DE69733490T2

DE69733490T2 - Verfahren zur polyestern-biosynthese

Info

Publication number: DE69733490T2
Application number: DE69733490T
Authority: DE
Inventors: Silke Hein; Brigitte SÖHLING; Gerhard Gottschalk; Alexander Steinbüchel
Original assignee: Metabolix Inc
Current assignee: Yield10 Bioscience Inc
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1997-03-03
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2017-03-04
Also published as: EP0958367A1; WO1998039453A1; ATE297469T1; AU2324097A; DE69733490D1; EP0958367B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft generell das Gebiet der Molekularbiologie. Bestimmte Ausführungsformen beinhalten Materialien und Methoden, die zur Biosynthese von Biopolymeren, nämlich von Polyhydroxyfettsäure-Polymeren, geeignet sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Produktion intrazellulärer Polyester, die zur Klasse von Polymeren gehören, die als Polyhydroxyalkanoate (Polyhydroxyfettsäuren) bekannt sind, ist bei vielen verschiedenen prokaryotischen Organismen beobachtet worden (Anderson, A.J. und Dawes, E.A. (1990), Microbiol. Rev. 54: 450–472, Steinbüchel, A. und Valentin, H.E. (1995), FEMS Microbiol. Rev. Lett. 128: 219–228). Die Monomere, die die Polyester ausmachen, liegen im Längenbereich von C4 (3-Hydroxybutyrat) bis C12 (3-Hydroxydodecanoat) (Lageveen, R.G. el al. (1988), Appl. Env. Microbiol. 54: 2924–2932). Diese Polyester haben beträchtliches Interesse hervorgerufen, da sie biologisch abbaubar sind. Potenzielle technische Anmeldungen gibt es in der Industrie und in der Landwirtschaft sowie bezüglich medizinischer Vorrichtungen und Verfahren (Hocking, P.J. und Marchessault, R.H. (1994), Biopolyesters, in: G.J.L. Griffin (Hrsg.) Chemistry and technology of biological degradable polymers, Chapman & Hall, London, S. 48–96, Müller, H.M. und Seebach, D. (1993), Angew. Chem. 105:483–509). Außerdem ist diese Klasse von Polyestern als eine potenzielle Alternative zu herkömmlichen, petrochemisch gewonnenen Kunststoffen attraktiv.
Polyhydroxyfettsäuren sind im Großen und Ganzen durch die Monomere, die ihr Rückgrat ausmachen, gekennzeichnet. Polymere, die aus C4-C5-Einheiten aufgebaut sind, werden als kurzkettige (short chain length, scl) Polyhydroxyfettsäuren klassifiziert. Polymere, die Monomere aus C6-Einheiten und darüber enthalten, werden als Polyhydroxyfettsäuren mittlerer Kettenfänge (medium chain length, mcl) klassifiziert. Die Primärstruktur des Polymers beeinflusst die physikalischen Eigenschaften des Polyesters.
Die zur Bildung von Polyhydroxyfettsäuren führenden Metabolismuswege sind nicht für alle Organismen aufgeklärt worden. Der am besten untersuchte Biosyntheseweg einer Polyhydroxyfettsäure ist der von Alcaligenes (Peoples, O.P. et al. (1989), J. Biol. Chem. 264:15298–15303, Valentin, H.E. et al. (1995), Eur. J. Biochem. 227:43–60). Dieser Organismus ist fähig, entweder ein C4-Homopolymer (Polyhydroxybutyrat, PHB) oder ein C4-C5-Copolymer (PHB-PHV, Polyhydroxybutyrat-Polyhydroxyvalerat) (Koyama, N. und Doi, Y. (1995), Biotechnol. Lett. 17:281–284) zu bilden. Somit wird A. eutrophus als ein scl-Polyhydroxyfettsäure-Organismus klassifiziert. Ähnlich erzeugen Pseudomonas-Spezies ein Polymer, das aus Monomeren zusammengesetzt ist, deren Länge von C6 bis C12 reicht (Timm, A. und Steinbüchel, A. (1990), Appl. Environ. Microbiol. 56: 3360, Lageveen, R.G. et al. (1988), Appl. Env. Microbiol. 54: 2924–2932), und sie werden als mcl-Polyhydroxyfettsäure-Organismen klassifiziert.
Die Polymerisation der Hydroxyacyl-CoA-Substrate erfolgt durch Polyhydroxyfettsäure-Synthasen. Die Substratspezifität dieser Enzymklasse variiert über das Spektrum der Polyhydroxyfettsäure-erzeugenden Organismen. Diese Variation der Substratspezifität von Polyhydroxyfettsäure-Synthetasen wird durch indirekte Hinweise gestützt, die in Untersuchungen zur heterologen Expression erhalten wurden (Lee, E.Y. et al. (1995), Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 901–909, Timm, A. el al. (1990), Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 296–301). Somit wird die Struktur des Rückgrats des Polymers stark durch die Polyhydroxyfettsäure-Synthase, die für seine Bildung verantwortlich ist, beeinflusst.
Fluoreszierende Pseudomonaden, die zur rRNA-Homologiegruppe I gehören, können große Mengen an Polyhydroxyfettsäuren (PHA), die aus verschiedenen gesättigten und ungesättigten Hydroxyfettsäuren mit Längen der Kohlenstoffkette im Bereich von 6 bis 14 Kohlenstoffatomen zusammengesetzt sind, synthetisieren und akkumulieren (Steinbüchel, A. und Valentin. H.E. (1992), FEMS Microbiol Rev. 103: 217). Die aus diesen Bakterien isolierte Polyhydroxyfettsäure enthält auch Bestandteile mit funktionellen Gruppen wie verzweigten, halogenierten und aromatischen Seitenketten oder Nitril-Seitenketten (Steinbüchel und Valentin (1995), FEMS Microbiol. Lett. 128: 219–228). Die Zusammensetzung der Polyhydroxyfettsäure hängt vom System der Polyhydroxyfettsäure-Polymerase, der Kohlenstoffquelle und den Stoffwechselwegen ab (Anderson, A.J. und Dawes, E.A. (1990), Microbiol. Rev. 54: 450–472, Eggink et al. (1992), FEMS Microbiol. Rev. 105: 759, Huisman, A.M. et al. (1989), Appl. Microbiol. Biotechnol. 55: 1949–1954, Lenz, O. et al. (1992), J. Bacteriol. 176:4385–4393, Steinbüchel, A. und Valentin, H.E. (1995), FEMS Microbiol. Lett. 128: 219–228). In P. putida kommen wenigstens drei verschiedene Stoffwechselwege zur Synthese von 3-Hydroxyacyl-CoA-Thioestern vor, die die Substrate der Polyhydroxyfettsäure-Synthase sind (Huijberts, G.N.M. et al. (1994), J. Bacteriol. 176: 1661–1666): (i) Die β-Oxidation ist der Hauptweg, wenn Fettsäuren als Kohlenstoffquellen verwendet werden; (ii) Die De-novo-Fettsäurebiosynthese ist der Hauptweg bei einem Wachstum auf Kohlenstoffquellen, die zu Acetyl-CoA metabolisiert werden, wie Gluconat, Acetat oder Ethanol; und (iii) eine Kettenverlängerungsreaktion, bei der Acyl-CoA mit Acetyl-CoA zu dem um zwei Kohlenstoffe verlängerten β-Keto-Produkt kondensiert wird, das dann zu 3-Hydroxyacyl-CoA reduziert wird. Dieser letztere Weg ist in die Polyhydroxyfettsäure-Synthese beim Wachstum auf Hexanoat involviert.
Das Strukturgen der Polyhydroxyfettsäure-Synthase aus Alcaligenes eutrophus (phaC_Ae) ist in verschiedenen Labors kloniert und auf molekularer Ebene charakterisiert worden (bezüglich einer Übersichtsarbeit siehe Steinbüchel, A. und Schlegel. H.G. (1991), Mol. Microbiol. 5: 535–542; GenBank Accession number J05003). Es wurde gezeigt, dass phaC_Ae in Kombination mit anderen Genen die Fähigkeit zur Synthese von Poly(3-hydroxybuttersäure) nicht nur vielen Bakterien verlieh, die diese Polyester nicht synthetisieren, wie z.B. Escherichia coli (Steinbüchel, A. und Schlegel, H.G. (1991), Mol. Microbiol. 5: 535–542), sondern auch Saccharomyces cerevisiae (Leaf, T.A. et al. (1996), Microbiology 142: 1169–1180), Pflanzen wie Arabidopsis thaliana (Poirier, Y. el al. (1992), Science 256: 520–523.) und Gossypium hirsutum (John, M.E. und Keller, G. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12768–12773) und sogar Zellen des Insekts Spodoptera frugiperda (Williams, M.D. et al. (1996), Appl. Environ. Microbiol. 62: 2540–2546).
Die Entwicklung biologischer Systeme, die Poly(4-hydroxybuttersäure), Poly(3-hydroxybuttersäure-co-4-hydroxybuttersäure) und andere Polyestermaterialien synthetisieren, wäre sehr nützlich. Biologische Systeme stellen das Potenzial zur Erzeugung signifikanter Mengen wichtiger Materialien bereit, während gleichzeitig kostengünstige Ausgangsmaterialien eingesetzt werden und die Bildung gefährlicher Nebenprodukte minimiert wird.
Es besteht ein Bedarf an neuartigen Biosynthesewegen für Polymere von potenziellem kommerziellem Interesse, die nicht von Ausgangsmaterialien auf Petroleumbasis abhängig sind. Biologische Verfahren stellen eine attraktive Alternative zu chemischen Verfahren dar, die potenziell schädliche Nebenprodukte erzeugen und gleichzeitig nicht-erneuerbare Ressourcen verbrauchen.
ZUSAMMENFASSUNG
Diese Erfindung betrifft Materialien und Methoden zur Herstellung von Polyestermaterialien. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Materialien und Methoden zur Herstellung von Polyestermaterialien, vorzugsweise von Poly(4-hydroxybuttersäure), Poly(3-hydroxybuttersäure) und Poly(3-hydroxybuttersäure-co-4-hydroxybuttersäure). Die Erfindung stellt Nucleinsäureabschnitte, die für ein rekombinantes Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein und ein rekombinantes Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein codieren, oder ein Acyl-CoA-Synthetase-Protein, rekombinante Vektoren, Zellen, die die Nucleinsäureabschnitte enthalten sowie Verfahren zur Herstellung von Polyestermaterialien bereit.
Der Umfang der vorliegenden Erfindung wird anhand der unten bereit gestellten detaillierten Beschreibungen klarer werden. Es sollte jedoch klar sein, dass die folgende detaillierte Beschreibung und die Beispiele, die zwar bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung angeben, nur zum Zwecke der Veranschaulichung gebracht werden, da verschiedene Veränderungen und Modifikationen im Rahmen des Geistes und Umfangs der vorliegenden Erfindung für Fachleute mit dem üblichen Wissen auf diesem Gebiet aufgrund der detaillierten Beschreibung offensichtlich sein werden.
Definitionen
Die folgenden Definitionen werden bereit gestellt, um Fachleuten auf diesem Gebiet das Verständnis der detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung zu erleichtern.
Ein „Acyl-CoA-Synthetase=" oder „Thiokinase"-Protein katalysiert die Bildung einer Thioesterbindung zwischen der Carboxygruppe einer Fettsäure und der Sulfhydrylgruppe von CoA.
