WO2021106462A1 - 液中での脂質類粒子の製造方法及び微生物の培養方法 - Google Patents

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WO2021106462A1
WO2021106462A1 PCT/JP2020/040062 JP2020040062W WO2021106462A1 WO 2021106462 A1 WO2021106462 A1 WO 2021106462A1 JP 2020040062 W JP2020040062 W JP 2020040062W WO 2021106462 A1 WO2021106462 A1 WO 2021106462A1
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lipids
lipid particles
liquid
gas
melting point
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PCT/JP2020/040062
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猪狩尊史
西森塩穂美
平野優
一力啓晃
神田彰久
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株式会社カネカ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/12—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing fuels or solvents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2/00—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic
    • B01J2/02—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic by dividing the liquid material into drops, e.g. by spraying, and solidifying the drops
    • B01J2/06—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic by dividing the liquid material into drops, e.g. by spraying, and solidifying the drops in a liquid medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing fine particles of lipids in a liquid, specifically, a method for producing fine particles of lipid particles which can be assimilated by a microorganism but has low solubility in water, and a method for producing fine particles of microorganisms. Regarding the culture method.
  • microbial production and substance production by microorganisms are increasing against the background of increasing awareness of environmental issues, food issues, health and safety, and increasing natural or natural orientation.
  • a carbon source carbon source for culturing, fermentation, etc.
  • Typical examples of the carbon source include sugars, lipids (for example, animal and vegetable fats and oils containing fatty acids) and the like.
  • lipids have a melting point higher than the culture temperature of microorganisms and have extremely low solubility in water. Since such lipids coagulate in the culture medium, the assimilation property of microorganisms is low, and they cannot be suitably used.
  • solubility of fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, and stearic acid having a high melting point is 0.1 g / L or less at a water temperature of 25 ° C. even for lauric acid having the highest solubility in water.
  • Non-Patent Document 1 describes that the fact that lauric acid is solid at the culture temperature increases the difficulty of culturing.
  • Patent Document 1 It has also been reported that fatty acids are adjusted to the form of an oil-in-water emulsion so as to have a large specific surface area and supplied to the culture solution as a carbon source to improve bacterial cell growth.
  • Patent Document 2 There is also a report that fat or oil is heated above its melting point and added to a medium in a dispersed state and used for the production of bioproducts by microorganisms.
  • the present invention efficiently finely disperses lipids having low solubility in water at room temperature and solid at room temperature in a liquid having a temperature lower than the melting point of the lipids, and the lipids in the liquid.
  • a method for producing lipid particles and a method for producing microorganisms for producing similar particles.
  • the present invention is, in one or more embodiments, a method for producing lipid particles in which molten lipids are coagulated into particles in a liquid to obtain lipid particles, wherein the lipids are water at 25 ° C.
  • a method for producing lipid particles in which molten lipids are coagulated into particles in a liquid to obtain lipid particles, wherein the lipids are water at 25 ° C.
  • a step of obtaining lipid particles by directly injecting a gas into the liquid from a gas supply port of a fluid nozzle to disperse the molten lipids in the liquid and coagulate them while forming particles.
  • the bifluid nozzle is heated to a temperature higher than the melting point of the lipids by 10 ° C. or more, and the ratio D50 of the volume median diameter D50 of the lipid particles to the orifice diameter Nd of the liquid supply port of the bifluid nozzle is D50.
  • the present invention relates to a method for producing a lipid particle, wherein / Nd is 0.0017 or more and 0.17 or less.
  • the present invention is also characterized in that, in one or more embodiments, the lipid particles are prepared in a culture solution by the method for producing lipid particles, and the microorganism is cultured in the culture solution containing the lipid fine particles.
  • the present invention relates to a method for culturing microorganisms.
  • lipids having low solubility in water at room temperature (25 ° C.) and solid at room temperature are efficiently finely dispersed in a liquid having a temperature lower than the melting point of the lipids.
  • Lipid particles can be produced in a liquid.
  • lipids having low solubility in water at room temperature and solid at room temperature are efficiently finely dispersed in a culture solution having a temperature lower than the melting point of the lipids to form particles.
  • the lipid particles can be suitably assimilated by microorganisms, and therefore useful substances such as microbial metabolites such as PHA can be industrially and efficiently produced.
  • FIG. 1 is a schematic view of a device for producing lipid particles used in one or more embodiments of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph plotting data of volume median diameter of Vg / Vf and PFAD particles / orifice diameter of the liquid supply port in Examples 6 to 14.
  • the present inventors have conducted diligent studies in order to solve the above-mentioned problems.
  • the molten lipids are directly injected into the liquid having a temperature lower than the melting point of the lipids from the liquid supply port of the two-fluid nozzle heated to a temperature higher than the melting point of the lipids by 10 ° C. or more, and the two fluids.
  • the ratio D50 / Nd of the volume median diameter D50 of the target lipid particles to the orifice diameter Nd of the liquid supply port is 0.0017 or more and 0.17 or less.
  • in liquid means an aqueous solution or an aqueous dispersion containing water as the main solvent.
  • using water as the main solvent means that the solvent contains 90% by mass or more of water, preferably 95% by mass or more of water, and more preferably 100% by mass or more of water. Means to be.
  • the "melted lipids” means that the temperature of the lipids is equal to or higher than the melting point.
  • the lipids are not particularly limited as long as they have a solubility in water at 25 ° C. of 10 g / L or less and are solid at 25 ° C.
  • any lipid can be used as long as it can be assimilated by a microorganism.
  • the lipids include fatty acids, hydrocarbons, sterols, and mixtures thereof. Among them, lipids in which the target microorganism has a metabolic pathway can be preferably used.
  • fatty acids include fatty acids, fatty acid salts, fatty acid esters and the like.
  • fatty acid salts include fatty acid sodium, fatty acid potassium, fatty acid calcium, fatty acid magnesium and the like.
  • fatty acid ester include fatty acid glycerin ester and the like.
  • fatty acid glycerin ester include triglyceride, diglyceride, monoglyceride and the like.
  • hydrocarbons examples include paraffin (paraffin wax), wax, polyethylene wax, petrolatum, ceresin and the like.
  • sterols examples include cholesterol, 24-methylene sterol and the like.
  • the lipids are preferably animal and vegetable fats and oils, or fatty acid glycerin esters or fatty acids derived from animal and vegetable fats and oils. Further, considering the influence on food problems, it is more preferable to use fats and oils, fatty acids, waste oils and the like for non-edible uses.
  • animal and vegetable oils and fats examples include beef oil, pig fat, milk fat, fish oil, soybean oil, rapeseed oil, sunflower oil, olive oil, sesame oil, canola oil, peanut oil, tung oil, rice oil, cottonseed oil, rice oil, and saflower oil.
  • palm kernel oil such as palm olein and palm double olein, which is a low melting point fraction obtained by separating palm oil
  • palm kernel oil such as palm kernel oil olein, which is a low melting point fraction obtained by separating palm kernel oil, and the like.
  • fatty acids derived from animal and vegetable fats and oils include fatty acids, fatty acid salts, fatty acid esters and the like, which are constituents of the above-mentioned animal and vegetable fats and oils. These can be used alone or in combination of two or more.
  • lipids derived from palm oil include crude palm oil, crude palm kernel oil, palm oil, palm kernel oil, palm olein, palm double olein, palm kernel oil olein, and PFAD (palm oil fatty acid). Distillate), PKFAD (palm kernel oil fatty acid distillate), POME (Palm Oil Mill Effluent, waste liquid discharged in the process of obtaining crude palm oil from abra palm fruit), and EFB juice (Empty Fruit Bunch Juice, abra palm) (By-products obtained in the process of obtaining palm oil pellets from palm oil), and crude refined oils, fractionated oils, hardened oils, and ester-exchanged oils of these fats and oils can be mentioned.
  • a component produced as a by-product in the process of refining the animal and vegetable fats and oils in order to avoid competition with food.
  • by-products in the purification treatment include fatty acid salts produced in the alkaline deoxidizing step, distillation residues produced in the distillation deoxidizing step, and distillation residues produced in the deodorizing step.
  • the distillation residue which is a by-product of the purification treatment, may contain monoglyceride, diglyceride, etc. in addition to the fatty acid as the main component.
  • the lipids preferably have, for example, a melting point of 30 ° C. or higher and 120 ° C. or lower.
  • a melting point of 30 ° C. or higher and 120 ° C. or lower.
  • the melting point of lipids is more preferably 35 ° C. or higher, further preferably 38 ° C. or higher, and particularly preferably 40 ° C. or higher.
  • the melting point is 120 ° C. or lower, the coagulation of lipids in the nozzle is likely to be suppressed, and the flow path is less likely to be blocked.
  • the melting point of the lipids is more preferably 100 ° C. or lower, and even more preferably 80 ° C. or lower.
  • lipids having a solubility in water at 25 ° C. of 10 g / L or less and solid at 25 ° C. are optionally combined with other components such as other carbon sources. It may be used in combination.
  • the two-fluid nozzle (also referred to as an pneumatic spray nozzle or an air spray nozzle) is not particularly limited, and is a ratio D50 / of the volume median diameter D50 of the target lipid particles to the orifice diameter Nd of the liquid supply port.
  • a known bifluid nozzle having Nd of 0.0017 or more and 0.17 or less and capable of atomizing the liquid can be appropriately used.
  • D50 / Nd is 0.0017 or more and 0.17 or less, finely divided lipid particles having, for example, a volume median diameter of less than 1 mm can be suitably produced.
