生産性が８０％未満と低くなった。一方、不飽和脂肪酸の含有割合が７５重量％未満と低い油脂を炭素源として単独で使用した参考例５～７では、ＰＨＡ生産性が８０％以上と良好であったことが分かる。即ち、比較例１０～１２及び参考例５～７では、比較例１～７及び参考例１～４とは異なるＰＨＡ産生微生物を使用したが、炭素源の種類とＰＨＡ生産性の関係は同じ傾向にあることが分かる。
　（実施例１０）
　次に記載する点以外は、比較例１０～１２及び参考例５～７と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。本培養では、炭素源として、まず、第一油脂（油脂１）を断続的に添加しながら本培養を開始した。微生物中のＰＨＡ蓄積量が１５重量％に達した時点で、炭素源を第二油脂（油脂２）に切り替えて、第二油脂を断続的に添加しながら本培養を継続した。本培養の開始から４８時間経過した時に培養を終了した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
　（実施例１１）
　本培養で、第二油脂として油脂８を使用したこと以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
　（実施例１２～１３）
　本培養で、第一油脂及び第二油脂としてそれぞれ表６に記載のものを使用し、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が２０重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
　（実施例１４～１８）
　本培養で、第一油脂及び第二油脂としてそれぞれ表６に記載のものを使用し、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が３０～３４重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
　（実施例１９）
　本培養で、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が８２重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　表６より次のことが分かる。実施例１０～１９は、実施例１～９と同様、油脂中の不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の第一油脂を炭素源として用いて本培養を開始し、本培養の途中で、炭素源を、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い第二油脂に切り替えて本培養を継続したものである。いずれも、ＰＨＡ生産性が８０％以上と良好であったことが分かる。特に、実施例１２～１８は、単独使用でのＰＨＡ生産性が低い第二油脂を８０重量％以上も使用しているにも関わらず、ＰＨＡ生産性が９０％以上と極めて高くなっている。
　不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂は、表５の比較例１０～１２や参考例７で示したように単独で使用するとＰＨＡ生産性が低くなるにも関わらず、不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂と組み合わせて順次使用することで良好なＰＨＡ生産性を達成できることが分かる。
　（比較例１３）
　次に記載する点以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。実施例１０の本培養での油脂１と油脂２の添加順序を逆にして、まず、炭素源として油脂２を断続的に添加しながら本培養を開始した。微生物中のＰＨＡ蓄積量が３２重量％に達した時点で、炭素源を油脂１に切り替えて、油脂１を断続的に添加しながら本培養を継続した。本培養の開始から４８時間経過した時に培養を終了した。表７に、本培養で使用した炭素源中の油脂１及び油脂２それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
　（比較例１４）
　本培養で、油脂２から油脂１への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が８０重量％に達した時点で実施したこと以外は、比較例１３と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表７に、本培養で使用した炭素源中の油脂１及び油脂２それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　表７より次のことが分かる。比較例１３及び１４では、実施例１０～１９とは異なり、油脂中の不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂（油脂２）を炭素源として用いて本培養を開始し、本培養の途中で、炭素源を、不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂（油脂１）に切り替えて本培養を継続したものである。結果、ＰＨＡ生産性が８０％未満と低く、比較例１０～１２と同程度であった。特に比較例１３は、単独使用でＰＨＡ生産性が最も高い油脂１を８０重量％近くも使用しているにも関わらず、ＰＨＡ生産性が７３％と極めて低くなっている。
　以上より、良好なＰＨＡ生産性を得るには、培養の初期に使用する炭素源は、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂ではなく、実施例１０～１９のように不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂であることが望ましいことが分かる。
 

Claims (12)

  1. 　炭素源の存在下でポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を培養することによるポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法であって、
    　前記培養において、炭素源として油脂Ａ及び油脂Ｂを使用し、
    　前記培養全体で油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ｂの使用量は１０重量％以上である、製造方法。
    油脂Ａ：前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまで使用する油脂の総体を指し、油脂Ａ全体において、構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の平均含有割合が２５重量％以上７５重量％未満である。
    油脂Ｂ：油脂Ｂにおける構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の含有割合は、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の前記平均含有割合より高い。
  2. 　前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％を超えて８５重量％未満のある時点以降に使用する炭素源は、油脂Ｂである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　油脂Ｂは、不飽和脂肪酸の含有割合が６０重量％以上９８重量％以下の油脂である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記培養全体で油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ｂの使用量は４０重量％以上である、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物の培養を、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が８０重量％以上に達するまで実施する、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を含む培地に、油脂Ａ及び／又は油脂Ｂを連続添加しながら培養を行う、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を含む培地に、油脂Ａを連続添加しながら培養を行った後、油脂Ｂを連続添加しながら培養を継続する、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）は、少なくとも３－ヒドロキシブチレート単位を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）は、３－ヒドロキシブチレート単位の単独重合体、又は、３－ヒドロキシブチレート単位と他のヒドロキシアルカノエート単位との共重合体を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 　前記他のヒドロキシアルカノエート単位が、３－ヒドロキシヘキサノエート単位である、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物が細菌である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 　前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物がカプリアビダス属に属する細菌である、請求項１１記載の製造方法。
     
     
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