Ein „Acylkinase"-Protein katalysiert den Transfer einer Phosphatgruppe von ATP auf eine Carboxylatgruppe gemäß der Reaktion:
wobei R eine Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe ist.
„CoA" bezieht sich auf Coenzym-A.
Der Begriff „Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase" bezieht sich auf ein Protein, das den Transfer einer Acylgruppe gemäß der folgenden Reaktion katalysiert:
wobei R¹ und R² Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppen sind. Die Gruppen R¹ und R² können ferner eine oder mehrere Doppelbindung(en), Dreifachbindung(en) oder aromatische Gruppe(n) enthalten.
„Copolyester" bezieht sich auf ein Polyestermaterial, das aus zwei verschiedenen monomeren Blöcken aufgebaut ist. Zum Beispiel ist Poly(3-hydroxybuttersäure-co-4-hydroxybuttersäure) ein Polyester, der aus 3-Hydroxybuttersäure und 4-Hydroxybuttersäure aufgebaut ist. Die relative Zusammensetzung der beiden Monomerblöcke im Copolyester kann variabel sein. Copolyester werden üblicherweise durch die relativen prozentualen Anteile der beiden Monomerblöcke charakterisiert. Die prozentuale Zusammensetzung kann die physikalischen Charakteristika des Copolyesters beeinflussen.
„Dimer" bezieht sich auf Enzyme, die aus zwei Untereinheiten aus Proteinmolekülen bestehen. Die beiden Untereinheiten können identische (homodimere) oder verschiedene (heterodimere) Sequenzen umfassen.
„Heterolog" bezieht sich auf Nucleotidabschnitte, die in der Natur normalerweise nicht im gleichen Organismus vorkommen.
„Homopolyester" bezieht sich auf ein Polyestermaterial, das aus nur einem Monomerblock aufgebaut ist. Zum Beispiel ist Poly(4-hydroxybuttersäure) ein Polyester, der aus 4-Hydroxybuttersäure aufgebaut ist.
Ein „4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase"-Protein katalysiert die Umwandlung von Succinatsemialdehyd in 4-Hydroxybutyrat.
Die Kombination aus einem „2-Methylcitrat-Dehydratase"-Protein und einem „2-Methylisocitrat-Dehydratase"-Protein katalysiert die Umwandlung von 2-Methylcitrat in 2-Methylisocitrat.
Ein „2-Methylcitrat-Synthase"-Protein katalysiert die Umwandlung von Propionyl-CoA und Oxalacetat in 2-Methylcitrat.
Ein „2-Methylisocitrat-Lyase"-Protein katalysiert die Umwandlung von 2-Methylisocitrat in Pyruvat und Succinat.
Die Begriffe „Mikrobe", „Mikroorganismus", und „mikrobiell" beziehen sich auf Algen, Bakterien, Pilze und Protozoen.
„Monomer" bezieht sich auf Enzyme, die aus nur einem Proteinmolekül bestehen.
„Nativ" bezieht sich auf zwei Nucleinsäureabschnitte, die natürlicherweise im gleichen Organismus vorkommen. Zum Beispiel ist ein nativer Promotor der Promotor, der natürlicherweise mit einem gegebenen Gen in einem Organismus gefunden wird.
„Nucleinsäure" bezieht sich auf Desoxyribonucleinsäure (DNA) und Ribonucleinsäure (RNA).
„Überexpression" bezieht sich auf die Expression eines Polypeptids oder Proteins, das von einer DNA codiert wird, die in eine Wirtszelle eingeführt wurde, wobei das genannte Polypeptid oder Protein entweder normalerweise nicht in der Wirtszelle vorkommt, oder wobei das genannte Polypeptid oder Protein in der genannten Wirtszelle in einer höheren Menge vorkommt, als sie normalerweise vom endogenen Gen exprimiert wird, das für das genannte Polypeptid oder Protein codiert.
Ein „2-Ketoglutarat-Decarboxylase"-Protein katalysiert die Umwandlung von 2-Ketoglutarat in Succinatsemialdehyd.
Ein „Phosphotransacylase"-Protein katalysiert den Transfer einer phosphorylierten Acylgruppe auf CoA gemäß der Reaktion:
Die Ausdrücke „Gene der Polyhydroxyfettsäurebiosynthese" und „Enzyme der Polyhydroxyfettsäurebiosynthese" beziehen sich auf diejenigen Gene oder Enzyme, die zu anabolischen Reaktionen auf dem Weg der Erzeugung von Polyhydroxyfettsäuren führen.
Der Ausdruck „Polyhydroxyalkanoatsynthase" („PHA-Synthase") bezieht sich auf Enzyme, die Hydroxyacyl-CoAs in Polyhydroxyalkanoate und freies CoA umwandeln.
Der Begriff „Promotor" oder „in Bakterien funktioneller Promotor" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die gewöhnlich stromaufwärts (5') einer codierenden Sequenz gefunden wird und die Expression der codierenden Sequenz steuert, indem sie die Bildung einer Messenger-RNA (mRNA) steuert, indem sie die Erkennungsstelle für die RNA-Polymerase und/oder andere Faktoren bereit stellt, die für den Start der Transkription an der richtigen Stelle erforderlich sind. Die hier offenbarten Promotoren, und biologisch funktionelle Äquivalente von ihnen, sind für das Steuern der Transkription codierender Sequenzen unter ihrer Steuerung, nach ihrer Einführung in eine Bakterienzelle, wie es anhand ihrer Fähigkeit zur Erzeugung von mRNA gezeigt wird, verantwortlich.
Die Begriffe „rekombinanter Vektor" und „Vektor" beziehen sich auf beliebige Agenzien, wie ein Plasmid, Cosmid, Virus, eine autonom replizierende Sequenz, einen Phagen oder eine lineare oder ringförmige einzelsträngige oder doppelsträngige DNA- oder RNA-Nucleotidsequenz, die aus einer beliebigen Quelle stammt, fähig zur Integration in das Genom oder zur autonomen Replikation ist und ein DNA-Molekül umfasst, bei dem eine oder mehrere DNA-Sequenzen) auf funktionelle Weise („operativ") verknüpft wurden. Derartige rekombinante DNA-Konstrukte oder Vektoren sind zur Einführung einer 5'-regulatorischen Sequenz oder einer Promotorregion und einer DNA-Sequenz für ein ausgewähltes Genprodukt in eine Zelle auf eine Weise geeignet, dass die DNA-Sequenz in eine funktionelle mRNA transkribiert wird, die translatiert und damit exprimiert wird.
Ein „Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase"-Protein katalysiert die Umwandlung von Succinyl-CoA in Succinatsemialdehyd.
Ein „Succinat:Acetyl-CoA-Transferase"-Protein katalysiert die Umwandlung von Succinat in Succinyl-CoA.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VERANSCHAULICHENDER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges Verfahren zur Herstellung von Polyestermaterialien bereit. Bei einer wichtigen Ausführungsform ermöglichen die Coexpression eines rekombinanten Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Gens und eines rekombinanten Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Gens in einer Zelle die Biosynthese von Poly(4-hydroxybuttersäure). Bei einer alternativen Ausführungsform führt die Coexpression eines rekombinanten Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Gens und eines rekombinanten Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Gens in Bakterien zur Biosynthese von Poly(3-hydroxybuttersäure). Bei einer weiteren alternativen Ausführungsform ermöglicht die Coexpression eines rekombinanten Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Gens und eines rekombinanten Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Gens in einer Zelle die Biosynthese des Copolyesters Poly(3-hydroxybuttersäure-co-4-hydroxybuttersäure). Bei einer alternativen Ausführungsform ermöglicht die Coexpression eines rekombinanten Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Gens und eines rekombinanten Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Gens in einer Zelle die Biosynthese von Poly(4-hydroxybuttersäure).
Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch die Coexpression eines Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Gens und eines Acyl-CoA-Synthetase-Gens in einer Zelle, die zur Biosynthese von Poly(3-hydroxybuttersäure) führt. Somit ermöglicht die Coexpression eines Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Gens und eines Acyl-CoA-Synthetase-Gens in einer Zelle die Biosynthese des Copolyesters Poly(3-hydroxybuttersäure-co-4-hydroxybuttersäure). Die Coexpression eines Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Gens und eines Acyl-CoA-Synthetase-Gens in einer Zelle ermöglicht die Biosynthese von Poly(4-hydroxybuttersäure).
In einer wichtigen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Nucleinsäureabschnitt bereit, der für ein rekombinantes Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein codiert und der für ein rekombinantes Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein codiert. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann generell ein beliebiges Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein sein, das zur Bildung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann ein Monomer oder ein Dimer sein. Zu monomeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Rhizobium meliloti, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes sp., Rhizobium etli, Paracoccus denitrificans, Acinetobacter sp., Rhodobacter sphaeroides, Methylobacterium exforquens, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus ruber und Zoogloea ramigera. Zu dimeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Thiocystis violacea und Chromatium vinosum. Vorzugsweise ist das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus und, bevorzugter, das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus, das durch das phaC-Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Strukturgen von Alcaligenes eutrophus codiert wird. Das Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein kann jedes beliebige Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein sein, das zur Herstellung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Zu Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die 4-Hydroxybutyrat:Acetyl-CoA-Transferase aus Clostridium aminobutyricum, die Propionat:Acyl-CoA-Transferase aus Clostridium propionicum und die Succinat:Acyl-CoA-Transferase aus Clostridium kluyveri. Vorzugsweise ist das Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein, bevorzugter ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein aus Clostridium kluyveri und am bevorzugtesten das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein aus Clostridium kluyveri, das durch das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Strukturgen von Clostridium kluyveri orfZ codiert wird. Der Nucleinsäureabschnitt kann Desoxyribonucleinsäuren (d.h. DNA) oder Ribonucleinsäuren (d.h. RNA) umfassen. Der Nucleinsäureabschnitt kann ferner einzel- oder doppelsträngig sein. Der Nucleinsäureabschnitt kann ferner eine lineare oder ringförmige Konformation aufweisen. Der Nucleinsäureabschnitt kann ferner eine Promotorsequenz umfassen, die in Bakterienzellen funktionell ist. Der Promotor kann induzierbar oder konstitutiv sein. Promotoren, die in Bakterienzellen funktionell sind, sind Fachleuten auf diesem Gebiet generell bekannt, und zu ihnen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, der lac-Promotor, der bla-Promotor, der P_L-Promotor, der P_trc-Promotor und der T7-Promotor.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch einen Nucleinsäureabschnitt, der für ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein codiert, und der für ein Acyl-CoA-Synthetase-Protein codiert. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann generell ein beliebiges Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein sein, das für die Bildung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann ein Monomer oder ein Dimer sein. Zu monomeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Rhizobium meliloti, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes sp., Rhizobium etli, Paracoccus denitrificans, Acinetobacter sp., Rhodobacter sphaeroides, Methylobacterium extorquens, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus ruber und Zoogloea ramigera. Zu dimeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Thiocystis violacea und Chromatium vinosum. Vorzugsweise ist das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus und, bevorzugter, das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus, das durch das phaC-Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Strukturgen von Alcaligenes eutrophus codiert wird. Das Acyl-CoA-Synthetase-Protein kann ein beliebiges Acyl-CoA-Synthetase-Protein sein, das zur Herstellung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Zu Quellen für Acyl-CoA-Synthetase-Proteine gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Alcaligenes eutrophus, Methanothrix soehngenii und Aspergillus nidulans. Vorzugsweise ist das Acyl-CoA-Synthetase-Protein ein Thiokinase-Protein und, bevorzugter, ein 4-Hydroxybutyrat-Thiokinase-Protein. Der Nucleinsäureabschnitt kann Desoxyribonucleinsäuren (d.h. DNA) oder Ribonucleinsäuren (d.h. RNA) umfassen. Der Nucleinsäureabschnitt kann ferner einzel- oder doppelsträngig sein. Der Nucleinsäureabschnitt kann ferner eine lineare oder ringförmige Konformation aufweisen. Der Nucleinsäureabschnitt kann ferner eine Promotorsequenz umfassen, die in Bakterienzellen funktionell ist. Der Promotor kann induzierbar oder konstitutiv sein. Promotoren, die in Bakterienzellen funktionell sind, sind Fachleuten auf diesem Gebiet generell bekannt, und zu ihnen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, der lac-Promotor, der bla-Promotor, der P_L-Promotor, der P_trc-Promotor und der T7-Promotor.