  • D50 / Nd is more preferably 0.005 or more and 0.14 or less, further preferably 0.01 or more and 0.10 or less, and 0.02 or more and 0. It is particularly preferably 08 or less.
  • the two-fluid nozzle is not particularly limited, but for example, from the viewpoint of suppressing clogging of the nozzle, it is preferable that the two-fluid nozzle is an external mixture type in which liquid and air are mixed outside the nozzle.
  • the molten lipids are directly injected (supplied) from the liquid supply port of the two-fluid nozzle into the liquid at a temperature lower than the melting point of the lipids, and the gas is injected into the liquid from the gas supply port of the two-fluid nozzle.
  • the injected gas makes it easier to obtain lipid particles by dispersing the molten lipids in the liquid and coagulating them while forming particles.
  • the two-fluid nozzle may be attached so that the liquid injection hole and the gas injection hole are located lower than the liquid level and in the liquid so that the molten lipids and gas can be directly injected into the liquid.
  • the material of the two-fluid nozzle is not particularly limited, but is preferably stainless steel, ceramic, titanium or the like from the viewpoint of high stability in a liquid such as a culture solution.
  • the two-fluid nozzle is heated to a temperature higher than the melting point of the lipids by 10 ° C. or more. As a result, it is possible to suppress the coagulation of lipids in the nozzle.
  • the heating temperature of the two-fluid nozzle is preferably 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. or higher, higher than the melting point of the lipids.
  • the heating temperature of the two-fluid nozzle is not particularly limited, but for example, from the viewpoint of suppressing the denaturation of the medium, the denaturation of the secretions of the microorganism into the medium, the denaturation of the cells of the microorganism, and the adverse effect on the growth. Therefore, it is preferably 200 ° C. or lower, more preferably 180 ° C. or lower, and further preferably 160 ° C. or lower.
  • the heating method is not particularly limited.
  • the spray pattern of the liquid ejected from the nozzle is not particularly limited, but a circular pattern is preferable from the viewpoint that the spray flow rate is large and the particle size distribution tends to be uniform.
  • the two-fluid nozzle is not particularly limited, but for example, from the viewpoint of easily atomizing lipids in a liquid, the ratio Vg / Vf of the injection linear velocity Vg of the gas and the injection linear velocity Vf of the lipids in the molten state is It is preferably 10 or more and 2000 or less, more preferably 12 or more and 1900 or less, further preferably 15 or more and 1800 or less, and particularly preferably 15 or more and 1200 or less.
  • the lipids may be directly supplied to the liquid in a molten state, and are not particularly limited, but the temperature of the lipids in the molten state from the viewpoint of suppressing coagulation of the lipids in the nozzle and easily forming fine particles. Is preferably 5 ° C. or higher, more preferably 10 ° C. or higher, and even more preferably 15 ° C. or higher than the melting point of lipids.
  • the temperature of the lipids is not particularly limited, but for example, from the viewpoint of suppressing the denaturation of the medium, the denaturation of the secretions of the microorganism into the medium, the denaturation of the cells of the microorganism, and the adverse effect on the growth.
  • the temperature is preferably 150 ° C. or lower, more preferably 120 ° C. or lower, still more preferably 95 ° C. or lower.
  • the heating method is not particularly limited.
  • the gas is not particularly limited, but for example, in the case of aerobic culture, air, oxygen, or a mixture thereof is used because the gas ejected from the nozzle can be used to supply oxygen to microorganisms. It is preferable to do so.
  • air, oxygen, or a mixture thereof is used because the gas ejected from the nozzle can be used to supply oxygen to microorganisms. It is preferable to do so.
  • nitrogen or a mixture of air and nitrogen because the dissolved oxygen concentration in the culture solution can be kept low.
  • hydrogen or a mixture of air and hydrogen because the gas ejected from the nozzle can be used to supply hydrogen to microorganisms.
  • the temperature of the gas is not particularly limited, but is preferably equal to or higher than the melting point of the lipids from the viewpoint of suppressing the coagulation of the lipids in the nozzle and easily atomizing the lipids in the liquid. It is more preferably 5 ° C. or higher than the melting point, and even more preferably 10 ° C. or higher.
  • the temperature of the gas is not particularly limited, but is 200, for example, from the viewpoint of suppressing the denaturation of the medium, the denaturation of the secretions of the microorganism into the medium, the denaturation of the cells of the microorganism, and the adverse effect on the growth.
  • the temperature is preferably 1 ° C. or lower, more preferably 180 ° C. or lower, still more preferably 160 ° C. or lower.
  • the heating method is not particularly limited.
  • the liquid that directly supplies the molten lipid particles and the gas.
  • Stirring can be performed using, for example, a stirrer using a propeller or the like.
  • the temperature of the solution may be lower than the melting point of the lipid particles, for example, 20 ° C. or higher, and in the case of the culture solution, for example, 25 ° C. or higher and 37 ° C. or lower.
  • the lipid particles preferably have a volume median diameter D50 of 150 ⁇ m or less, more preferably 80 ⁇ m or less, still more preferably 60 ⁇ m or less, from the viewpoint that microorganisms can easily assimilate as a carbon source. It is particularly preferably 40 ⁇ m or less. Further, for example, from the viewpoint of increasing the particleization efficiency, the lipid particles preferably have a volume median diameter of 1 ⁇ m or more, more preferably 5 ⁇ m or more, and further preferably 10 ⁇ m or more.
  • the span represented by the following mathematical formula (1) is 0.5 or more and 3.0 or less in the particle size distribution. It is preferable that the range of 0.8 or more and 2.8 or less is satisfied, and 1.0 or more and 2.5 or less is more preferable.
  • Span (D90-D10) / D50 (1)
  • the particle size distribution of lipid particles can be measured by a laser diffraction / scattering type measuring method.
  • a particle size distribution measuring device "MT3300EXII" manufactured by Microtrac.
  • the molten lipids and gases may be supplied to the culture solution all at once, or continuously or intermittently. Further, other carbon sources may be directly supplied into the culture solution at the same time as the molten lipids.
  • Lipid particles can be prepared in a culture solution by the above-mentioned method for producing lipid particles, and microorganisms can be cultured in a culture solution containing the lipid particles.
  • the microorganism is not particularly limited, and examples thereof include microorganisms capable of producing an environment-friendly biodegradable plastic having almost no adverse effect on the ecosystem. Among them, microorganisms that produce polyhydroxyalkanoates (hereinafter, also referred to as PHA), which are produced by using natural organic acids and fats and oils derived from plants as a carbon source and accumulated as an energy storage substance in cells, are preferable.
  • PHA polyhydroxyalkanoates
  • the PHA is a general term for polymers having 3-hydroxyalkanoic acid as a monomer unit.
  • the 3-hydroxyalkanoic acid is not particularly limited, and is, for example, 3-hydroxypropionate, 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate, 3-hydroxyhexanoate, 3-hydroxyheptanoate, and 3. -Hydroxyoctanoate and the like.
  • the PHA may be a homopolymer having one kind of 3-hydroxyalkanoic acid as a monomer unit, or may be a copolymer having two or more kinds of 3-hydroxyalkanoic acid as a monomer unit.
  • the copolymer includes a copolymer of 3-hydroxybutyrate (3HB) and another 3-hydroxyalkanoic acid, or 3-hydroxyalkanoate containing at least 3-hydroxyhexanoate (3HH) as a monomer unit.
  • Examples thereof include copolymers.
  • Specific examples of the PHA include poly (3-hydroxybutyrate) (PHB), poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBH), and poly (3-hydroxybutyrate-).
  • Co-3-hydroxyvalerate-co-3-hydroxyhexanoate poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate), poly (3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyate) Rate), poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctanoate), poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctanoate), etc. are industrially easy to produce. From the point of view, it is preferable.
  • the microorganism used for the production of PHA is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of producing PHA.
  • Microorganisms isolated from nature, microorganisms deposited in a strain depository (for example, IFO, ATCC, etc.), or genetically engineered microorganisms such as mutants and transformants that can be prepared from them can be used.
  • the genus Capiliavidus such as Cupriavidus necator
  • the genus Alcaligenes such as Alcaligenes latas
  • Pseudomonas putida Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fluorescens. aeruginosa
  • Pseudomonas genus Bacillus megaterium, etc.
  • modified biological cells that artificially produce PHA by introducing a PHA synthase gene or the like using a genetic engineering technique.
  • a genetic engineering technique for example, in addition to the above-mentioned microorganisms belonging to the genus Capiliavidas, Alkalinegenes, Pseudomonas, Bacillus, Azotobacta, Nocardia, Aeromonas, Larstonia, Wautersia, Comamonas, etc., Escherichia ( Glam-negative bacteria such as Escherichia, gram-positive bacteria such as Bacillus, yeasts such as Saccharomyces, Yarrowia, and Candida are preferably used. It is possible to obtain a modified biological cell that artificially produces PHA.
  • PHBH among PHA for example, a method using a microorganism that originally produces PHBH such as Aeromonas caviae or Aeromonas hydrophila, or a genetic engineering method for a microorganism that does not originally produce PHBH, a PHA synthase gene, etc.
  • a modified biological cell that artificially produces PHBH As the host microorganism into which the gene is introduced, for example, Cupriavidus necator can be preferably used.
  • a PHA synthase gene a PHA synthase gene derived from Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila or Chromobacterium sp., A variant thereof, or the like can be used.
  • a base sequence encoding a PHA synthase in which an amino acid group is deleted, added, inserted, or substituted can be used.
