JP2002503090A - 発酵における細胞収量の増加のための栄養培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 発酵において使用される、細胞または微生物の収量を増加させるための栄養培地を提供する。提供された処方は真菌類Lagenidium giganteumの収量を公知の培地の２〜３倍に増加させる。

Description

【発明の詳細な説明】 発酵における細胞収量の増加のための栄養培地 発明の分野 本発明は、発酵において使用される、公知の培地と比較して、細胞収量の増加 を提供する新規培地に関する。より詳細には、本発明は、真菌類Lagenidium gig anteumの収量を、公知の培地で得られる収量の少なくとも２から３倍の増加を生 じる。細胞の収量増加に加えて、レシチンを含む新規培地におけるL．gjganteum の増殖は、蚊に対する有効性の増大も示す。 発明の背景 発酵は、特殊化容器における微生物または細胞の生育の過程である。細胞また は生物は、次いで精製され、様々な目的に利用され得る。例えば、発酵槽内で生 育された真菌類Lagenidium giganteumは、蚊に対する生物調節剤として用いられ る。 発酵中の微生物の至適な成長は、有効な栄養素、酸素濃度、pH、温度、撹拌の 程度といったいくつかの要因に依存する。細胞増殖に必要な栄養素は、発酵過程 間で使用される培地中で与えられる。それゆえ、発酵から得られる収量は、一部 においては培地の組成に依存している。 Lagenidium giganteumの発酵において現在使用されている栄養培地がいくつか 発表されている。すべては最終容量１Ｌになるように脱イオン水を加えて使用さ れ、また全て滅菌される。一つの処方は、2.0gアーダミンpH、2.0gグルコース、 1mLコーン油、0.5gコレステロール、および2mM Ca₂ ⁺を含む。(Kerwin,James L. およびWashino，Robert K.(1986)「Ground and aerial application of the sex ual and asexual stage of Lagenidium giganteum（oomycetes:Lagenidiales）f or mosquito control.」J．Am．Mos．Conirol Assoc．2(2):182-189). 別の処方は、2.0g自己融解酵母抽出物、1.0g proflo、0.5g魚粉、2mM C aCl₂・2H₂O、1mM MgCl₂・6H₂O、0.05gコレステロール、および2mL綿実油を含む(Ke rwin，James L.およびWashino，Robert K.(1988)「Field evaluation of Lageni dium giganteum(Oomycetes:Lagenidiales)and description of a natural epizo otic involving a new isolate of fungus.」J．Med．Entomol．25(6):452-460) 。なお別の発酵用培地は、1.25gグルコース、1.25gペプトン、1.25g自己融解酵 母抽出物、2gコーン油、1gアマニ油、および0.075g CaCl₂・2H₂Oを含む(米国特許 第4,687,744号)。公開された第４の培地は、1.25g酵母抽出物、1.2gグルコース 、3.2g粉末小麦胚芽、250mg/Lの可溶化タンパク質を与える大麻種子抽出物、1.2 5gバクトペプトン、3gグルコース、および1.5gコーン油を含有する(Lord，Jeffr ey C．およびRoberts，Donald W.(1986)「The effects of culture medium qual ity and host passage on zoosporogensis and infectivity of Lagenidium gig anteum(Oomycetes:Lagenidiales)」，J．Invertebr．Pathol．48:355-361)。 発酵に用いられるとき、上記の公開された培地の処方のすべてが、ほぼ同じ数 量の細胞を生じ、感受性の蚊をほぼ同じ割合で感染させる。それゆえ、Lagenidi um giganteumのような生物調節剤の収量および感染力を増大させるためには、発 酵培地の改良が必要である。 発明の要旨 発酵に使用される培地は、3.6g/Lのペプトン；3.0g/Lの自己融解酵母抽出物； 3.6g/Lのペプトン；1.5〜3.0g/Lの自己融解酵母抽出物；1.6g/Lの綿実粉 ース（デキストロース）；2.5g/Lのパーム油；0.2g/Lのコレステロール；0.6g/L のCaCl₂・2H₂O；0.2g/LのMgCl₂・6H₂O、および必要に応じて0.0〜2.0g/Lのレシチ ンから本質的になる。この培地は、先行技術の培地と比較して、Lagenidium gig anieumの収量を増加させ、そしてレシチンを培地に含めた場合、生物の収量およ び感染力はさらに増加する。好ましい実施態様の説明 本発明は、発酵用の改良培地に関する。この培地は、収量を公知の培地より少 なくともほぼ２〜３倍に増加させる。本発明は、Lagenidium giganteum（蚊に対 する生物調節剤）の大量生成に有用である。 定義 本明細書中に使用された用語「発酵」とは、特殊化容器における細胞または微 生物の生育の過程をいう。「栄養培地」（「培地」）とは、生物の生育を支持す る固体または液体の基質をいう。 本発明の好ましい実施態様では、栄養培地は下記のように調製される。