Die Erfindung stellt ferner rekombinante Vektoren bereit, die einen Nucleinsäureabschnitt aufweisen, wobei der Abschnitt ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein und ein Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein codiert. Dieser Vektor kann generell ein beliebiger Vektor sein, der für die Zufuhr der Nucleinsäure in eine Zelle geeignet ist.
Vektoren sind Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt, und zu ihnen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Plasmide, künstliche Chromosomen, Viren, Bakteriophagen, Cosmide und Phagemide. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann der Vektor pKSSE5.3 oder pSKSE5.3 sein, wie hier offenbart wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung eine Zelle, die einen Nucleinsäureabschnitt aufweist, der für ein rekombinantes Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein codiert und der für ein rekombinantes Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein codiert. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann generell ein beliebiges Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein sein, das zur Bildung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann ein Monomer oder ein Dimer sein. Zu monomeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Rhizobium meliloti, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes sp., Rhizobium etli, Paracoccus denitrificans, Acinetobacter sp., Rhodobacter sphaeroides, Methylobacterium extorquens, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus ruber und Zoogloea ramigera. Zu dimeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Thiocystis violacea und Chromatium vinosum. Vorzugsweise ist das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus und, bevorzugter, das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus, das durch das phaC-Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Strukturgen von Alcaligenes eutrophus codiert wird. Das Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein kann jedes beliebige Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein sein, das zur Herstellung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Zu Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die 4-Hydroxybutyrat:Acetyl-CoA-Transferase aus Clostridium aminobutyricum, die Propionat:Acyl-CoA-Transferase aus Clostridium propionicum und die Succinat:Acyl-CoA-Transferase aus Clostridium kluyveri. Vorzugsweise ist das Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein, bevorzugter ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein aus Clostridium kluyveri und am bevorzugtesten das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein aus Clostridium kluyveri, das durch das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Strukturgen von Clostridium kluyveri orfZ codiert wird. Die Zelle kann generell jede beliebige Zelle sein, die für die Herstellung von Polyestermaterialien geeignet ist. Die Zelle kann, ohne aber darauf beschränkt zu sein, eine Pflanzenzelle, eine Säugetierzelle, eine Insektenzelle, eine Pilzzelle und eine Bakterienzelle sein. Vorzugsweise ist die Zelle eine Pflanzenzelle. Vorzugsweise ist die Bakterienzelle Escherichia coli, und bevorzugter ist die Bakterienzelle Escherichia coli vom Stamm XL1-Blue.
Wir beschreiben auch eine Zelle, die einen Nucleinsäureabschnitt aufweist, der für ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein codiert und der für ein Acyl-CoA-Synthetase-Protein codiert. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann generell ein beliebiges Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein sein, das zur Bildung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann ein Monomer oder ein Dimer sein. Zu monomeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Rhizobium meliloti, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes sp., Rhizobium etli, Paracoccus denitrificans, Acinetobacter sp., Rhodobacter sphaeroides, Methylobacterium extorquens, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus ruber und Zoogloea ramigera. Zu dimeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Thiocystis violacea und Chromatium vinosum. Vorzugsweise ist das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus und, bevorzugter, das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus, das durch das phaC-Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Strukturgen von Alcaligenes eutrophus codiert wird. Das Acyl-CoA-Synthetase-Protein kann jedes beliebige Acyl-CoA-Synthetase-Protein sein, das zur Herstellung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Zu Quellen für Acyl-CoA-Synthetase-Proteine gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Alcaligenes eutrophus, Methanothrix soehngenii und Aspergillus nidulans. Vorzugsweise ist das Acyl-CoA-Synthetase-Protein ein Thiokinase-Protein, und bevorzugter ein 4-Hydroxybutyrat-Thiokinase-Protein. Die Zelle kann generell jede beliebige Zelle sein, die für die Herstellung von Polyestermaterialien geeignet ist. Die Zelle kann, ohne aber darauf beschränkt zu sein, eine Pflanzenzelle, eine Säugetierzelle, eine Insektenzelle, eine Pilzzelle und eine Bakterienzelle sein. Vorzugsweise ist die Zelle eine Pflanzenzelle. Vorzugsweise ist die Bakterienzelle Escherichia coli, und bevorzugter ist die Bakterienzelle Escherichia coli vom Stamm XL1-Blue.
Die Erfindung offenbart ferner Verfahren zur Herstellung einer transformierte Zelle, wobei die transformierte Zelle zur Herstellung von Polyestermaterialien geeignet ist. Zu den Zelltypen gehören, ohne aber darauf beschränkt zu sein, eine Pflanzenzelle, eine Säugetierzelle, eine Insektenzelle, eine Pilzzelle und eine Bakterienzelle. Vorzugsweise ist die Zelle eine Pflanzenzelle. Alternativ ist die Zelle eine Bakterienzelle, bevorzugter ist die Bakterienzelle Escherichia coli, und am bevorzugtesten ist die Bakterienzelle Escherichia coli vom Stamm XL1-Blue. Verfahren zur Transformation von Pflanzen sind in diesem Fachgebiet gut bekannt. Zu den Verfahren gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, eine Liposomen-vermittelte Transformation, eine Elektroporation, eine Behandlung mit Chemikalien, die die Aufnahme von freier DNA erhöhen, eine Zufuhr freier DNA über eine Bombardierung mit Mikropartikeln und eine Transformation mittels Viren oder Pollen. Mittel zur Transformation von Bakterienzellen sind in diesem Fachgebiet ebenfalls gut bekannt. Verfahren zur Transformation von Bakterienzellen sind in diesem Fachgebiet ebenfalls gut bekannt. Zu den Verfahren gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, eine Elektroporation, eine durch Calciumchlorid vermittelte Transformation und eine durch Polyethylenglycol vermittelte Transformation. Die offenbarten Transformationsverfahren umfassen das Auswählen einer Wirtszelle, das Inkontaktbringen der Wirtszelle mit einem Nucleinsäureabschnitt, der für ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein und für ein Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein codiert, wobei der Schritt des Inkontaktbringens unter Bedingungen durchgeführt wird, die für die Aufnahme des Nucleinsäureabschnitts durch die Zelle geeignet sind. Die nachfolgende Vermehrung der Zelle führt zur transformierten Zelle. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann generell ein beliebiges Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein sein, das zur Bildung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann ein Monomer oder ein Dimer sein. Zu monomeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Rhizobium meliloti, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes sp., Rhizobium etli, Paracoccus denitrificans, Acinetobacter sp., Rhodobacter sphaeroides, Methylobacterium extorquens, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus ruber und Zoogloea ramigera. Zu dimeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Thiocystis violacea und Chromatium vinosum. Vorzugsweise ist das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus und, bevorzugter, das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus, das durch das phaC-Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Strukturgen von Alcaligenes eutrophus codiert wird. Das Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein kann jedes beliebige Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein sein, das zur Herstellung von Polyestermaterialien gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Zu Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die 4-Hydroxybutyrat:Acetyl-CoA-Transferase aus Clostridium aminobutyricum, die Propionat:Acetyl-CoA-Transferase aus Clostridium propionicum und die Succinat:Acetyl-CoA-Transferase aus Clostridium kluyveri. Vorzugsweise ist das Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein, bevorzugter ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein aus Clostridium kluyveri und am bevorzugtesten das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein aus Clostridium kluyveri, das durch das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Strukturgen von Clostridium kluyveri otfZ codiert wird.
Die Erfindung offenbart alternative Verfahren zur Herstellung einer transformierten Zelle, wobei die transformierte Zelle zur Herstellung von Polyestermaterialien geeignet ist. Die offenbarten Transformationsverfahren umfassen das Auswählen einer Wirtszelle, das Inkontaktbringen der Wirtszelle mit einem Nucleinsäureabschnitt, der für ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein und für ein Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein codiert, wobei der Schritt des Inkontaktbringens unter Bedingungen durchgeführt wird, die für die Aufnahme des Nucleinsäureabschnitts durch die Zelle geeignet sind. Die nachfolgende Vermehrung der Zelle führt zur transformierten Zelle. Zu den Zelltypen gehören, ohne aber darauf beschränkt zu sein, eine Pflanzenzelle, eine Säugetierzelle, eine Insektenzelle, eine Pilzzelle und eine Bakterienzelle. Vorzugsweise ist die Zelle eine Pflanzenzelle. Alternativ ist die Zelle vorzugsweise eine Bakterienzelle, bevorzugter ist die Bakterienzelle Escherichia coli, und am bevorzugtesten ist die Bakterienzelle Escherichia coli vom Stamm XL1-Blue. Verfahren zur Transformation von Pflanzen sind in diesem Fachgebiet gut bekannt. Zu den Verfahren gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, eine Liposomen-vermittelte Transformation, eine Elektroporation, eine Behandlung mit Chemikalien, die die Aufnahme von freier DNA erhöhen, eine Zufuhr freier DNA über eine Bombardierung mit Mikropartikeln und eine Transformation mittels Viren oder Pollen. Verfahren zur Transformation von Bakterienzellen sind in diesem Fachgebiet ebenfalls gut bekannt. Zu den Verfahren gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, eine Elektroporation, eine durch Calciumchlorid vermittelte Transformation und eine durch Polyethylenglycol vermittelte Transformation. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann generell ein beliebiges Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein sein, das zur Bildung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann ein Monomer oder ein Dimer sein. Zu monomeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Rhizobium meliloti, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes sp., Rhizobium etli, Paracoccus denitrificans, Acinetobacter sp., Rhodobacter sphaeroides, Methylobacterium extorquens, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus ruber und Zoogloea ramigera. Zu dimeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Thiocystis violacea und Chromatium vinosum. Vorzugsweise ist das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus und, bevorzugter, das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus, das durch das phaC-Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Strukturgen von Alcaligenes eutrophus codiert wird. Das Acyl-CoA-Synthetase-Protein kann jedes beliebige Acyl-CoA-Synthetase-Protein sein, das zur Herstellung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Zu Quellen für Acyl-CoA-Synthetase-Proteine gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Alcaligenes eutrophus, Methanothrix soehngenii und Aspergillus nidulans. Vorzugsweise ist das Acyl-CoA-Synthetase-Protein ein Thiokinase-Protein, und bevorzugter ein 4-Hydroxybutyrat-Thiokinase-Protein.