  • culturing microorganisms it is possible to cultivate by the same method as the usual culturing method of each microorganism except that a culture solution containing lipid particles prepared by the above-mentioned method for producing lipid particles is used. Specifically, a two-fluid nozzle is attached to the culture tank so that the liquid supply port and the gas supply port are located below the liquid level of the culture solution in the culture solution and in the culture solution, and the lipid fine particles in the culture solution.
  • the microorganism can be cultivated in the same manner as before, except that the mixture is prepared and supplied as a carbon source.
  • PHA can be recovered from the microorganisms cultured by the above culture method using a well-known method. For example, it can be performed by the following method. After completion of the culture, the cells are separated from the culture solution by a centrifuge or the like, and the cells are washed with distilled water, methanol or the like and dried. PHA is extracted from the dried cells using an organic solvent such as chloroform. The bacterial cell component is removed from the solution containing PHA by filtration or the like, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate PHA. Further, the supernatant is removed by filtration or centrifugation and dried to recover PHA.
  • a well-known method For example, it can be performed by the following method. After completion of the culture, the cells are separated from the culture solution by a centrifuge or the like, and the cells are washed with distilled water, methanol or the like and dried. PHA is extracted from the dried cells using an organic solvent such as
  • FIG. 1 is a schematic view of a device for producing lipid particles used in one or more embodiments of the present invention.
  • the manufacturing apparatus used in the manufacturing method of the present invention is not limited to that shown in FIG.
  • the manufacturing apparatus 20 includes a container 1 such as a culture tank and a two-fluid nozzle 3.
  • the bifluid nozzle 3 is attached to the wall surface of the container 1 so that the liquid supply port 12 and the gas supply port 13 of the bifluid nozzle 3 are lower than the liquid level 2 and located in the liquid.
  • the temperature of the two-fluid nozzle 3 can be adjusted by the heater 4.
  • the molten lipids 10 supplied from the tank 5 with the temperature control function to the liquid flow path of the bifluid nozzle 3 through the line 7 with the temperature control function using the tube pump 6 are liquid supply ports (liquid injection holes). It is directly supplied (injected) into the liquid from No. 12.
  • the gas 11 supplied to the gas flow path of the two-fluid nozzle 3 through the flow rate adjusting valve 8 and the temperature adjusting heater 9 is directly supplied (injected) into the liquid from the gas supply port (gas injection hole) 13.
  • the molten lipids 10 are directly supplied from the liquid supply port 12 of the two-fluid nozzle 3 into a liquid having a temperature lower than the melting point of the lipids, and the gas 11 is supplied into the liquid from the gas supply port 13 of the two-fluid nozzle 3.
  • the lipid particles 14 can be obtained by directly injecting and coagulating the molten lipids 10 injected with the injected gas 11 while dispersing them in the liquid and forming them into particles.
  • the ratio D50 / Nd of the volume median diameter D50 of the target lipid particles to the orifice diameter Nd of the liquid supply port of the two-fluid nozzle is adjusted to be 0.0017 or more and 0.17 or less.
  • the manufacturing apparatus 20 includes a stirrer 16 with a propeller, whereby the lipid particles 14 can be uniformly dispersed in the culture solution.
  • Reference numeral 15 is an exhaust line.
  • the bifluid nozzle 3 has a structure in which a gas flow path surrounds the liquid flow path, and has a function of a heat insulating material that prevents the gas from cooling the liquid and the liquid flow path by the culture solution. In particular, in a preferred embodiment in which the temperature of the gas is higher than the melting point of the lipids, the function of the heat insulating material is further enhanced.
  • Example 1 Lipid particles were produced using the production apparatus shown in FIG. Put 150 L of water (25 ° C) in a 200 L container, and in the two-fluid nozzle, the nozzle injection port is located on the wall surface 300 mm above the lower end of the container, and the liquid supply port and gas supply port are located horizontally and in the liquid. I installed it so that it would.
  • the two-fluid nozzle has a circular spray pattern, and the nozzle material is an external mixing type two-fluid spray nozzle (1/4 JAUCO made by Spraying Systems, the orifice diameter of the liquid feed part (liquid supply port) is 0.6 mm, the gas feed part.
  • the ring area of was 1.6 ⁇ 10 -6 m 2 ).
  • the two-fluid nozzle was preheated to 75-80 ° C.
  • the air supplied to the two-fluid nozzle was heated to 60 ° C. and adjusted so that the air flow rate was 10 L / min (line speed 104.2 m / sec).
  • the temperature inside the container was 34 ° C., and 0.2 to 0.86 mL of molten fatty acid distillation (PFAD, melting point 50 ° C., density 0.87 g / mL, 25 ° C. solubility 10 g / L or less) heated to 60 ° C. It was added at a rate (flow rate) of / min and solidified in water.
  • PFAD molten fatty acid distillation
  • the ratio Vg / Vf of the jet velocity Vg of air to the jet velocity Vf of the fatty acid distillation in the molten state was 71. After long-term operation for 6 hours, nozzle clogging did not occur and lipid particles could be produced.
  • the particle size distribution of the obtained PFAD particles was measured with a particle size distribution measuring device (MT3300EXII manufactured by Microtrac) in Example 1, the volume median diameter (D50) was 20.1 ⁇ m, and the span [(D90-D10) / D50] was 2.51, and the volume median diameter of the PFAD particles / the orifice diameter of the liquid supply port was 0.033.
  • Example 1 The operation was performed under the same method and conditions as in Example 1 except that the nozzle was not heated. Within 5 minutes after the start of supply (spraying) of the molten fatty acid distillate and air, the nozzle was blocked and the operation became inoperable.
  • Examples 2 to 5 1L of water (34 ° C) is put into a 5L jar fermenter (BMS-5L manufactured by Biot), and the nozzle injection port of the two-fluid nozzle is located on the wall surface 50 mm above the lower end of the culture tank, and the air supplied to the two-fluid nozzle is Adjust the air volume to 6 L / min (line speed 62.5 m / sec), add 5 g of PFAD at a rate of 1 mL / min (line speed 0.06 m / sec), and set the nozzle temperature and PFAD temperature as follows. Fatty acid particles were obtained under the same method and conditions as in Example 1 except as shown in Table 1.
  • Example 2 the ratio Vg / Vf of the jet linear velocity Vg of air and the jet linear velocity Vf of the fatty acid distilled in the molten state was 1060.
  • the particle size distribution of the obtained PFAD particles was measured with a particle size distribution measuring device (MT3300EXII manufactured by Microtrac), and the results are shown in Table 1.
  • Example 6 Put 3.5 L of water in a 10 L jar fermenter (BMS-10L manufactured by Biot), and add 52.5 g of fatty acid distillate (PFAD, melting point 50 ° C., density 0.87 g / mL, 25 ° C. solubility 10 g / L or less).
  • PFAD fatty acid distillate
  • the air flow rate of the air supplied to the two-fluid nozzle was adjusted to 10 L / min (linear speed 104.2 m / sec), and the addition rate of PFAD (flow rate of PFAD) was as shown in Table 2 below.
  • Fatty acid particles were obtained under the same method and conditions as in Example 1 except.
  • the particle size distribution of the obtained PFAD particles was measured with a particle size distribution measuring device (MT3300EXII manufactured by Microtrac), and the results are shown in Table 2.
  • Example 14 Put 3.5 L of water (34 ° C.) in a 10 L jar fermenter (BMS-10L manufactured by Biot), and fatty acid distillate (PFAD, melting point 50 ° C., density 0.87 g / mL, 25 ° C. solubility 10 g / L or less) 52 Add .5 g, adjust the air flow rate of the air supplied to the two-fluid nozzle to 6 L / min (line speed 62.5 m / sec), and adjust the addition rate of PFAD to a rate of 20.2 mL / min (line speed). Fatty acid particles were obtained under the same method and conditions as in Example 1 except that the mixture was added at a speed of 1.19 m / sec.
  • BMS-10L manufactured by Biot fatty acid distillate
  • the ratio Vg / Vf of the jet velocity Vg of air to the jet velocity Vf of the fatty acid distillation in the molten state was 52.
  • the volume median diameter (D50) was 31.5 ⁇ m, and the span [(D90-D10) / D50] was 1. It was 29, and the volume median diameter of the PFAD particles / the orifice diameter of the liquid supply port was 0.053.
  • FIG. 2 shows a graph plotting data of the volume median diameter of Vg / Vf and PFAD particles / orifice diameter of the liquid supply port in Examples 6 to 14. From FIG. 2, it can be seen that in the PFAD liquid spraying by the two-fluid nozzle, Vg / Vf and the volume median diameter of the PFAD particles / the orifice diameter of the liquid supply port are correlated.
  • Example 2 (Comparative Example 2) Except that 1 L of water (34 ° C) was put in a cylindrical container with a diameter of 10 cm, an injection hole of an external mixed two-fluid spray nozzle was installed at a height of 5 cm from the water surface, and PFAD was injected from the nozzle toward the water surface. Spraying was carried out under the same method and conditions as in Example 14. The PFAD solidified and aggregated on the water surface, and coarse particles having a diameter of 3 mm or more were obtained.
  • Example 15 (Culturing cells using spray in lipid solution using an external mixed two-fluid spray nozzle)
  • KNK-631 strain (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-09627 and International Publication No. 2016/114128) was used, and seed mother culture, pre-culture, and main culture were carried out, and the cells were recovered.
  • Tanehaha medium 1 w / v% of Meat-extract, 1w / v% of Bacto-Tryptone, 0.2w / v% of Yeast-extract, 0.9w / v% of Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O and 0.15 w / v% KH 2 PO 4 were used, and the pH was set to 6.8.