； 3.6g/Lペプトン； 1.5〜3g/L自己融解酵母抽出物； 1.6g/L綿実粉； 2.0〜7.75g/Lグルコース（デキストロース）； 2.5g/Lパーム油； 0.2g/Lコレステロール； 0.6g/L CaCl₂・2H₂O：および 0.2g/L MgCl₂・6H₂O。 脱イオン水を最終容量1Lになるように加え、pHを6.5に調整する。本構成要素 を溶解するまで加熱し、次いで培地を121℃、15p.s.i.、30分間のオートクレー ブにより滅菌する。Lagenidium giganteumの発酵に使用したとき、この培地は公 知の培地より収量が少なくとも２〜３倍増加する。 別の好ましい実施態様では、栄養培地は、上記処方に2.0g/Lまでのレシチンを 添加することにより調製される。 以下の実施例は、単に例示の目的で提供され、いかなるようにも本発明を限定 すると解釈されるべきではない。 実施例１ 異なった培地でのLagenidium giganteumの増殖率の振盪フラスコ比較 並行振盪フラスコ実験において、新規栄養培地での増殖率を２つの他の培地と 比較した。 培地＃１： 1.25gグルコース（デキストロース） 1.25ｇペプトン 1.25g自己融解酵母抽出物 2.0gコーン油 1.0gパーム油 0.03gコレステロール 0.4g CaCl₂・2H₂O 0.2_g MgCl₂・6H₂O 培地＃２： 1.2gペプトン 1.2g自己融解酵母抽出物 3.0gグルコース（デキストロース） 0.5ｇコレステロール 新規栄養培地 3.6gペプトン 3.0g自己融解酵母抽出物 1.6g Proflo綿実抽出物 2.0gグルコース（デキストロース） 2.5gパーム油 0.2gコレステロール 0.6g CaCl₂・2H₂O 0.2g MgCl₂・6H₂O それぞれの培地を調製するとき、全成分を混合し、脱イオン水を最終容量１Ｌ になるように加えた。pHを6.5に調整した。内容物は溶解するまで電子レンジで 加熱し、次いで121℃,15psiで30分間滅菌した。それぞれの培地については、９ 個の250mLフラスコに、それぞれ50mLの培地を満たした。ペトリ皿から採取したL agenidium giganteum(カリフォルニア株)のディスクを、それぞれのフラスコに 接種するために使用した。フラスコは温度調節回転振盪機で120rpm、29℃で、７ 日間振盪した。真菌の塊を5200rpm、18℃で、20分間遠心して細胞を採集した。 遠心された細胞の塊は、重量を測り、また血球計により細胞数を計測した。平均 細胞数を記録した。結果は表１に要約する。 培地＃１および培地＃２は、各実験において、培地1mLあたりでほぼ同じ数の 細胞を生じた。培地＃１または培地＃２のいずれと比較しても、新規栄養培地は 1mLあたりの細胞数を一貫して増加した。Lagenidium giganteumの平均収量は、 新規栄養培地で生育させたとき、ほぼ3.5倍に増加した。実施例２ レシチンを添加した新規培地の振盪フラスコ比較 実施例１の新規の培地処方が、公知の培地より細胞収率を増加させるというこ とが確立されたが、デキストロースおよび酵母抽出物の量を変えること、および 1.0gまたは2.0gのレシチンを基本の新規培地に加えることの影響を試験した。全 ての培地をラージプローブで70%の速度で10〜15秒間ホモジナイズし、構成成分 培地のpHを6.5になるように調整し、実施例１のように滅菌した。それぞれの培 地について、実施例１に記載のように、３つの250mlフラスコにそれぞれ50mlの 培地を満たし、接種し、培養し、そして採集した。結果は表２および表３に要約 する。 表２に示したように、レシチンなしの培地では１mLあたりの細胞収量の平均は 3.6×10⁵である。レシチン入りでは収量は4.63×10⁵で細胞/mLである。実施例３ 様々な培地で生育したLagenidium giganteumの感染度 Lagenidium giganteumは、実施例２に記載の新規培地にレシチンを含まないも の、0.1000重量%または0.2000重量%のレシチンを含む培地で生育させた。培養条 件は実施例１の記載と同様であった。細胞濃度を計算し、そしてそれらの5000;2 500;1250および675細胞/mLの濃度で蚊の殺傷能力を計測した。結果は、表３に２ 組の実験の平均として要約する。 これらの結果から、新規培地で生育させたLagenidium giganteumは、レシチン を加えない培地で生育させた細胞より、より多くの蚊を殺傷したことがあきらか である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 マローン，パメラ ジー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 95616, デイビス，ビクトリア 3333

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．発酵において使用される培地であって、以下から本質的になる、培地： (a)3.6g/Lペプトン； (b)1.5〜3g/L自己融解酵母抽出物； (c)1.6g/L綿実粉； (d)2.0〜7.75g/Lグルコース（デキストロース）； (e)2.5g/Lパーム油； (f)0.2g/Lコレステロール； (g)0.6g/L CaCl₂・2H₂O；および (h)0.2g/L MgCl₂・6H₂O。 ２．2.0g/Lまでのレシチンをさらに含む、請求項１に記載の培地。 ３．Lagenidium giganteumの培養に用いられる、請求項１に記載の培地。 ４．Lagenidium giganteumの培養に用いられる、請求項２に記載の培地。