Die Erfindung offenbart Verfahren zur Herstellung von Polyestermaterialien. Die Polyestermaterialien können jedes beliebige Polyestermaterial sein, das durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird. Die Polyester können ein Homopolyester oder ein Copolyester sein. Vorzugsweise ist der Homopolyester Poly(4-hydroxybuttersäure) oder Poly(3-hydroxybuttersäure). Der Copolyester ist vorzugsweise Poly(3-hydroxybuttersäure-co-4-hydroxybuttersäure). Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die folgenden Schritte: a) Gewinnen einer Zelle, die einen Nucleinsäureabschnitt enthält, wobei der Nucleinsäureabschnitt ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein und ein Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein codiert, b) Etablieren einer Kultur der Zelle, c) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die für die Bildung eines Polyesters geeignet sind, und d) Isolieren des Polyesters aus der Zelle. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann generell ein beliebiges Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein sein, das zur Bildung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann ein Monomer oder ein Dimer sein. Zu monomeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Rhizobium meliloti, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes sp., Rhizobium etli, Paracoccus denitrificans, Acinetobacter sp., Rhodobacter sphaeroides, Methylobacterium extorquens, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus ruber und Zoogloea ramigera. Zu dimeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Thiocystis violacea und Chromatium vinosum. Vorzugsweise ist das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus und, bevorzugter, das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus, das durch das phaC-Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Strukturgen von Alcaligenes eutrophus codiert wird. Das Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein kann jedes beliebige Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein sein, das zur Herstellung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Zu Quellen für Acyl-CoA-Synthetase-Proteine gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Alcaligenes eutrophus, Methanothrix soehngenii und Aspergillus nidulans. Vorzugsweise ist das Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein, bevorzugter ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein aus Clostridium kluyveri und am bevorzugtesten das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein aus Clostridium kluyveri, das durch das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Strukturgen von Clostridium kluyveri orfZ codiert wird. Die Kultur kann Glucose oder jedes beliebige Material, das durch die Zelle in Glucose umgewandelt werden kann, als Kohlenstoffquelle enthalten. Die Kultur kann enthalten 4-Hydroxybuttersäure, das Natriumsalz von 4-Hydroxybuttersäure, γ-Butyrolacton, 1,4-Butandiol, 4-Hydroxyvaleriansäure, γ-Valerolacton, 1,4-Pentandiol, 3-Hydroxybuttersäure, das Natriumsalz von 3-Hydroxybuttersäure, eine Hydroxypropionsäure, eine Hydroxybuttersäure, eine Hydroxyvaleriansäure, eine Hydroxycapronsäure, eine Hydroxyheptansäure, eine Hydroxyoctansäure, eine Hydroxydecansäure, γ-Caprolacton, γ-Heptalacton, γ-Octalacton, γ-Decalacton oder jedes beliebige Material, das durch die Zelle in 4-Hydroxybuttersäure umgewandelt werden kann. Die Kultur kann molekularen Sauerstoff enthalten. Molekularer Sauerstoff kann aufgrund des Durchblubberns von Sauerstoffgas oder eines sauerstoffhaltigen Gases, wie Luft, durch die Kultur vorhanden sein. Alternativ kann molekularer Sauerstoff aufgrund des Rührens der Kultur vorhanden sein. Die Zelle kann ein Protein enthalten, das zur Hydrolyse von Lactonen zu den entsprechenden Hydroxyfettsäuren fähig ist. Zu solchen Proteinen können, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die 1,4-Lactonase-Proteine der Ratte und des Menschen gehören. Zur Erleichterung der Umwandlung von 2-Ketoglutarat in Polyestermaterialien kann die Zelle ferner ein 2-Ketoglutarat-Decarboxylase-Protein (zum Beispiel aus Leuconostoc oenos oder Euglena gracilis) und ein 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Protein (zum Beispiel aus C. kluyveri oder A. eutrophus) aufweisen. Zur Erleichterung der Umwandlung von Succinat in Polyestermaterialien kann die Zelle ferner ein Succinat:Acetyl-CoA-Transferase-Protein (zum Beispiel aus C. kluyveri), ein Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase-Protein (zum Beispiel aus C. kluyveri) und ein 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Protein aufweisen. Zur Erleichterung der Umwandlung von Succinyl-CoA in Polyestermaterialien kann die Zelle ferner ein Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase-Protein und ein 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Protein aufweisen. Zur Erleichterung der Umwandlung von Propionyl-CoA in Polyestermaterialien kann die Zelle ferner ein 2-Methylcitrat-Synthase-Protein (zum Beispiel aus Saccharomyces cerevisiae), ein 2-Methylcitrat-Dehydratase-Protein (zum Beispiel aus Saccharomyces cerevisiae), ein 2-Methylisocitrat-Dehydratase Protein (zum Beispiel aus Saccharomyces cerevisiae), ein 2-Methylisocitrat-Lyase-Protein (zum Beispiel aus Saccharomyces cerevisiae), ein Succinat:Acetyl-CoA-Transferase-Protein (zum Beispiel aus C. kluyveri), ein Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase-Protein und ein 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Protein aufweisen. Es wird Fachleuten auf diesem Gebiet klar sein, dass verschiedene Kombinationen von Polyhydroxyfettsäure-Synthetasen, Fettsäure:Acyl-CoA-Transferasen und chemischen Substraten gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von Polyestermaterialien eingesetzt werden können.
Die Erfindung beschreibt ferner alternative Verfahren zur Herstellung von Polyestermaterialien. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die folgenden Schritte: a) Gewinnen einer Zelle, die einen Nucleinsäureabschnitt enthält, wobei der Nucleinsäureabschnitt ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein und ein Acyl-CoA-Synthetase-Protein codiert, b) Etablieren einer Kultur der Zelle, c) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die für die Bildung eines Polyesters geeignet sind, und d) Isolieren des Polyesters aus der Zelle. Die Polyestermaterialien können jedes beliebige Polyestermaterial sein, das mittels des erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird. Der Polyester kann ein Homopolyester oder ein Copolyester sein. Vorzugsweise ist der Homopolyester Poly(4-hydroxybuttersäure) oder Poly(3-hydroxybuttersäure). Der Copolyester ist vorzugsweise Poly(3-hydroxybuttersäure-co-4-hydroxybuttersäure). Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann generell jedes beliebiges Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein sein, das zur Bildung von Polyestermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein kann ein Monomer oder ein Dimer sein. Zu monomeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Rhizobium meliloti, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes sp., Rhizobium etli, Paracoccus denitrificans, Acinetobacter sp., Rhodobacter sphaeroides, Methylobacterium extorquens, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus ruber und Zoogloea ramigera. Zu dimeren Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteinen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen aus Thiocystis violacea und Chromatium vinosum. Vorzugsweise ist das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus und, bevorzugter, das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein aus Alcaligenes eutrophus, das durch das phaC-Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Strukturgen von Alcaligenes eutrophus codiert wird. Das Acyl-CoA-Synthetase-Protein kann ein beliebiges Acyl-CoA-Synthetase-Protein sein, das zur Herstellung von Polyestermaterialien gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Zu Quellen für Acyl-CoA-Synthetase-Proteine gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Alcaligenes eutrophus, Methanothrix soehngenii und Aspergillus nidulans. Vorzugsweise ist das Acyl-CoA-Synthetase-Protein ein Thiokinase-Protein und, bevorzugter, ein 4-Hydroxybutyrat-Thiokinase-Protein. Die Kultur kann Glucose oder jedes beliebige Material, das durch die Zelle in Glucose umgewandelt werden kann, als Kohlenstoffquelle enthalten. Die Kultur kann enthalten 4-Hydroxybuttersäure, das Natriumsalz von 4-Hydroxybuttersäure, γ-Butyrolacton, 1,4-Butandiol, 4-Hydroxyvaleriansäure, γ-Valerolacton, 1,4-Pentandiol, 3-Hydroxybuttersäure, das Natriumsalz von 3-Hydroxybuttersäure, eine Hydroxypropionsäure, eine Hydroxybuttersäure, eine Hydroxyvaleriansäure, eine Hydroxycapronsäure, eine Hydroxyheptansäure, eine Hydroxyoctansäure, eine Hydroxydecansäure, γ-Caprolacton, γ-Heptalacton, γ-Octalacton, γ-Decalacton oder jedes beliebige Material, das durch die Zelle in 4-Hydroxybuttersäure umgewandelt werden kann. Die Kultur kann molekularen Sauerstoff enthalten. Molekularer Sauerstoff kann aufgrund des Durchblubberns von Sauerstoffgas oder eines sauerstoffhaltigen Gases, wie Luft, durch die Kultur vorhanden sein. Alternativ kann molekularer Sauerstoff aufgrund des Rührens der Kultur vorhanden sein. Die Zelle kann ein Enzym enthalten, das zur Hydrolyse von Lactonen zu den entsprechenden Hydroxyfettsäuren fähig ist. Zu solchen Proteinen können, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die 1,4-Lactonase-Proteine der Ratte und des Menschen gehören. Zur Erleichterung der Umwandlung von 2-Ketoglutarat in Polyestermaterialien kann die Zelle ferner ein 2-Ketoglutarat-Decarboxylase-Protein und ein 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Protein aufweisen. Zur Erleichterung der Umwandlung von Succinat in Polyestermaterialien kann die Zelle ferner ein Succinat:Acetyl-CoA-Transferase-Protein, ein Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase-Protein und ein 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Protein aufweisen. Zur Erleichterung der Umwandlung von Succinyl-CoA in Polyestermaterialien kann die Zelle ferner ein Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase-Protein und ein 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Protein aufweisen. Zur Erleichterung der Umwandlung von Propionyl-CoA in Polyestermaterialien kann die Zelle ferner ein 2-Methylcitrat-Synthase-Protein, ein 2-Methylcitrat-Dehydratase-Protein, ein 2-Methylisocitrat-Dehydratase Protein, ein 2-Methylisocitrat-Lyase-Protein, ein Succinat:Acetyl-CoA-Transferase-Protein, ein Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase-Protein und ein 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Protein aufweisen. Es wird Fachleuten auf diesem Gebiet klar sein, dass verschiedene Kombinationen von Polyhydroxyfettsäure-Synthetasen, Fettsäure:Acyl-CoA-Transferasen und chemischen Substraten gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von Polyestermaterialien eingesetzt werden können.
Bei einer weiteren alternativen Ausführungsform kann die Herstellung von Polyestermaterialien durch die Coexpression eines Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Proteins, eines Acylkinase-Proteins und eines Phosphotransacylase-Proteins erreicht werden. Zu Quellen für Acylkinasen gehört, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die Butyratkinase aus Clostridium acetobutylicum. Zu Quellen für Phosphotransacylase-Proteine gehört, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, das Phosphotransbutyrylase-Protein aus Clostridium acetobutylicum.
Die folgenden Beispiele werden aufgenommen, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu demonstrieren. Es sollte Fachleuten auf diesem Gebiet klar sein, dass die in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken repräsentieren, für die von den Erfindern entdeckt wurde, dass sie in der Praxis der Erfindung gut funktionieren, und somit kann davon ausgegangen werden, dass sie bevorzugte Modi für ihre Durchführung darstellen. Fachleuten auf diesem Gebiet sollte im Lichte der vorliegenden Offenbarung jedoch klar sein, dass an den offenbarten Ausführungsformen beliebige Veränderungen vorgenommen werden können und immer ein ähnliches oder das gleiche Ergebnis erhalten wird, ohne das vom Geist oder dem Umfang der Erfindung abgewichen wird.