  • composition of the preculture medium 1.1w / v% of Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O , 0.19w / v% of KH 2 PO 4, 1.29w / v % of (NH 4) 2 SO 4, 0.1 w / v% of MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.5v / v% trace metal salt solution (1.6 w in 0.1N HCl / v% of FeCl 3 ⁇ 6H 2 O, of 1 w / v% dissolve CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.02w / v% of CoCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0.016w / v% of CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, the NiCl 2 ⁇ 6H 2 O of 0.012w / v% It was said.
  • palm oil was added all at once at a concentration of 10 g / L.
  • composition of the main culture medium 0.385w / v% of Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O , 0.067w / v% of KH 2 PO 4, 0.291w / v % of (NH 4) 2 SO 4, 0.1 w / v% of MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.5v / v% trace metal salt solution (1.6 w of 0.1N hydrochloric acid / v% of FeCl 3 ⁇ 6H 2 O, 1w / v% of CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.02w / v% of CoCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0.016w / v% of CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, the NiCl 2 ⁇ 6H 2 O of 0.012w / v% (Melted) and 0.05 w / v% BIOSPUREX 200K (antifoaming agent: manufactured by Cognis Japan Co., Ltd.).
  • the glycerol stock (50 ⁇ L) of the KNK-631 strain was inoculated into the seed medium (10 mL) and cultured at 30 ° C. for 24 hours to perform seed mother culture.
  • the obtained seed mother culture solution was inoculated at 1.0 v / v% into a 3 L jar fermenter (MDL-300 type manufactured by Maruhishi Bioengineer) containing 1.8 L of preculture medium.
  • the operating conditions were a culture temperature of 30 ° C., a stirring speed of 600 rpm, an aeration rate of 1.8 L / min, and the culture was performed for 24 hours while controlling the pH at 6.5, and pre-culture was performed.
  • a 14% aqueous solution of ammonium hydroxide was used for pH control.
  • the obtained preculture solution was inoculated at 1.0 v / v% into a 10 L jar fermenter (BMS-10L manufactured by Biot) containing 6 L of the production medium.
  • the operating conditions were a culture temperature of 34 ° C., a stirring speed of 600 rpm, an aeration rate of 6.0 L / min, and a pH controlled to 6.5.
  • a 14% aqueous solution of ammonium hydroxide was used for pH control.
  • PFAD in a molten state heated to 60 ° C. PFAD obtained from FELDA via SUS piping so as not to come into contact with iron piping was used. Melting point 50 ° C., density 0.87 g / mL, 25 ° C.
  • solubility 10 g / L The following) was sprayed into the liquid with an external mixing type two-fluid spray nozzle heated to 70 ° C., and the mixture was added while controlling the concentration in the culture liquid.
  • the air supplied to the two-fluid nozzle was heated to 60 ° C. and adjusted so that the air flow rate was 6 L / min (line speed 62.5 m / sec).
  • PFAD was added at a rate of 0.2 to 0.86 mL / min, and a phosphoric acid solution was added at a constant rate during the culture.
  • the ratio Vg / Vf of the jet velocity Vg of air to the jet velocity Vf of the fatty acid distillation in the molten state was 1250.
  • the main culture was carried out for 48 hours, and after the completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, washed with methanol, freeze-dried, and the weight of the dried cells was measured. 100 mL of chloroform was added to 1 g of the obtained dried cells, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours to extract PHBH in the cells. The cell residue was concentrated with an evaporator until the total volume reached 30 mL, 90 mL of hexane was gradually added, and the mixture was left for 1 hour with gentle stirring.
  • the precipitated PHBH was vacuum dried at 50 ° C. for 3 hours to obtain PHBH.
  • the productivity of PHBH and the yield of carbon source are shown in Table 3 below.
  • the productivity of PHBH is the yield of PHBH per volume of the culture solution (g / L), and the yield of carbon source is the yield of PHBH per supply weight of the carbon source (g / g).
  • Example 3 The culture was carried out under the same conditions and methods as in Example 15 except that the PFAD spray in the main culture was sprayed from the gas phase portion toward the liquid. The sprayed PFAD solidified on the water surface, and after agglomeration, adhered to the electrodes, stirring blades, and baffles inside the jar, and it was difficult to culture.
  • the melted lipids are sprayed into the culture solution with an external mixed two-fluid spray nozzle, so that the lipids have a temperature lower than the melting point of the lipids. It was found that the lipids were efficiently finely dispersed and granulated, and therefore the lipids were suitably assimilated by the microorganisms, and it was possible to efficiently produce microbial metabolites.
  • a method for producing lipid particles which obtains lipid particles by coagulating molten lipids into particles in a liquid.
  • the lipids have a solubility in water at 25 ° C. of 10 g / L or less and are solid at 25 ° C.
  • the two-fluid nozzle is heated to a temperature higher than the melting point of the lipids by 10 ° C. or more.
  • a method for producing lipid particles wherein the ratio D50 / Nd of the volume median diameter D50 of the lipid particles to the orifice diameter Nd of the liquid supply port of the two-fluid nozzle is 0.0017 or more and 0.17 or less. .. [2] The method for producing lipid particles according to [1], wherein the ratio Vg / Vf of the jet velocity Vg of the gas to the jet velocity Vf of the lipid in the molten state is 10 or more and 2000 or less.
  • [6] The method for producing lipid particles according to any one of [1] to [5], wherein the lipids are lipids derived from palm oil.
  • the method for producing lipid particles according to any one of [1] to [8], wherein the temperature of the molten lipid is 5 ° C. or higher higher than the melting point of the lipid.

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Abstract

本発明は、二流体ノズルの液体供給口から液中に溶融状態の脂質類を直接噴射するとともに、二流体ノズルの気体供給口から液中に気体を直接噴射することで、気体にて溶融状態の脂質類を液中に分散して粒子化しつつ凝固させて脂質類粒子を得る工程を含み、脂質類は、２５℃における水への溶解度が１０ｇ／Ｌ以下であり、かつ２５℃で固体であり、二流体ノズルは、前記脂質類の融点より１０℃以上高い温度に加熱されており、脂質類粒子の体積メジアン径Ｄ５０と前記二流体ノズルの液体供給口のオリフィス径Ｎｄの比Ｄ５０／Ｎｄが０．００１７以上０．１７以下である脂質類粒子の製造方法に関する。これにより、常温において水への溶解度が低く、かつ常温では固体である脂質類を液中に効率的に微分散させて液中で脂質類粒子を製造する脂質類粒子の製造方法及び微生物の製造方法を提供する。

Description

液中での脂質類粒子の製造方法及び微生物の培養方法
　本発明は、脂質類を液中で微粒子化する製造方法、詳しくは微生物によって資化されうるが水への溶解性の低い脂質類を液中で微粒子化する脂質類粒子の製造方法及び微生物の培養方法に関する。
　環境問題、食糧問題、健康及び安全に対する意識の高まり、並びに天然又は自然志向の高まり等を背景に、微生物の生産や微生物による物質製造（発酵生産、バイオ変換等）の意義及び重要性が益々高まっている。
　微生物の生産や微生物による物質の製造においては、微生物によって好適に資化される炭素源（培養、発酵等のための炭素源）が必要である。その炭素源の代表的なものとして、糖質、脂質類（例えば、脂肪酸を含む動植物油脂等）等が挙げられる。
　しかしながら、脂質類の中には微生物の培養温度よりも融点が高く、かつ、水への溶解度が極めて低いものがある。そのような脂質類は培養液中で凝固してしまうことから、微生物の資化性が低く、好適に利用することが出来なかった。例えば、高融点を有するラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等の脂肪酸の溶解度は、最も水への溶解度の高いラウリン酸でも水温２５℃では０．１ｇ／Ｌ以下である。
　微生物の培養温度よりも融点の高い炭素源として、脂肪酸やその塩を利用した生産例はいくつか報告されている。例えば、ラウリン酸を単独で炭素源として用い、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａを培養した例（非特許文献１）があるが、乾燥菌体量は約８ｇ／Ｌに留まっている。非特許文献１には、ラウリン酸は培養温度で固体であることが、培養の難易度を高めていると記載されている。
　脂肪酸を比表面積が大きくなるように水中油型乳化物の形態に調整して炭素源として培養液に供給することで、菌体生育を向上させた例も報告されている（特許文献１）。また、脂肪や油をその融点以上に加熱して培地に分散状態で添加し、微生物によるバイオ生成物の製造に用いた報告もある（特許文献２）。
国際公開第２０１３／０５７９６２号 国際公開第２０１３／０１６６９０号
Ｌｅｅ　Ｓ．，　ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７：２４０－２４４（２０００）
　しかしながら、特許文献１に記載の技術の場合、乳化剤、調製設備及び貯槽設備にかかる費用、乳化剤としてタンパク質を用いた際には貯蔵期間に制限がある点等、経済性の観点から工業生産への適用には課題も少なくない。また、油滴径を制御するためには培養槽の攪拌速度を制御する必要がある。しかしながら、培養槽の攪拌速度は培養液の酸素移動容量係数ｋＬａにも影響を及ぼすため、培養条件と油脂液滴径の両方について理想的な条件を達成するのは容易ではない。培養槽の外部で脂質粒子を作製し、培養液に添加する方法も考えられるが、製造工程が長大になり製造設備費等が高くなってしまう。
　また、特許文献２に記載の技術の場合、具体的には注射器注入による１ｍｍ程度の大きなＰＦＡＤ（脂肪酸蒸留物）粒子の分散例しか記載されておらず、脂肪酸の密度は水より低いので、培養液上部から噴霧により脂肪酸を滴下しようとしても液中には分散されにくく、加えて培養液が発泡していた場合はさらに困難性が増す。
　上記のように、培養温度よりも融点が高く、且つ、水への溶解度の低い脂質類を好適に利用し、微生物の生産や微生物による物質の生産を工業的に効率よく行うには課題が残されていた。
　本発明は、上記問題に鑑み、常温において水への溶解度が低く、かつ常温では固体である脂質類を該脂質類の融点より低い温度の液中に効率的に微分散させて液中で脂質類粒子を製造する脂質類粒子の製造方法及び微生物の製造方法を提供する。
　本発明は、１以上の実施形態において、溶融状態の脂質類を液中で粒子状に凝固させて脂質類粒子を得る脂質類粒子の製造方法であって、前記脂質類は、２５℃における水への溶解度が１０ｇ／Ｌ以下であり、かつ２５℃で固体であり、二流体ノズルの液体供給口から脂質類の融点より低い温度の液中に溶融状態の脂質類を直接噴射するとともに、二流体ノズルの気体供給口から前記液中に気体を直接噴射することで、前記気体にて前記溶融状態の脂質類を前記液中に分散させて粒子化しつつ凝固させて脂質類粒子を得る工程を含み、前記二流体ノズルは、前記脂質類の融点より１０℃以上高い温度に加熱されており、前記脂質類粒子の体積メジアン径Ｄ５０と前記二流体ノズルの液体供給口のオリフィス径Ｎｄの比Ｄ５０／Ｎｄが０．００１７以上０．１７以下であることを特徴とする脂質類粒子の製造方法に関する。
　本発明は、また、１以上の実施形態において、前記の脂質類粒子の製造方法によって、培養液中で脂質類粒子を調製し、前記脂質微粒子を含む培養液中で微生物を培養することを特徴とする微生物の培養方法に関する。
　本発明の製造方法によれば、常温（２５℃）において水への溶解度が低く、かつ常温では固体である脂質類を該脂質類の融点より低い温度の液中で効率的に微分散させて液中で脂質類粒子を製造することができる。
　また、本発明の培養方法によれば、常温において水への溶解度が低く、かつ常温では固体である脂質類を該脂質類の融点より低い温度の培養液中に効率的に微分散させて粒子化することで、該脂質類粒子が微生物によって好適に資化されることができ、それゆえ有用物質、例えばＰＨＡ等の微生物代謝産物を工業的に効率よく製造することが可能となる。
図1は、本発明の１以上の実施形態で用いる脂質類粒子の製造装置の概略図である。 図２は、実施例６～１４におけるＶｇ／Ｖｆ及びＰＦＡＤ粒子の体積メジアン径／液体供給口のオリフィス径のデータをプロットしたグラフである。
　本発明者らは、上述した課題を解決するため、鋭意検討を重ねた。その結果、脂質類の融点より１０℃以上高い温度に加熱されている二流体ノズルの液体供給口から脂質類の融点より低い温度の液中に溶融状態の脂質類を直接噴射するとともに、二流体ノズルの気体供給口から該液中に気体を直接噴射し、目的とする脂質類粒子の体積メジアン径Ｄ５０と液体供給口のオリフィス径Ｎｄの比Ｄ５０／Ｎｄが０．００１７以上０．１７以下になるようにすると、前記気体にて前記溶融状態の脂質類を該液中に微分散させかつ凝固させて脂質類粒子を得られ得ることを見出した。本発明の１以上の実施形態において、「液中」とは、水を主な溶媒とする水溶液又は水分散液を意味する。本発明の１以上の実施形態において、「水を主な溶媒とする」とは、溶媒が水を９０質量％以上含み、好ましくは水を９５質量％以上含み、より好ましくは水１００質量％からなることを意味する。本発明において、「溶融状態の脂質類」とは、脂質類の温度が融点以上であることを意味する。
　本発明の１以上の実施形態において、脂質類としては、２５℃での水への溶解度が１０ｇ／Ｌ以下であり、かつ２５℃で固体のものであれば、特に限定されない。例えば、微生物が資化可能なものであればいずれの脂質類も使用できる。前記脂質類としては、例えば、脂肪酸類、炭化水素類、ステロール類、及びこれらの混合物等が挙げられる。中でも、目的とする微生物が代謝経路を持つ脂質類を好適に用いることができる。
　脂肪酸類としては、例えば、脂肪酸、脂肪酸塩、脂肪酸エステル等が挙げられる。脂肪酸塩類としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、脂肪酸カルシウム、脂肪酸マグネシウム等が挙げられる。脂肪酸エステルとしては、例えば、脂肪酸グリセリンエステル等が挙げられる。脂肪酸グリセリンエステルとしては、例えば、トリグリセライド、ジグリセライド、モノグリセライド等が挙げられる。
　炭化水素類としては、例えば、パラフィン（パラフィンワックス）、ワックス、ポリエチレンワックス、ワセリン、セレシン等が挙げられる。ステロール類としては、例えば、コレステロール、２４－メチレンステロール等が挙げられる。
　前記脂質類は、動植物油脂類、又は動植物油脂由来の脂肪酸グリセリンエステル若しくは脂肪酸類であることが好ましい。また、食料問題への影響を考慮し、非可食用途の油脂類、脂肪酸類、廃油等を用いることがより好ましい。
　前記動植物油脂類としては、例えば、牛脂、豚脂、乳脂、魚油、大豆油、菜種油、ひまわり油、オリーブ油、ゴマ油、キャノーラ油、ピーナッツ油、桐油、こめ油、綿実油、米油、サフラワー油、ヤシ油、粗パーム油（Ｃｒｕｄｅ　Ｐａｌｍ　ｏｉｌ、ＣＰＯ）、粗パーム核油（Ｃｒｕｄｅ　ｐａｌｍ　ｋｅｒｎｅｌ　ｏｉｌ、ＣＰＫＯ）、パーム油、パーム核油、シア脂、サル脂、イリッペ脂、カカオ脂、ヤトロファ油、及び藻類由来の油脂類、並びにこれらの油脂の粗精製油、分別油、硬化油、及びエステル交換油等が挙げられる。より好ましくは、パーム油を分別した低融点分画であるパームオレイン、パームダブルオレイン等のパーム分別油、パーム核油を分別した低融点分画であるパーム核油オレイン等のパーム核分別油等が挙げられる。動植物油脂由来の脂肪酸類の例としては、上述した動植物油脂類の構成成分である脂肪酸、脂肪酸塩、脂肪酸エステル等が挙げられる。これらは単独又は２種類以上の組み合わせで用いることが出来る。
　具体的には、パーム油に由来する脂質類としては、例えば、粗パーム油、粗パーム核油、パーム油、パーム核油、パームオレイン、パームダブルオレイン、パーム核油オレイン、ＰＦＡＤ（パーム油脂肪酸留出物）、ＰＫＦＡＤ（パーム核油脂肪酸留出物）、ＰＯＭＥ（Palm Oil Mill Effluent、アブラヤシの果実から粗パーム油を得る過程で排出される廃液）、及びＥＦＢジュース（Empty Fruit Bunch Juice、アブラヤシの空果房から空果房ペレットを得る過程で得られる副産物）、並びにこれらの油脂の粗精製油、分別油、硬化油、及びエステル交換油等が挙げられる。
　また、前記動植物油脂類を精製処理する過程で副産物として生成する成分を利用することは、食糧との競合を避ける上で好ましい。精製処理における副産物としては、アルカリ脱酸工程で生成される脂肪酸塩類、蒸留脱酸工程で生成される蒸留残渣、脱臭工程で生成される蒸留残渣等が挙げられる。