BEISPIELE
Materialien und Methoden
Mikrobiologische Hinterlegungen
Ein Hinterlegung gemäß dem Vertrag von Budapest von Escherichia-coli-XL1-Blue, das das rekombinante Plasmid pKSSE5.3 enthält (Zugangsnummer DSM 11427), und von Escherichia-coli-XL1-Blue, das das rekombinante Plasmid pSKSE5.3 enthält (Zugangsnummer DSM 11435), erfolgte am 24. Februar 1997 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Deutschland.
Bakterienstämme und Plasmide
Es wurden der Escherichia-coli-Stamm XL1-Blue (Bullock, W.O. et al. (1987), BioTechniques 5: 376–378) und die Plasmide pBluescriptKS- und pBluescriptSK- (Stratagene, La Jolla, Kalifornien), pSK2665 (Schubert, P. et al. (1991), J. Bacteriol. 173: 168–175) und pCK3pSK (Söhling, B. und Gottschalk, G. (1996), J. Bacteriol. 178: 871–880) eingesetzt.
Medien und Kultivierungsbedingungen
Zellen von Escherichia coli wurden bei 37°C in komplexem Luria-Bertani-Bouillon oder in M9-Mineralsalzmedium, das mit 0,02 % (Gew./Vol.) Hefeextrakt supplementiert war (Sambrook, J. et al. (1989), Molecular cloning; a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), kultiviert. Der Zusatz von Antibiotika, der gemäß Sambrook, J. el al. (1989) hergestellt wurde, sowie von Kohlenstoffquellen, die filtersterilisiert wurden, werden im Text beschrieben. Die Kultivierungen wurden entweder auf verfestigten Medien, die durch den Zusatz von 1,5 % (Gew./Vol.) Agar erhalten wurden, oder in flüssigen Medien in Erlenmeyerkolben, die auf einem Rotationsschüttler inkubiert wurden, durchgeführt.
Isolierung und Analyse von Polyestern
Für die quantitative Bestimmung von Polyhydroxyfettsäuren und zur Analyse der Bestandteile von Polyhydroxyfettsäuren wurden 3–5 mg an lyophilisiertem Zellmaterial oder der isolierte Polyester einer Methanolyse in Gegenwart von 15 %iger (Vol./Vol.) Schwefelsäure unterzogen. Die resultierenden Hydroxyacylmethylester wurden gaschromatographisch analysiert, wie es detailliert bei Brandl, H. et al. (1988), Appl. Environ. Microbiol. 54: 1977–1982, und bei Timm, A. el al. (1990), Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 296–301, beschrieben wird.
Polyhydroxyfettsäuren wurden aus lyophilisierten Zellen durch eine Extraktion mit Chloroform in einer Soxhlet-Apparatur isoliert. Der Polyester wurde aus der Chloroformlösung durch den Zusatz von 10 Volumina Ethanol ausgefällt, und der Niederschlag wurde anschließend durch eine Filtration vom Lösemittel abgetrennt. Restliches Lösemittel wurde entfernt, indem der Polyester einem Luftstrom ausgesetzt wurde. Für die weitere Reinigung wurde der Polyester in Chloroform gelöst, und die Ethanolfällung wurde wiederholt.
Nucleinsäuretechniken
Plasmid-DNA und DNA-Restriktionsfragmente wurden mittels Standardverfahren isoliert und analysiert (Sambrook, J. et al. (1989), Molecular cloning; a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Restriktionsenzyme, Ligasen und andere Enzyme wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.
Physikalische Charakterisierung von Poly(4-hydroxybuttersäure)-Proben
Die Analyse der Polymerzusammensetzung erfolgte mittels gaschromatographischer Verfahren, wie es von Braunegg, G. et al. (1978), Eur. J. Appl. Microbiol. 6: 29–37, beschrieben wurde. Die Analyse des Molekulargewichts und der Polydispersität erfolgte mittels Gelpermeationschromatographie (GPC; Ishihara, Y. et al. (1996), J. Ferm. Bioeng. 81: 422–428). Die Analyse der Schmelzpunkte, der Kristallisationsgeschwindigkeit, von dH_m und E_a erfolgte mittels Differential Scanning Calorimetry (DSC, Kemnitzer. J.E. et al. (1995), J. Env. Polym. Degrad. 3: 37–47).
BEISPIEL 1: Plasmidkonstruktion
Ein Smal/Apal-Restriktionsfragment von 3,5 kbp, das das vollständige Strukturgen der Polyhydroxyfettsäure-Synthase (phaC_Ae, GenBank Accession number J05003, Peoples, O.P. und Sinskey, A.J. (1989), J. Biol. Chem. 264: 15298–15303) plus 878 von 1221 bp der 5'-Region des Strukturgens der β-Ketothiolase von A. eutrophus, die als SA35 bezeichnet werden, enthielt, wurde aus dem hybriden Plasmid pSK2665, das bereits früher kloniert worden war (Schubert, P. et al. (1991), J. Bacteriol. 173: 168–175), isoliert. Außerdem wurde ein Apal/EcoR1-Restriktionsfragment von 1,8 kb, das das vollständige orfZ_Ck (phaA'_Ae, GenBank Accession number L21902, Söhling, B. und Gottschalk. G. (1993), J. Bacteriol. 178: 871–880) von C. kluyveri enthielt und als AE18 bezeichnet wurde, aus dem hybriden Plasmid pCK3pSK isoliert, das bereits früher kloniert worden war (Söhling, B. und Gottschalk, G. (1996), J. Bacteriol. 178:871–880). Beide Fragmente wurden an die mit EcoRI/Smal-verdauten pBluescript-Vektoren KS^– und SK^– ligiert. Die Ligationsprodukte (pKSSE5.3 bzw. pSKSE5.3) wurden mittels Calciumchlorid-Verfahren (Sambrook, J. et al. (1989), Molecular cloning; a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) in den Escherichia-coli-Stamm XL1-Blue transformiert. Das Plasmid pKSSE5.3 enthält phaC_Ae und orfZ_Ck angrenzend an den, aber antilinear zum, lacZ-Promotor. In pSKSE5.3 lagen phaC_Ae und orfZ_Ck stromabwärts und kolinear zum lacZ-Promotor. Alle Konstrukte wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese bezüglich des Vorhandenseins der erwarteten Restriktionsfragmente analysiert.
Für Kontrollexperimente wurde das SA35-Fragment an pBluescript KS^– oder an pBluescript SK^– ligiert, was zu den Plasmiden pKSSA35 (phaC_Ae plus phaA'_Ae angrenzend an den, aber antilinear zum, lacZ-Promotor) bzw. pSKSA35 (phaC_Ae plus phaA'_Ae stromabwärts und kolinear zum lacZ-Promotor) führte. Ähnlich wurde das Fragment AE18 allein an pBluescript KS^– oder an pBluescript SK^– ligiert, was zu den Plasmiden pKSAE18 (orfZ_Ck stromabwärts und kolinear zum lacZ-Promotor) bzw. pSKAE18 (orfZ_Ck angrenzend an den, aber antilinear zum, lacZ-Promotor) führte.
BEISPIEL 2: Synthese von Poly(4-hydroxybuttersäure) aus 4-Hydroxybuttersäure in rekombinanten Stämmen von Escherichia coli
Die rekombinanten Stämme von Escherichia-coli-XL1-Blue wurden bei 37°C als Batchkulturen in Erlenmeyerkolben kultiviert, wobei entweder komplexes LB-Medium, das mit 4-Hydroxybuttersäure allein oder in Kombination mit Glucose als zusätzlicher Kohlenstoffquelle supplementiert war, oder M9-Mineralsalzmedium, das 4-Hydroxybuttersäure und Glucose als Kohlenstoffquellen enthielt, verwendet wurde. Die hybriden Plasmide pKSSE5.3 und pSKSE5.3, die phaC_Ae, phaA'_Ae plus orfZ_Ck aufwiesen, verliehen Escherichia coli die Fähigkeit zur Synthese und Akkumulation eines Homopolyesters von 4-Hydroxybuttersäure, wenn die Stämme in Gegenwart von 4-Hydroxybuttersäure plus Glucose als Kohlenstoffquelle kultiviert worden (Tabelle 1).
Tabelle 1 Akkumulation von Poly(4-hydroxybuttersäure) aus 4-Hydroxybuttersäure plus Glucose durch rekombinante Stämme von Escherichia-coli-XL1-Blue
Die Zellen wurden bei 37*C 72 Stunden lang in Einschritt-Kultivierungsexperimenten wie im Text beschrieben in 250-mL-Erlenmeyerkolben, die auf einem Rotationsschüttler (220 Upm) inkubiert wurden, kultiviert. Die Kulturen wurden mit 0,04 Volumina einer Übernacht-Vorkultur in Luria-Bertani-Bouillon angeimpft, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose plus 0,4 % (Gew./Vol.) 4-Hydroxybuttersäure enthielt. Das M9-Medium war mit 0,02 % (Gew./Vol.) Hefeextrakt supplementiert. Am Ende des Experiments wurden die Zellen geerntet, mit Leitungswasser gewaschen, lyophilisiert und gaschromatographisch bezüglich ihres PHA-Gehalts und der PHA-Zusammensetzung analysiert.
Abkürzungen und Symbole: IPTG, Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid; n.n., nicht nachweisbar; -, nicht relevant
Die lichtmikroskopische Untersuchung der Zellen ließ cytoplasmatische Einschlüsse erkennen, und die geernteten Zellen waren opaker als Stämme, die kein pKSSE5.3 oder pSKSE5.3 enthielten. Wenn Glucose als Cosubstrat weggelassen wurde, lag die Polyhydroxyfettsäuremenge in den Zellen ungefähr im gleichen Bereich, aber sie bestand aus einem Copolyester von 3-Hydroxybuttersäure und 4-Hydroxybuttersäure, Poly(3-hydroxybuttersäure-co-4-hydroxybuttersäure), und nicht aus Poly(4-hydroxybuttersäure). Während des frühen Wachstums wurde nur 4-Hydroxybuttersäure in die Polyhydroxyfettsäure inkorporiert. Nach ungefähr eintägiger Kultivierung begannen die Zellen jedoch, zunehmende Mengen an 3-Hydroxybuttersäure zu inkorporieren, und nach vier Tagen war der molare Anteil der 3-Hydroxybuttersäure auf ungefähr 70 % angestiegen (Tabelle 2). Wenn Glucose als einzige Kohlenstoffquelle bereit gestellt wurde, wurde keine Polyhydroxyfettsäure akkumuliert. Der Zusatz von 4-Hydroxybuttersäure zum Medium als Kohlenstoffquelle war offenbar für die Gewinnung von Poly(4-hydroxybuttersäure) essentiell, und als Cosubstrat bereit gestellte Glucose limitierte offenbar die Inkorporation von 3-Hydroxybuttersäure in die Polyhydroxyfettsäure.