　前記精製処理における副産物である脂肪酸塩類としては、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、脂肪酸カルシウム、脂肪酸マグネシウム等が挙げられる。より具体的には、例えば、ＰＦＡＤ（パーム油脂肪酸留出物）、ＰＫＦＡＤ（パーム核油脂肪酸留出物）、菜種油の脂肪酸蒸留物等が挙げられる。
　前記精製処理における副産物である蒸留残渣としては、主成分である脂肪酸の他に、モノグリセライド、ジグリセライド等を含んでもよい。
　本発明の１以上の実施形態において、脂質類は、例えば融点が３０℃以上１２０℃以下であることが好ましい。融点が３０℃以上であると、微生物が炭素源として利用しやすい。より好ましくは脂質類の融点は３５℃以上であり、さらに好ましくは３８℃以上であり、特に好ましくは４０℃以上である。融点が１２０℃以下であると、ノズル内において脂質類が凝固することが抑制されやすく、流路の閉塞が生じにくい。脂質類の融点は１００℃以下であることがより好ましく、８０℃以下であることがさらに好ましい。
　本発明の１以上の実施形態において、２５℃での水への溶解度が１０ｇ／Ｌ以下であり、かつ２５℃で固体の脂質類は、必要に応じて他の炭素源等の他の成分と組み合わせて用いてもよい。
　前記二流体ノズル（空気式スプレーノズル又は空気スプレーノズルとも称される。）としては、特に限定されず、目的とする脂質類粒子の体積メジアン径Ｄ５０と液体供給口のオリフィス径Ｎｄの比Ｄ５０／Ｎｄが０．００１７以上０．１７以下であり、液体を微粒子化することができる公知の二流体ノズルを適宜用いることができる。Ｄ５０／Ｎｄが０．００１７以上０．１７以下であると、微粒子化された、例えば、体積メジアン径が１ｍｍ未満である脂質類粒子を好適に作製することができる。脂質類粒子を微粒子化しやすい観点から、Ｄ５０／Ｎｄは０．００５以上０．１４以下であることがより好ましく、０．０１以上０．１０以下であることがさらに好ましく、０．０２以上０．０８以下であることが特に好ましい。
　前記二流体ノズルは、特に限定されないが、例えば、ノズルの目詰まりを抑制する観点から、液体と空気がノズル外で混合する外部混合形であることが好ましい。これにより、二流体ノズルの液体供給口から脂質類の融点より低い温度の液中に溶融状態の脂質類を直接噴射（供給）するとともに、二流体ノズルの気体供給口から該液中に気体を直接噴射することで、前記噴射された気体にて前記溶融状態の脂質類を該液中に分散して粒子化しつつ凝固させて脂質類粒子を得やすくなる。前記二流体ノズルは、溶融状態の脂質類及び気体を液中に直接噴射できるように、液体噴射孔及び気体噴射孔が、液面より低くかつ液中に位置するように取り付ければよい。前記二流体のノズルの材質は、特に限定されないが、例えば、培養液等の液中で安定性が高い等の観点から、ステンレス、セラミック、チタン等であることが好ましい。
　前記二流体ノズルは、前記脂質類の融点より１０℃以上高い温度に加熱されている。これにより、ノズル内で脂質類が凝固されることを抑制することができる。前記二流体ノズルの加熱温度は、前記脂質類の融点より１５℃以上高いことが好ましく、２０℃以上高いことがより好ましい。また、前記二流体ノズルの加熱温度は、特に限定されないが、例えば、培地の変性、微生物の培地中への分泌物の変性、微生物の細胞の変性ひいては生育への悪影響を引き起こすことを抑制する観点から、２００℃以下であることが好ましく、より好ましくは１８０℃以下、さらに好ましくは１６０℃以下である。加熱方法は特に限定されない。
　ノズルから噴射される液体のスプレーパターンについては、特に限定されないが、噴霧流量が大きく、粒子径分布が均等になりやすい観点から、円形のパターンが好ましい。
　前記二流体ノズルにおいて、特に限定されないが、例えば、液中において脂質類を微粒子化しやすい観点から、前記気体の噴射線速Ｖｇと前記溶融状態の脂質類の噴射線速Ｖｆの比Ｖｇ／Ｖｆは１０以上２０００以下であることが好ましく、１２以上１９００以下であることがより好ましく、１５以上１８００以下であることがさらに好ましく、１５以上１２００以下であることが特に好ましい。
　前記脂質類は、溶融された状態で液中に直接供給されればよく、特に限定されないが、ノズル中における脂質類の凝固を抑制し、微粒子化しやすい観点から、前記溶融状態の脂質類の温度は脂質類の融点より５℃以上高いことが好ましく、１０℃以上高いことがより好ましく、１５℃以上高いことがさらに好ましい。また、前記脂質類の温度は、特に限定されないが、例えば、培地の変性、微生物の培地中への分泌物の変性、微生物の細胞の変性ひいては生育への悪影響を引き起こすことを抑制する観点から、１５０℃以下であることが好ましく、より好ましくは１２０℃以下、さらに好ましくは９５℃以下である。加熱方法は特に限定されない。
　前記気体としては、特に限定されないが、例えば、好気培養を行う場合は、ノズルから噴射された気体を微生物への酸素供給に利用することができるため、空気、酸素、又はそれらの混合物を使用することが好ましい。嫌気培養を行う場合は、培養液中の溶存酸素濃度を低位に保つことができるため、窒素、又は空気と窒素の混合物を使用することが好ましい。水素細菌を培養する場合は、ノズルから噴射された気体を微生物への水素供給に利用することができるため、水素、又は空気と水素の混合物を使用することが好ましい。
　前記気体の温度は、特に限定されないが、例えば、ノズル中における脂質類の凝固を抑制し、液中において脂質類を微粒子化しやすい観点から、脂質類の融点以上であることが好ましく、脂質類の融点より５℃以上高いことがより好ましく、１０℃以上高いことがさらに好ましい。また、前記気体の温度は、特に限定されないが、例えば、培地の変性、微生物の培地中への分泌物の変性、微生物の細胞の変性ひいては生育への悪影響を引き起こすことを抑制する観点から、２００℃以下であることが好ましく、より好ましくは１８０℃以下、さらに好ましくは１６０℃以下である。加熱方法は特に限定されない。
　脂質類粒子を液中で広く分散させて、より効果的に微粒子化する観点から、溶融状態の脂質類粒子及び気体を直接供給する液を撹拌することが好ましい。撹拌は、例えば、プロペラ等を用いた撹拌機を用いて行うことができる。前記液の温度は、脂質類粒子の融点より低く、例えば２０℃以上であってもよく、培養液の場合は、例えば、２５℃以上３７℃以下であってもよい。
　前記脂質類粒子は、例えば、微生物が炭素源として資化しやすい観点から、体積メジアン径Ｄ５０が１５０μｍ以下であることが好ましく、８０μｍ以下であることがより好ましく、６０μｍ以下であることがさらに好ましく、４０μｍ以下であることが特に好ましい。また、前記脂質類粒子は、例えば、粒子化効率を高める観点から、体積メジアン径が１μｍ以上であることが好ましく、５μｍ以上であることがより好ましく、１０μｍ以上であることがさらに好ましい。
　前記脂質類粒子は、例えば、液中に分散しやすく、微生物が炭素源として資化しやすい観点から、粒子径分布において、下記数式（１）で表されるスパンが０．５以上３．０以下の範囲を満たすことが好ましく、０．８以上２．８以下であることがより好ましく、１．０以上２．５以下であることがさらに好ましい。
　スパン＝（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０  （１）
　本発明の１以上の実施形態において、脂質粒子の粒子径分布は、レーザ回折・散乱式測定方法で測定することができる。例えば、マイクロトラック製の粒子径分布測定装置「ＭＴ３３００ＥＸＩＩ」で測定することができる。
　微生物が炭素源として資化しやすい観点から、前記溶融状態の脂質類及び気体は、培養液中に直接供給して微粒子化することが好ましい。なお、前記溶融状態の脂質類及び気体の培養液中への供給は、一括で実施してもよいし、連続的又は間欠的に実施してもよい。また、前記溶融状態の脂質類と同時にその他の炭素源を培養液中に直接供給してもよい。
　上述した脂質類粒子の製造方法によって培養液中で脂質類粒子を調製し、該脂質類粒子を含む培養液中で微生物を培養することができる。
　前記微生物としては、特に限定されないが、例えば、生態系への悪影響がほとんどない環境調和型の生分解性プラスチックを生産することができる微生物等が挙げられる。中でも、植物由来の天然の有機酸や油脂を炭素源として生産され、細胞内にエネルギー蓄積物質として蓄積されるポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡとも記す。）を生産する微生物が好ましい。
　前記ＰＨＡは、３－ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする重合体の総称である。前記３－ヒドロキシアルカン酸としては特に限定されないが、例えば、３－ヒドロキシプロピオネート、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシバレレート、３－ヒドロキシヘキサノエート、３－ヒドロキシヘプタノエート、及び３－ヒドロキシオクタノエート等が挙げられる。前記ＰＨＡは、１種の３－ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする単独重合体であってもよく、２種以上の３－ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする共重合体であってもよい。前記共重合体としては、３－ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）と他の３－ヒドロキシアルカン酸との共重合体、少なくとも３－ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）をモノマーユニットとして含む３－ヒドロキシアルカン酸の共重合体等が挙げられる。前記ＰＨＡとしては、具体的には、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＨ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシバレレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－４－ヒドロキシブチレート）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシオクタノエート）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシオクタデカノエート）等が、工業的に生産が容易である点から、好ましい。
　前記ＰＨＡの生産に用いる微生物としては、ＰＨＡ類生産能を有する微生物であれば特に限定されない。天然から単離された微生物や菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物、又はそれらから調製し得る変異体や形質転換体等の遺伝子操作された微生物等を使用できる。
　具体的には、カピリアビダス・ネケータ（Cupriavidus necator）等のカピリアビダス属；アルカリゲネス・ラタス（Alcaligenes latas）等のアルカリゲネス属；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonasfluorescens）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・レジノボランス（Pseudomonas resinovorans）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）等のシュードモナス属；バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）等のバチルス属；アゾトバクター属；ノカルディア属；アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）等のアエロモナス属；ラルストニア（Ralstonia）属；ワウテルシア（Wautersia）属；コマモナス（Comamonas）属等が挙げられる（Microbiological Reviews, 54(4), 450-472 (1990)）。
　上述した微生物等の他にも、遺伝子工学的な手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にＰＨＡを生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。例えば、上記カピリアビダス属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、バチルス属、アゾトバクター属、ノカルディア属、アエロモナス属、ラルストニア属、ワウテルシア（Wautersia）属、コマモナス（Comamonas）属等に属する微生物のほかにも、エシェリキア（Escherichia）属等のグラム陰性の細菌、バチルス（Bacillus）属等のグラム陽性の細菌、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ヤロウィア（Yarrowia）属、キャンディダ（Candida）属等の酵母類等を好適に用いて人為的にＰＨＡを生産させる改変を施した生物細胞を得ることができる。
　ＰＨＡの中でもＰＨＢＨの生産に関しては、例えばAeromonas caviaeやAeromonas hydrophila等元来ＰＨＢＨを生産する微生物を用いる方法や、元来ＰＨＢＨを生産しない微生物に遺伝子工学的な手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にＰＨＢＨを生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。遺伝子を導入するホスト微生物としては、例えばCupriavidus necatorを好適に用いることができる。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子としては、Aeromonas caviae、Aeromonas hydrophilaやChromobacterium sp.由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子やそれらの改変体等を用いることができる。改変体としてはアミノ酸基が欠失、付加、挿入、若しくは置換されたＰＨＡ合成酵素をコードする塩基配列等を用いることができる。
　微生物の培養において、上述した脂質類粒子の製造方法で調整した脂質類粒子を含む培養液を用いる以外は、各微生物の通常の培養方法と同様の方法で培養することができる。具体的には、液体供給口及び気体供給口が、培養槽中の培養液の液面より低くかつ培養液中に位置するように二流体ノズルを培養槽に取り付けて培養液中で脂質類微粒子を調製して炭素源として供給する以外は、従来と同様の方法で微生物を培養することができる。
　前記培養方法で培養した微生物から周知の方法を用いてＰＨＡを回収することができる。例えば、次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水及びメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する。
　図１は、本発明の１以上の実施形態で用いる脂質類粒子の製造装置の概略図である。なお、本発明の製造方法で用いる製造装置は、図１に示されたものに限定されない。
　図１に示されているように、該製造装置２０は、培養槽等の容器１と二流体ノズル３を備えている。二流体ノズル３は、二流体ノズル３の液体供給口１２及び気体供給口１３が液面２より低く、かつ液中に位置するように容器１の壁面に取り付けられている。二流体ノズル３はヒーター４で温度を調整することができる。温度調節機能付きタンク５から、チューブポンプ６を用いて、温度調節機能付きライン７を通して二流体ノズル３の液体流路に供給される溶融状態の脂質類１０は、液体供給口（液体噴射孔）１２から液中に直接供給（噴射）されている。流量調整弁８、温度調整用ヒーター９を通して二流体ノズル３の気体流路に供給される気体１１は、気体供給口（気体噴射孔）１３から液中に直接供給（噴射）されている。二流体ノズル３の液体供給口１２から脂質類の融点より低い温度の液中に溶融状態の脂質類１０を直接供給するとともに、二流体ノズル３の気体供給口１３から該液中に気体１１を直接噴射し、噴射された気体１１にて噴射された溶融状態の脂質類１０を該液中に分散して粒子化しつつ凝固させて脂質類粒子１４を得ることができる。なお、目的とする脂質類粒子の体積メジアン径Ｄ５０と二流体ノズルの液体供給口のオリフィス径Ｎｄの比Ｄ５０／Ｎｄを０．００１７以上０．１７以下になるように調整する。該製造装置２０は、プロペラ付きの撹拌機１６を備えており、これにより、脂質類粒子１４を培養液中に均一に分散させることができる。１５は、排気ラインである。二流体ノズル３は、液体流路の周りを気体流路が囲む構造を有しており、気体が培養液による液体及び液体流路の冷却を防ぐ断熱材の働きを有する。特に、気体の温度が脂質類の融点より高い好ましい実施形態では、断熱材の働きがより高まる。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。以下において、特に指摘がない場合、操作は、２３℃、相対湿度６０％の条件下で行った。
　（実施例１）
　図１に示す製造装置を用いて脂質類粒子を作製した。２００Ｌ容器に１５０Ｌの水（２５℃）を入れ、二流体ノズルはノズル噴射口が容器下端より３００ｍｍ上方の壁面に位置し、液体供給口及び気体供給口が水平方向になり、かつ液中に位置するように設置した。二流体ノズルは円形スプレーパターン、ノズル材質はステンレス製である外部混合式二流体スプレーノズル（スプレーイングシステムズ製１／４ＪＡＵＣＯ、液フィード部（液体供給口）のオリフィス径は０．６ｍｍ、気体フィード部の円環面積は１．６×１０-6ｍ2）を用いた。二流体ノズルはあらかじめ７５～８０℃に加温しておいた。二流体ノズルに供給する空気は６０℃に加温し、通気量が１０Ｌ／分（線速１０４．２ｍ／秒）になるように調整した。容器内温度は３４℃にし、６０℃に加温した溶融状態の脂肪酸蒸留物（ＰＦＡＤ、融点５０℃、密度０．８７ｇ／ｍＬ、２５℃溶解度１０ｇ／Ｌ以下）を０．２～０．８６ｍＬ／分の速度（流量）で添加し、水中で凝固させた。空気の噴射線速Ｖｇと溶融状態の脂肪酸蒸留物の噴射線速Ｖｆの比Ｖｇ／Ｖｆは７１であった。６時間の長期運転を行ったところ、ノズル閉塞は起こらず脂質類粒子を作製することができた。実施例１において、得られたＰＦＡＤ粒子の粒度分布を粒度分布測定装置（マイクロトラック製ＭＴ３３００ＥＸＩＩ）で測定したところ、体積メジアン径（Ｄ５０）は２０．１μｍであり、スパン［（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０］は２．５１であり、ＰＦＡＤ粒子の体積メジアン径／液体供給口のオリフィス径は０．０３３であった。
　（比較例1）
　ノズルを非加熱にしたこと以外は、実施例1と同様の方法、条件で運転を行った。溶融状態の脂肪酸蒸留物及び空気の供給（噴霧）開始５分以内にはノズルが閉塞し、運転不可能となった。
　（実施例２～５）
　５Ｌジャーファーメンター（バイオット製ＢＭＳ－５Ｌ）に１Ｌの水（３４℃）を入れ、二流体ノズルはノズル噴射口が培養槽下端より５０ｍｍ上方の壁面に位置し、二流体ノズルに供給する空気は、通気量が６Ｌ／分（線速６２．５ｍ／秒）になるように調整し、ＰＦＡＤ５ｇを１ｍＬ／分の速度（線速０．０６ｍ／秒）で添加し、ノズル温度及びＰＦＡＤ温度を下記表１に示したとおりにした以外は実施例１と同様の方法、条件で脂肪酸粒子を得た。実施例２～５において、空気の噴射線速Ｖｇと溶融状態の脂肪酸蒸留物の噴射線速Ｖｆの比Ｖｇ／Ｖｆは１０６０であった。得られたＰＦＡＤ粒子の粒度分布を粒度分布測定装置（マイクロトラック製ＭＴ３３００ＥＸＩＩ）で測定し、その結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例６～１３）
　１０Ｌジャーファーメンター（バイオット製ＢＭＳ－１０Ｌ）に３．５Ｌ水を入れ、脂肪酸蒸留物（ＰＦＡＤ、融点５０℃、密度０．８７ｇ／ｍＬ、２５℃溶解度１０ｇ／Ｌ以下）５２．５ｇを添加し、二流体ノズルに供給する空気の通気量を１０Ｌ／分（線速１０４．２ｍ／秒）となるように調整し、ＰＦＡＤの添加速度（ＰＦＡＤの流量）を下記表２に示したとおりにした以外は実施例１と同様の方法、条件で脂肪酸粒子を得た。得られたＰＦＡＤ粒子の粒度分布を粒度分布測定装置（マイクロトラック製ＭＴ３３００ＥＸＩＩ）で測定し、その結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（実施例１４）
　１０Ｌジャーファーメンター（バイオット製ＢＭＳ－１０Ｌ）に３．５Ｌの水（３４℃）を入れ、脂肪酸蒸留物（ＰＦＡＤ、融点５０℃、密度０．８７ｇ／ｍＬ、２５℃溶解度１０ｇ／Ｌ以下）５２．５ｇを添加し、二流体ノズルに供給する空気の通気量を６Ｌ／分（線速６２．５ｍ／秒）となるように調整し、ＰＦＡＤの添加速度を２０．２ｍＬ／分の速度（線速１．１９ｍ／秒）で添加した以外は実施例１と同様の方法、条件で脂肪酸粒子を得た。空気の噴射線速Ｖｇと溶融状態の脂肪酸蒸留物の噴射線速Ｖｆの比Ｖｇ／Ｖｆは５２であった。得られたＰＦＡＤ粒子の粒度分布を粒度分布測定装置（マイクロトラック製ＭＴ３３００ＥＸＩＩ）で測定したところ、体積メジアン径（Ｄ５０）は３１．５μｍであり、スパン［（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０］は１．２９であり、ＰＦＡＤ粒子の体積メジアン径／液体供給口のオリフィス径は０．０５３であった。
　図２に実施例６～１４におけるＶｇ／Ｖｆ及びＰＦＡＤ粒子の体積メジアン径／液体供給口のオリフィス径のデータをプロットしたグラフを示した。図２から、二流体ノズルによるＰＦＡＤ液中噴霧では、Ｖｇ／ＶｆとＰＦＡＤ粒子の体積メジアン径／液体供給口のオリフィス径が相関していることが分かる。
　（比較例２）
　直径１０ｃｍの円筒状容器に１Ｌの水（３４℃）を入れ、水面から５ｃｍの高さに外部混合式二流体スプレーノズルの射出孔を設置し、ノズルより水面に向かってＰＦＡＤを射出した以外は実施例１４と同様の方法、条件で噴霧を行った。ＰＦＡＤは水面で固まり、かつ凝集し、直径３ｍｍ以上の粗大粒子が得られた。
　以上より、外部混合式二流体スプレーノズルによる溶融状態の脂質類を液中に分散させる場合、液中にて噴霧する必要があり、かつ加熱したノズルを用いる必要があることが示された。
　（実施例１５）
　（外部混合式二流体スプレーノズルによる脂質液中噴霧を利用した菌体培養）
　培養生産にはＫＮＫ－６３１株（特開２０１３－００９６２７号公報及び国際公開２０１６／１１４１２８号を参照）を用い、種母培養、前培養、本培養を行い、菌体を回収した。
　種母培地の組成は、１ｗ／ｖ％のＭｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％のＢａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％のＹｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％のＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、及び０．１５ｗ／ｖ％のＫＨ2ＰＯ4とし、ｐＨを６．８とした。
　前培養培地の組成は、１．１ｗ／ｖ％のＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％のＫＨ2ＰＯ4、１．２９ｗ／ｖ％の（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１ｗ／ｖ％のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｖ／ｖ％の微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％のＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、１ｗ／ｖ％のＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％のＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％のＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％のＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源としてはパーム油を１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