Tabelle 2 Akkumulation von Poly(3-hydroxybuttersäure-co-4-hydroxybuttersäure) aus 4-Hydroxybuttersäure durch rekombinante Stämme von Escherichia-coli-XL1-Blue
Die Zellen wurden bei 37°C in 50 mL komplexem Luria-Bertani-Medium, das die angegebene Kohlenstoffquelle enthielt, in 300-mL-Erienmeyerkolben kultiviert. Zu den angegebenen Zeiten wurden Proben von 10 mL genommen und einer gaschromatographischen Analyse des Polyestergehalts und der Zusammensetzung unterzogen.
Abkürzungen und Symbole: n.n., nicht nachweisbar; PHA, Polyhydroxyfettsäuren; 3HB. 3-Hydroxybuttersäure; 4HB, 4-Hydroxybuttersäure; LB, Luria Bertani; TGZ, Trockengewicht der Zellen
Die gaschromatographische Analyse der aus gewaschenen und lyophilisierten ganzen Zellen erhaltenen Derivate zeigte in den Chromatogrammen zwei Hauptverbindungen, die Retentionszeiten von 20,1 min und 9,3 min aufwiesen, und eine in geringerer Menge vorhandene Verbindung, die eine Retentionszeit von 24,1 min aufwies. Diese Verbindungen repräsentierten höchstwahrscheinlich γ-Butyrolacton, den Methylester von 4-Hydroxybuttersäure bzw. den Methylether von 4-Hydroxybuttersäure, die auch erhalten wurden, wenn nur 4-Hydroxybuttersäure einer sauren Methanolyse unterzogen wurde.
Die durch die Zellen akkumulierte Menge an Poly(4-hydroxybuttersäure) hing vom Plasmid, das im rekombinanten Escherichia-coli-XL1-Blue vorhanden war, dem Medium und den Kultivierungsbedingungen ab. Rekombinante Stämme, die das Plasmid pKSSE5.3 trugen, akkumulierten in komplexem LB-Medium sowie in M9-Mineralsalzmedium signifikant mehr Poly(4-hydroxybuttersäure) als diejenigen, die pSKSE5.3 trugen (Tabelle 1). Der Zusatz von IPTG zu Kulturen von Escherichia-coli-XL1-Blue, das pSKSE5.3 trug, beeinflusste die Menge des erzeugten Polyesters nicht signifikant. Bei beiden Plasmiden war die Menge der durch die Zellen akkumulierten Poly(4-hydroxybuttersäure) in M9-Mineralsalzmedium immer höher als in komplexem LB-Medium. Die Zuführung von Sauerstoff zu den Kulturen scheint für Menge der durch die Zellen akkumulierten Poly(4-hydroxybuttersäure) von großer Wichtigkeit zu sein. Das wurde aus Experimenten deutlich, bei denen das Verhältnis des Volumens des Medium zum Volumen des Erlenmeyerkolbens variiert wurde. Wenn die Experimente in einem 250-mL-Erlenmeyerkolben durchgeführt wurden, stieg die Menge an Poly(4-hydroxybuttersäure) enorm an, wenn das Volumen des Mediums von 50 auf 100 mL erhöht wurde, und zwar unabhängig davon, ob die rekombinanten Stämme pSKSE5.3 oder pKSSE5.3 trugen (Tabelle 1). Wenn das Volumen des Medium weiter auf 150 mL erhöht wurde, nahm die Menge der akkumulierten Poly(4-hydroxybuttersäure) ab.
Alle Plasmide, die nur phaC_Ae plus phaA'_Ae (pKSSA35 und pSKSA35) oder nur orfZ_Ck (pKSAE18 und pSKAE18) enthielten, verliehen Escherichia coli nicht die Fähigkeit zur Synthese von nachweisbarer Poly(4-hydroxybuttersäure) oder einer beliebigen anderen Polyhydroxyfettsäure, wenn 4-Hydroxybuttersäure oder Glucose allein oder in Kombination als Kohlenstoffquellen verwendet wurden, und unabhängig vom Volumen des Mediums oder davon, ob IPTG zugegeben wurde oder nicht.
Keiner der in dieser Studie erhaltenen rekombinanten Stämme von Escherichia coli war imstande, in flüssigem Medium oder auf einem verfestigten M9-Mineralsalzmedium zu wachsen, das 4-Hydroxybuttersäure als einzige Kohlenstoffquelle enthielt.
BEISPIEL 3: Eigenschaften von Poly(4-hydroxybuttersäure), die aus rekombinanten Escherichia coli isoliert wurde
Um die Akkumulation von Poly(4-hydroxybuttersäure) durch die rekombinanten Stämme zu bestätigen und den Polyester aus den Zellen zu isolieren, wurde Escherichia-coli-XL1-Blue (pKSSE5.3) in M9-Mineralsalzmedium im größeren Maßstab kultiviert. 2-L-Erlenmeyerkolben mit Schikane, die 1700 mL Medium enthielten, das mit 0,4 % (Gew./Vol.) Natrium-4-hydroxybutyrat und 1 % oder 2 % Glucose supplementiert war, wurden mit einer Vorkultur aus 50 mL Zellen angeimpft und auf einem Rotationsschüttler 72 Stunden inkubiert. Das lieferte ungefähr 1,9 g bzw. 2,5 g getrocknete Zellen. Die gaschromatographische Analyse der ganzen Zellen ergab einen Gehalt an Poly(4-hydroxybuttersäure) von ungefähr 80 % (Gew./Gew.). Aus diesen Zellen konnten 0,8 g bzw. 1,1 g Polyhydroxyfettsäure mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt werden. Somit wurden nur 52 % oder 55 % des Polyesters aus den Zellen gewonnen. Diese Diskrepanz konnte mit unvollständigen Extraktionen der Zellen erklärt werden, da die extrahierten Zellen immer noch Poly(4-hydroxybuttersäure) enthielten, und mit Verlusten bei der Fällung des Polymers. Das isolierte Material lieferte im Gaschromatogramm nur diejenigen Signale, die 4-Hydroxybuttersäure anzeigen. Somit wurde bestätigt, dass die Zellen einen Poly(4-hydroxybuttersäure)-Homopolyester akkumuliert hatten.
Für Poly(4-hydroxybuttersäure), die durch eine Polyhydroxyfettsäure-„leaky" Mutante von A. eutrophus JMP222 und rekombinante Stämme dieser Mutante, die zusätzliche Kopien des PHA-Synthase-Operons von A. eutrophus trugen (Steinbüchel, A. et al. (1994), J. Environ. Polymer Degrad. 2: 67–74), erzeugt wurde, wurde beobachtet, dass sie aus lyophilisierten Zellen in geringerem Umfang als Poly(3-hydroxybuttersäure) extrahiert wurde. Ähnlich wurde die durch den in dieser Studie eingesetzten rekombinanten Stamm von Escherichia coli erzeugte Poly(4-hydroxybuttersäure) aus lyophilisierten Zellen in viel geringerem Umfang als zum Beispiel Poly(3-hydroxybuttersäure) extrahiert. Poly(4-hydroxybuttersäure) aus dem rekombinanten Stamm wurde in Gegenwart eines Überschusses an Ethanol aus der Chloroformlösung als ein hochfibröses Material ausgefällt, das leicht und fast quantitativ auf einem Glasstab endete, wenn ein solcher bei der Fällung zum Rühren verwendet wurde. Die Poly(4-hydroxybuttersäure) aus den Stämmen von A. eutrophus JMP222 (Steinbüchel, A. et al. (1994), J. Environ. Polymer Degrad. 2: 67–74) wurde als ein weißes und elastisches Material isoliert.
Gelpermeationschromatographie-Experimente, die mit zwei Proben von Poly(4-hydroxybuttersäure)-Homopolyester durchgeführt wurden, die aus zwei unabhängigen Zellpräparationen der rekombinanten Stämme von E. coli isoliert worden waren, ergaben Molekulargewichte (M_w) von 1,75 × 106 bzw. 1,85 × 106 mit relativ niedrigen Polydispersitäten (M_w/M_n) von 1,45 bzw. 1,48. Somit waren die Molekulargewichte dieser Proben der Poly(4-hydroxybuttersäure) signifikant höher als die Molekulargewichte von Poly(4-hydroxybuttersäure), die aus Stämmen von A. eutrophus JMP222 isoliert worden war. Außerdem war die Polydispersität dieser Proben viel niedriger (Steinbüchel, A. et al. (1994), J. Environ. Polymer Degrad. 2:67–74). Die zwei Poly(4-hydroxybuttersäure)-Proben hatten Schmelzpunkte (T_m) von 67,6 und 63,1°C. Die Werte für dH_m und E_a für die beiden Proben lagen bei 45,7 bzw. 44,3 J/g oder 69,8 bzw. 83,8 kJ/mol. Bei 70°C zeigten beide Polyesterproben eine langsame Kristallisationsgeschwindigkeit (>30 min).
BEISPIEL 4: Synthese von Polyhydroxyfettsäure aus γ-Butyrolacton, Levulinsäure, 4-Hydroxyvaleriansäure oder γ-Valerolacton in rekombinanten Stämmen von Escherichia coli
Kohlenstoffquellen, die mit 4-Hydroxybuttersäure verwandt sind, wurden ebenfalls bezüglich der Bildung von Polyhydroxyfettsäure durch die rekombinanten Stämme untersucht. Zu diesem Zweck wurden Zellen in zwei verschiedenen Schritten kultiviert. Im ersten Schritt ließ man die Zellen 64 Stunden im komplettem M9-Mineralsalzmedium mit 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose plus 0,1 % (Gew./Vol.) Natrium-4-hydroxybutyrat als Kohlenstoffquellen wachsen. Diese Zellen wurden dann mit frischem M9-Mineralsalzmedium gewaschen und in einen 250-mL-Erlenmeyerkolben transferiert, der 100 mL ammoniumfreies M9-Mineralsalzmedium enthielt. Die Dichte der Zellsuspension wurde im Vergleich zur Dichte der Vorkultur ungefähr 1:1 verdünnt. Im zweiten Schritt wurden die Zellen 72 Stunden auf einem Rotationsschüttler kultiviert. Wenn Escherichia-coli-XL1-Blue (pKSSE5.3) in M9-Mineralsalzmedium, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose plus 0,4 % (Gew./Vol.) γ-Butyrolacton als Kohlenstoffquellen enthielt, kultiviert wurde, wurden nur geringe Mengen an Polyhydroxyfettsäure (gewöhnlich unter 10 % des TGZ, Gew./Gew.) akkumuliert (Tabelle 3). Diese Zellen akkumulierten jedoch keinen Poly(4-hydroxybuttersäure)-Homopolyester, sondern sie synthetisierten einen Copolyester, der aus 3-Hydroxybuttersäure und 4-Hydroxybuttersäure bestand, wobei 4-Hydroxybuttersäure in geringerer Menge vorlag (gewöhnlich unter 30 %, mol/mol).
Tabelle 3. Kultivierung von E.-coli-XL1-Blue (pKSSE5.3) auf anderen Vorläufersubstraten für die Inkorporation von 4-Hydroxyalkansäuren in PHA
Die Zellen wurden bei 37°C 72 Stunden in Ein- oder Zweischritt-Kultivierungsexperimenten wie im Text beschrieben kultiviert. Am Ende des Experiments wurden die Zellen geerntet, mit Leitungswasser gewaschen, lyophilisiert und gaschromatographisch bezüglich des PHA-Gehalts und der PHA-Zusammensetzung analysiert.