　本培養培地の組成は、０．３８５ｗ／ｖ％のＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％のＫＨ2ＰＯ4、０．２９１ｗ／ｖ％の（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１ｗ／ｖ％のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｖ／ｖ％の微量金属塩溶液（０．１Ｎの塩酸に１．６ｗ／ｖ％のＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、１ｗ／ｖ％のＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％のＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％のＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％のＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏを溶かしたもの。）、及び０．０５ｗ／ｖ％のＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。
　まず、ＫＮＫ－６３１株のグリセロールストック（５０μＬ）を種母培地（１０ｍＬ）に接種して３０℃で２４時間培養し種母培養を行なった。
　得られた種母培養液を、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．５にコントロールしながら２４時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
　次に、得られた前培養液を、６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（バイオット製ＢＭＳ－10Ｌ）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３４℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．５にコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。６０℃に加温した溶融状態のＰＦＡＤ（ＦＥＬＤＡ社から、鉄配管に接触しないようにＳＵＳ配管経由で入手したＰＦＡＤを用いた。融点５０℃、密度０．８７ｇ／ｍＬ、２５℃溶解度１０ｇ／Ｌ以下）を、７０℃に加熱した外部混合式二流体スプレーノズルで液中に噴霧し、培養液中の濃度を制御しつつ流加した。実施例１と同一の二流体スプレーノズルを用い、二流体ノズルに供給する空気は６０℃に加温し、通気量が６Ｌ／分（線速６２．５ｍ／秒）になるように調整した。ＰＦＡＤを０．２～０．８６ｍＬ／分の速度で添加し、培養途中からリン酸溶液を一定速度で流加した。空気の噴射線速Ｖｇと溶融状態の脂肪酸蒸留物の噴射線速Ｖｆの比Ｖｇ／Ｖｆは１２５０であった。本培養は４８時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍＬのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＢＨを抽出した。菌体残渣をエバポレーターで総容量が３０ｍＬになるまで濃縮後、９０ｍＬのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＢＨを５０℃で３時間真空乾燥し、ＰＨＢＨを得た。ＰＨＢＨの生産性、および、炭素源収率を下記表３に示した。なお、ＰＨＢＨの生産性は、培養液の体積あたりのＰＨＢＨの収量（ｇ／Ｌ）であり、炭素源収率は、炭素源の供給重量あたりのＰＨＢＨの収量（ｇ／ｇ）である。
　（比較例３）
　本培養におけるＰＦＡＤ噴霧を気相部から液中に向けて噴霧した以外は実施例１５と同様の条件、方法で培養を行った。噴霧されたＰＦＡＤは水面で固化、且つ凝集後にジャー内部の電極、攪拌翼、バッフルに付着し培養することは困難であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以上の結果より、培養温度より融点の高い脂質類の場合、融解した脂質類を外部混合式二流体スプレーノズルで培養液中に噴霧することで、該脂質類の融点より低い温度の培養液中で脂質類が効率的に微分散して粒子化され、それゆえ、脂質類が微生物によって好適に資化され、微生物代謝産物を効率よく製造することが可能であることが分かった。
　本発明は、例えば、下記の１以上の実施形態を含む。
　［１］　溶融状態の脂質類を液中で粒子状に凝固させて脂質類粒子を得る脂質類粒子の製造方法であって、
　前記脂質類は、２５℃における水への溶解度が１０ｇ／Ｌ以下であり、かつ２５℃で固体であり、
　二流体ノズルの液体供給口から脂質類の融点より低い温度の液中に溶融状態の脂質類を直接噴射するとともに、二流体ノズルの気体供給口から前記液中に気体を直接噴射することで、前記気体にて前記溶融状態の脂質類を前記液中に分散して粒子化しつつ凝固させて脂質類粒子を得る工程を含み、
　前記二流体ノズルは、前記脂質類の融点より１０℃以上高い温度に加熱されており、
　前記脂質類粒子の体積メジアン径Ｄ５０と前記二流体ノズルの液体供給口のオリフィス径Ｎｄの比Ｄ５０／Ｎｄが０．００１７以上０．１７以下であることを特徴とする、脂質類粒子の製造方法。
　［２］　前記気体の噴射線速Ｖｇと前記溶融状態の脂質類の噴射線速Ｖｆの比Ｖｇ／Ｖｆは１０以上２０００以下である、［１］に記載の脂質類粒子の製造方法。
　［３］　前記脂質類粒子の体積メジアン径Ｄ５０が１μｍ以上１５０μｍ以下である、［１］又は［２］に記載の脂質類粒子の製造方法。
　［４］　前記脂質類粒子の粒子径分布において、下記数式（１）で表されるスパンが０．５以上３．０以下の範囲を満たす、［１］～［３］のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法。。
　スパン＝（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０  （１）
　［５］　前記脂質は、融点が３５℃以上である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法。
　［６］　前記脂質類が、パーム油に由来する脂質類である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法。
　［７］　前記気体の温度が、前記脂質類の融点以上であり、かつ２００℃以下である、［１］～［６］のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法。
　［８］　前記気体が空気である、［１］～［７］のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法。
　［９］　前記溶融状態の脂質類の温度が前記脂質類の融点より５℃以上高い、［１］～［８］のいずれか1項に記載の脂質類粒子の製造方法。
　［１０］　溶融状態の脂質類を微生物培養液中で粒子状に凝固させる、［１］～［９］のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法。
　［１１］　前記微生物培養液がポリヒドロキシアルカノエート類を生産する菌体の培養液である、［１０］に記載の脂質類粒子の製造方法。
　［１２］　［１］～［１１］のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法によって、培養液中で脂質類粒子を調製し、前記脂質微粒子を含む培養液中で微生物を培養することを特徴とする微生物の培養方法。
　１　容器（培養槽）
　２　液面（培養液の液面）
　３　二流体ノズル
　４　ヒーター
　５　温度調節機能付きタンク
　６　チューブポンプ
　７　温度調節機能付きライン
　８　流量調整弁
　９　温度調整用ヒーター
　１０　溶融状態の脂質類
　１１　気体
　１２　液体供給口（液体噴射孔）
　１３　気体供給口（気体噴射孔）
　１４　脂質類粒子
　１５　排気ライン
　１６　プロペラ付きの撹拌機
　２０　脂質類粒子の製造装置

Claims (12)

  1. 　溶融状態の脂質類を液中で粒子状に凝固させて脂質類粒子を得る脂質類粒子の製造方法であって、
    　前記脂質類は、２５℃における水への溶解度が１０ｇ／Ｌ以下であり、かつ２５℃で固体であり、
    　二流体ノズルの液体供給口から脂質類の融点より低い温度の液中に溶融状態の脂質類を直接噴射するとともに、二流体ノズルの気体供給口から前記液中に気体を直接噴射することで、前記気体にて前記溶融状態の脂質類を前記液中に分散して粒子化しつつ凝固させて脂質類粒子を得る工程を含み、
    　前記二流体ノズルは、前記脂質類の融点より１０℃以上高い温度に加熱されており、
    　前記脂質類粒子の体積メジアン径Ｄ５０と前記二流体ノズルの液体供給口のオリフィス径Ｎｄの比Ｄ５０／Ｎｄが０．００１７以上０．１７以下であることを特徴とする、脂質類粒子の製造方法。
  2. 　前記気体の噴射線速Ｖｇと前記溶融状態の脂質類の噴射線速Ｖｆの比Ｖｇ／Ｖｆは１０以上２０００以下である、請求項１に記載の脂質類粒子の製造方法。
  3. 　前記脂質類粒子の体積メジアン径Ｄ５０が１μｍ以上１５０μｍ以下である、請求項１又は２に記載の脂質類粒子の製造方法。
  4. 　前記脂質類粒子の粒子径分布において、下記数式（１）で表されるスパンが０．５以上３．０以下の範囲を満たす、請求項１～３のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法。。
    　スパン＝（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０  （１）
  5. 　前記脂質は、融点が３５℃以上である、請求項１～４のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法。
  6. 　前記脂質類が、パーム油に由来する脂質類である、請求項１～５のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法。
  7. 　前記気体の温度が、前記脂質類の融点以上であり、かつ２００℃以下である、請求項１～６のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法。
  8. 　前記気体が空気である、請求項１～７のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法。
  9. 　前記溶融状態の脂質類の温度が前記脂質類の融点より５℃以上高い、請求項１～８のいずれか1項に記載の脂質類粒子の製造方法。
  10. 　溶融状態の脂質類を微生物培養液中で粒子状に凝固させる、請求項１～９のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法。
  11. 　前記微生物培養液がポリヒドロキシアルカノエート類を生産する菌体の培養液である、請求項１０に記載の脂質類粒子の製造方法。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の脂質類粒子の製造方法によって、培養液中で脂質類粒子を調製し、前記脂質微粒子を含む培養液中で微生物を培養することを特徴とする微生物の培養方法。
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