Abkürzungen und Symbole: M9, reguläres Mineralsalzmedium supplementiert mit 0,02 % (Gew./Vol.) Hefeextrakt; M9*, ammoniumfreies M9-Mineralsalzmedium; n.n., nicht nachweisbar
Wenn in diesen Experimenten γ-Butyrolacton durch 0,4 % (Gew./Vol.) Natrium-Levulinat oder durch 0,2 % (Gew./Vol.) Natrium-4-hydroxyvalerat oder durch 0,2 % (Gew./Vol.) γ-Valerolacton ersetzt wurde, wurden nur sehr geringe Mengen an Polyhydroxyfettsäure, die nie 4 % des TGZ übertrafen, synthetisiert und akkumuliert. Die gaschromatographische Analyse zeigte, dass 3-Hydroxybuttersäure der einzige Bestandteil war. 4-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyvaleriansäure (3HV) oder 4-Hydroxyvaleriansäure (4HV) wurden nicht gefunden (Tabelle 3).
Zellen von Escherichia-coli-XL1-Blue (pKSSE5.3) wurden auch in Einschritt-Experimenten als Batchkulturen in 250-mL-Erlenmeyerkolben kultiviert, die 100 mL komplettes M9-Mineralalz-Medium plus 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose plus 0,1 bis 0,4 % (Gew./Vol.) γ-Butyrolacton als Kohlenstoffquellen enthielten. Die Zellen akkumulierten signifikant mehr Polyhydroxyfettsäure, und der Polyester bestand aus 4-Hydroxybuttersäure als einzigem nachweisbarem Bestandteil (Tabelle 3). Bei 0,4 % (Gew./Vol.) Natrium-4-hydroxybutyrat im Medium trug Poly(4-hydroxybuttersäure) zum Beispiel 16,1 % (Gew./Gew.) zum TGZ bei. Wenn Natrium-Levulinat anstelle von Natrium-4-hydroxybutyrat als eine zweite Kohlenstoffquelle zusätzlich zu 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose verwendet wurde, wurde keine Polyhydroxyfettsäure in den Zellen gefunden.
BEISPIEL 5: Produktion von Polyestermaterialien in Pflanzen
In Pflanzen können Transformationsvektoren konstruiert werden, die zur Einführung bakterieller Gene, die an der Polyester-Biosynthese beteiligt sind, fähig sind. Generell umfassen solche Vektoren eine oder mehrere interessierende codierende(n) Sequenz(en) unter der transkriptionellen Steuerung von 5'- und 3'-regulatorischen Sequenzen, die einen Promotor einschließen, sowie einen selektierbaren Marker. Zu typischen regulatorischen Sequenzen gehören eine Startstelle für die Initiation der Transkription, ein RNA-Prozessierungssignal, eine Stelle für die Termination der Transkription und/oder ein Polyadenylierungssignal. Pflanzliche Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein, durch die Umwelt oder die Entwicklung reguliert werden oder zell- oder gewebsspezifisch sein. Zu häufig verwendeten Promotoren gehören der CaMV-35S-Promotor (Odell, J.T. et al. (1985), Nature 313:810–812), der Enhanced-CaMV-35S-Promotor, der Promotor des Braunwurz-Mosaikvirus (FMV) (Richins, R.D. et al. (1987), NAR 20:8451–8466), der Mannopinsynthase (mas) Promotor, der Nopalinsynthase (nos) Promotor und der Octopinsynthase (ocs) Promotor. Zu nützlichen induzierbaren Promotoren gehören Heat-Shock-Promotoren (Ou-Lee et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6815), ein Nitrat-induzierbar Promotor, der vom Gen der Nitritreduktase des Spinats abstammt (Back, E. et al. (1991), Plant Mol. Biol. 17: 9–18), Hormon-induzierbare Promotoren (Yamaguchi, K. et al. (1990), Plant Mol. Biol. 15: 905–912, Kares, C. et al. (1990), Plant Mol. Biol. 15: 225–236) und lichtinduzierbare Promotoren, die mit der kleinen Untereinheit der RuBP-Carboxylase und LHCP-Genfamilien assoziiert sind (Kuhlemeier, C. et al. (1989), Plant Cell 1: 471–478, Feinbaum, R.L. et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 226: 449–456, Weisshaar, B. et al. (1991), EMBO J. 10: 1777–1786, Lam, E. und Chua, N.-H. (1990), Science 248: 471– 474, Castresana, C. et al. (1988), EMBO J. 7: 1929–1936, Schulze-Lefert, P. et al. (1989), EMBO J. 8:651–656). Beispiele für nützliche gewebsspezifische, entwicklungsregulierte Promotoren sind der β-Conglycinin-7S-Promotor (Doyle, J.J. et al. (1986), J. Biol. Chem. 261:9228–9238, Slighton und Beachy (1987), Planta 172:356) und samenspezifische Promotoren (Knutzon, D.S. et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624–2628, Bustos, M.M. et al. (1991), EMBO J. 10: 1469–1480, Lam, E. und Chua, N.-H. (1991), Science 248: 471–474, Stayton, M. et al. (1991), Aust. J. Plant Physiol. 18: 507–518). Zu in Pflanzen funktionellen Promotoren, die für eine bevorzugte Expression in Samenplastiden nützlich sind, gehören diejenigen von Genen pflanzlicher Vorratsproteine und von Genen, die an der Fettsäurebiosynthese in Ölsamen beteiligt sind. Beispiele für derartige Promotoren sind die 5'-regulatorischen Bereiche von Genen wie des Napins (Kridl et al. (1991), Seed Sci. Res. 1: 209), Phaseolins, Zeins, des Sojabohnen-Trypsininhibitors, des ACP, der Stearoyl-ACP-Desaturase und des Oleosins. Die samenspezifische Genregulation wird in EP 0 255 378 diskutiert. Es können auch Promotorhybride konstruiert werden, um die transkriptionelle Aktivität zu verstärken (Hoffman, US-Patent Nr. 5 106 739), oder um eine gewünschte transkriptionelle Aktivität und eine Gewebsspezifität zu kombinieren. Repräsentative Vektoren umfassen häufig, funktionell in der Richtung von 5' nach 3' miteinander verknüpft, eine Promotorsequenz. die die Transkription einer stromabwärts liegenden heterologen strukturellen Nucleinsäure in einer Pflanze steuert, gegebenenfalls eine nicht-translatierte Leader-Sequenz, eine Nucleotidsequenz, die für ein interessierendes Protein codiert, und einen 3'-nicht-translatierten Bereich, der für ein Polyadenylierungssignal codiert, das in Pflanzenzellen so wirkt, das es die Termination der Transkription und die Anfügung von Polyadenylatnucleotiden an das 3'-Ende der mRNA; die für das genannte Protein codiert, bewirkt. Außerdem ist ein Faktor, der bedacht werden sollte, die zeitliche Abstimmung und die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen, die für die Biosynthese von Polyestern erforderlich sind. Zum Beispiel sollte, wenn Wege der Fettsäurebiosynthese in Ölsamen-Pflanzen wie Canola ausgenützt werden, die Expression von Proteinen der Polyesterbiosynthese gleichzeitig mit der Fettsäurebiosynthese und gezielt im Samenleukoplast oder im Blattleukoplast erfolgen.
Es können mehrere verschiedene Verfahren zur Einführung derartiger Vektoren in Pflanzenprotoplasten, Zellen, Kallusgewebe, Blattscheiben, Meristeme etc. eingesetzt werden, um transgene Pflanzen zu erzeugen, einschließlich einer durch Agrobacterium vermittelten Transformation, einer Zufuhr mittels einer Particle Gun, einer Mikroinjektion, einer Elektroporation, einer Polyethylenglycol-vermittelten Protoplastentransformation, einer Liposomen-vermittelten Transformation etc. (zusammengefasst bei Potrykus, I. (1991), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205–226). Im allgemeinen können transgene Pflanzen, die Zellen aufweisen, die eine für eine Polyhydroxyfettsäure-Synthase und eine Fettsäure:Acyl- CoA-Transferase codierende Nucleinsäure enthalten und exprimieren, durch das Transformieren von Pflanzenzellen mit einem Nucleinsäurekonstrukt, wie es oben beschrieben wurde, mittels beliebiger der vorangehenden Verfahren erzeugt werden, durch das Selektieren von Pflanzenzellen, die auf einem selektiven Medium transformiert wurden, durch das Vermehren von Pflanzenzellen, die transformiert wurden, um differenzierte Pflanzen zu erzeugen, und durch das Selektieren einer transformierten Pflanze, die die für die Polyhydroxyfettsäure-Synthase und die Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase codierenden Nucleotidsequenzen exprimiert.
Die codierenden Nucleinsäuren können eingeführt werden entweder in einem einzigen Transformationsvorgang (alle erforderlichen DNAs liegen auf demselben Vektor vor), einem Cotransformationsvorgang (alle erforderlichen Nucleinsäuren liegen auf separaten Vektoren vor, die gleichzeitig in Pflanzen oder Pflanzenzellen eingeführt werden), in unabhängigen Transformationsvorgängen (alle erforderlichen Nucleinsäuren liegen auf separaten Vektoren vor, die unabhängig voneinander in Pflanzen oder Pflanzenzellen eingeführt werden) oder über eine Retransformation (Transformieren einer bereits transformierten Linie, die durch eine einzelne Transformation, eine Cotransformation oder unabhängige Transformationsvorgänge erzeugt wurde). Herkömmliche Zuchtverfahren können, wenn sie anwendbar sind, anschließend dazu verwendet werden, den vollständigen Weg in nur eine Pflanze zu inkorporieren. Eine erfolgreiche Bildung der PHA Polyhydroxybutyrat in Zellen von Arabidopsis wurde von Poirier, Y. et al. (1992, Science 256: 520–523) und in Plastiden von Arabidopsis von Nawrath et al. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12760–12764) gezeigt.
Spezifische Verfahren für die Transformation einer großen Vielzahl von Dikotyledonen und die Gewinnung transgener Pflanzen sind in der Literatur gut dokumentiert (siehe Gasser, C.S. und Fraley, R.T. (1989), Science 244: 1293–1299, Fisk, H.J. und Dandekar, A.M. (1993), Scientia Horticulturae 55: 5–36, Christou (1994), Agro Food Industry Hi Tech (März/April 1994), S. 17, und die darin zitierten Literaturstellen).
Eine erfolgreiche Transformation und Pflanzenvermehrung wurden bei den folgenden Monokotyledonen erreicht: Spargel (Asparagus officinalis; Bytebier et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345), Gerste (Hordeum vulgarae; Wan, Y. und Lemaux, P.G. (1994), Plant Physiol. 104: 37–48), Mais (Zea mays; Rhodes, C.A. et al. (1988), Science 240:204–207, Gordon-Kamm, W.J. et al. (1990), Plant Cell 2:603–618, Fromm, M.E. et al. (1990), Bio/Technology 8: 833–839, Koziel et al. (1993), Bio/Technology 11: 194), Hafer (Avena sativa; Somers et al. (1992), Bio/Technology 10: 1589), Knäuelgras (Dactylis glomerata; Horn, M.E. et al. (1988), Plant Cell Rep. 7: 469–472), Reis (Oryza sativa, einschließlich von Indica- und Japonica-Varietäten; Toriyama, K. et al. (1988), Bio/Technology 6: 1072–1074, Zhang, H.M. et al. (1988), Plant Cell Rep. 7: 379–384, Luo und Wu (1988), Plant Mol. Biol. Rep. 6: 165, Zhang. W. und Wu, R. (1988), Theor. Appl. Genet. 76: 835–840, Christou et al. (1991), Bio/Technology 9:957), Roggen (Secale cereale; De la Pena et al. (1987), Nature 325:274), Sorghum (Sorghum bicolor, Casas, A.M. et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212–11216), Zuckerrohr (Saccharum spp.; Bower und Birch (1992), Plant J. 2:409); Rohr-Schwinge) (Festuca arundinacea; Wang, Z.Y. et al. (1992), Bio/Technology 10:691–696), Rasengras (Agrostis palustris; Zhong, H. et al. (1993), Plant Cell Rep. 13: 1–6) und Weizen (Triticum aestivum; Vasil et al. (1992). Bio/Technology 10: 667, Weeks, J.T. et al. (1993), Plant Physiol. 102: 1077–1084, Becker, D. et al. (1994), Plant J. 5: 299–307).
Zu besonders nützlichen Pflanzen für die Polyesterproduktion gehören solche, wie Kartoffeln und Zuckerrüben, die Kohlenstoffsubstrate erzeugen, die für die Polyesterbiosynthese eingesetzt werden können. Getreidepflanzen wie Mais, Weizen und Reis werden ebenfalls bevorzugt. Zu anderen nützlichen Pflanzen gehören Tabak und Ölsaatpflanzen wie die Sojabohne, Canola, Ölraps, Arabidqpsis sp. und die Erdnuss. Pflanzen, die auf Wüstenboden oder mineralisierter Erde wachsen, können ebenfalls zur Bildung von Polyestern eingesetzt werden. Zu Polymeren, die auf diese Weise produziert werden können, gehören, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, zum Beispiel Polyhydroxybutyrat und Copolymere, die sowohl kurzkettige Monomere als auch Monomere mittlerer Kettenlänge inkorporiert enthalten, wie Polyhydroxybutyrat-co-polyhydroxycaproat, Polyhydroxycaproat-co-polyhydroxyoctanoat und Polyhydroxyoctanoat-co-polyhydroxydecanoat.
Alle Zusammensetzungen und/oder Verfahren, die hier offenbart und beansprucht werden, können im Lichte der vorliegenden Offenbarung ohne übermäßiges Experimentieren hergestellt bzw. durchgeführt werden.

Claims

Isolierter Nucleinsäureabschnitt, der rekombinante Gene aufweist, die codieren für: a) ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein, und b) ein Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein, wobei die genannten Gene bezüglich des Nucleinsäureabschnitts heterolog sind.
Nucleinsäureabschnitt nach Anspruch 1, wobei das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein von Alcaligenes eutrophus ist.
Nucleinsäureabschnitt nach Anspruch 2, wobei das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein von Alcaligenes eutrophus durch das phaC-Strukturgen der Polyhydroxyfettsäure-Synthase von Alcaligenes eutrophus codiert wird.
Nucleinsäureabschnitt nach Anspruch 1, wobei das Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein ist.
Nucleinsäureabschnitt nach Anspruch 4, wobei das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein von Clostridium kluyveri ist.
Nucleinsäureabschnitt nach Anspruch 5, wobei das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein von Clostridium kluyveri durch das orfZ-Strukturgen der 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase von Clostridium kluyveri codiert wird.
Nucleinsäureabschnitt nach Anspruch 1, wobei der Abschnitt ferner einen Promotor umfasst, der in Bakterienzellen funktionell ist.
Nucleinsäureabschnitt nach Anspruch 1, wobei: a) die Sequenz, die für ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein codiert, funktionsfähig mit ihrem nativen Promotor verknüpft ist, und b) die Sequenz, die für ein Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein codiert, funktionsfähig mit ihrem nativen Promotor verknüpft ist.
Nucleinsäureabschnitt nach Anspruch 1, wobei der Abschnitt ferner einen Promotor umfasst, der heterolog ist bezüglich: a) der Sequenz, die für ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein codiert, und b) der Sequenz, die für ein Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein codiert.
Rekombinanter Vektor, der den Nucleinsäureabschnitt nach Anspruch 1 aufweist.
Rekombinanter Vektor, der den Nucleinsäureabschnitt nach Anspruch 9 aufweist.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 11, wobei der Vektor die Zugangsnummer DSM 11472 hat.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 11, wobei der Vektor die Zugangsnummer DSM 11435 hat.
Rekombinanter Vektor, der umfasst: a) einen isolierten Nucleinsäureabschnitt, der für ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein codiert, b) einen isolierten Nucleinsäureabschnitt, der für ein Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein codiert, und c) einen Promotor, der heterolog bezüglich des Nucleinsäureabschnitts ist, der für ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein codiert, und heterolog bezüglich des Nucleinsäureabschnitts, der für ein Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein codiert.
Zelle, die exprimiert: a) ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein, und b) ein Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein, wobei jedes der genannten Proteine durch ein rekombinantes Gen codiert wird, das auf einem DNA-Abschnitt liegt, bezüglich dessen das Gen heterolog ist.
Zelle nach Anspruch 15, ferner definiert als eine Pflanzenzelle, Säugerzelle, Insektenzelle, Pilzzelle oder Bakterienzelle.
Zelle nach Anspruch 16, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Zelle nach Anspruch 16, wobei die Zelle eine Bakterienzelle ist.
Bakterienzelle nach Anspruch 18, wobei die Bakterienzelle Escherichia coli ist.
Bakterienzelle nach Anspruch 19, wobei die Bakterienzelle Escherichia coli, Stamm XL1-Blue, ist.
Zelle nach Anspruch 15, wobei das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein von Alcaligenes eutrophus ist.
Zelle nach Anspruch 21, wobei das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein von Alcaligenes eutrophus durch das phaC-Strukturgen der Polyhydroxyfettsäure-Synthase von Alcaligenes eutrophus codiert wird.
Zelle nach Anspruch 15, wobei das Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein ist.
Zelle nach Anspruch 23, wobei das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein von Clostridium kluyveri ist.
Zelle nach Anspruch 24, wobei das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein von Clostridium kluyveri durch das orfZ-Strukturgen der 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase von Clostridium kluyveri codiert wird.
Verfahren zur Herstellung einer transformierten Zelle, das die Schritte umfasst: a) Auswählen einer Wirtszelle, b) Inkontaktbringen der Wirtszelle mit einem isolierten Nucleinsäureabschnitt, wobei der Nucleinsäureabschnitt codiert für: i) ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein, und ii) ein Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein, unter Bedingungen, die für die Aufnahme des Nucleinsäureabschnitts durch die Wirtszelle geeignet sind, und c) Regenerieren der Zelle zur Erzeugung einer transformierten Zelle, wobei der Nucleinsäureabschnitt frei von gesamter genomischer DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Schritt des Inkontaktbringens ferner als eine Calciumchlorid-vermittelte Transformation definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle, Säugerzelle, Insektenzelle, Pilzzelle oder Bakterienzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Zelle eine Bakterienzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Bakterienzelle Escherichia coli ist.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Bakterienzelle Escherichia coli, Stamm XL1-Blue, ist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein von Alcaligenes eutrophus ist.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein von Alcaligenes eutrophus durch das phaC-Strukturgen der Polyhydroxyfettsäure-Synthase von Alcaligenes eutrophus codiert wird.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein ein 4-Hydroxybutyrat:Acryl-CoA-Transferase-Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein von Clostridium kluyveri ist.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein von Clostridium kluyveri durch das orfZ-Strukturgen der 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase von Clostridium kluyveri codiert wird.
Verfahren zur Herstellung eines Polyesters, das die Schritte umfasst: a) Gewinnen einer Zelle, die imstande ist zu erzeugen: i) ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein, und ii) ein Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein, wobei jedes der genannten Proteine durch ein rekombinantes Gen codiert wird, das auf einem DNA-Abschnitt liegt, bezüglich dessen das Gen heterolog ist, b) Etablieren einer Kultur der Zelle, c) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die für die Erzeugung des Polyesters geeignet sind, und d) Isolieren des Polyesters aus der Zelle.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle, Säugerzelle, Insektenzelle, Pilzzelle oder Bakterienzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Zelle eine Bakterienzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Bakterienzelle Escherichia coli ist.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei die Bakterienzelle Escherichia coli, Stamm XL1-Blue, ist.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein ein Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein von Alcaligenes eutrophus ist.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei das Polyhydroxyfettsäure-Synthase-Protein von Alcatigenes eutrophus durch das phaC-Strukturgen der Polyhydroxyfettsäure-Synthase von Alcaligenes eutrophus codiert wird.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei das Fettsäure:Acyl-CoA-Transferase-Protein ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Frotein ist.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein ein 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein von Clostridium kluyveri ist.
Verfahren nach Anspruch 47, wobei das 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase-Protein von Clostridium kluyveri durch das orfZ-Strukturgen der 4-Hydroxybutyrat:Acyl-CoA-Transferase von Clostridium kluyveri codiert wird.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Kultur Glucose enthält.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Kultur enthält 4-Hydroxybuttersäure, das Natriumsalz der 4-Hydroxybuttersäure, γ-Butyrolacton, 1,4-Butandiol, 4-Hydroxyvaleriansäure, γ-Valerolacton, 1,4-Pentandiol, 3-Hydroxybuttersäure, das Natriumsalz der 3-Hydroxybuttersäure, eine Hydroxypropionsäure, eine Hydroxybuttersäure, eine Hydroxyvaleriansäure, eine Hydroxycapronsäure, eine Hydroxyheptansäure, eine Hydroxyoctansäure, eine Hydroxydecansäure, γ-Caprolacton, γ-Heptalacton, γ-Octalacton oder γ-Decalacton.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Kultur molekularen Sauerstoff enthält.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Zelle ferner imstande ist, ein Protein zu erzeugen, das imstande ist, ein Lacton zur entsprechenden Hydroxyfettsäure zu hydrolysieren.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Zelle ferner imstande ist, ein 2-Oxoglutarat-Decarboxylase-Protein und ein 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Protein zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Zelle ferner imstande ist, ein Succinat:Acetyl-CoA-Transferase-Protein, ein Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase-Protein und ein 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Protein zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Zelle ferner imstande ist, ein Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase-Protein und ein 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Protein zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Zelle ferner imstande ist, ein 2-Methylcitrat-Synthase-Protein, ein 2-Methylcitrat-Dehydratase-Protein, ein 2-Methylisocitrat-Dehydratase-Protein, ein 2-Methylisocitrat-Lyase-Protein, ein Succinat:Acetyl-CoA-Transferase-Protein, ein Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase-Protein und ein 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Protein zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei der Polyester ein Homopolyester ist.
Verfahren nach Anspruch 57, wobei der Homopolyester Poly(4-hydroxybuttersäure) ist.
Verfahren nach Anspruch 57, wobei der Homopolyester Poly(3-hydroxybuttersäure) ist.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei der Polyester ein Copolyester ist.
Verfahren nach Anspruch 60, wobei der Copolyester Poly(3-hydroxybuttersäure-co-4-hydroxybuttersäure) ist.
Isolierter Nucleinsäureabschnitt, rekombinanter Vektor oder Zelle gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 25, ferner umfassend ein rekombinantes Gen, das für die β-Ketathiolase codiert.