CN103070199B - 一种灭蚊凝胶剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灭蚊凝胶剂，它是以Pythium sp.GY1938游动孢子为活性成分，加上辅料制备而成的凝胶剂，所述凝胶剂含有如下用量的组分：Pythium sp.GY1938游动孢子1×10101011个/L、1/4~2×常用真菌培养基和凝固剂1~8g/L。本发明还公开了该灭蚊凝胶剂的制备方法。本发明灭蚊凝胶剂灭蚊效果优良，稳定性好，制备方法简单，成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种灭蚊凝胶剂。
背景技术
蚊虫属双翅目昆虫，可以传播疟疾、丝虫病、黄热病和登革热扥多种蚊媒疾病，威胁人类健康，其发育属于变态发育，需历经卵、幼虫（孑孓）、蛹、成虫4个时期。与成虫相比，蚊蚴须高密度生活在水中，所以水生阶段是大规模杀灭蚊虫、从源头防治蚊媒疾病最有效的切入点。目前，蚊虫防治的常用手段仍以传统的化学药剂杀灭为主，但化学农药存在环境污染、生态平衡被破，并导致害虫产生抗药性。生物防治是采用害虫天敌或可对害虫致病的微生物来控制或杀灭害虫。它有对害虫高度特异性，对非靶生物无毒无害，不污染环境，不破坏生态平衡，不易诱导害虫的抗药性的优点，是较为理想的害虫防治方法。
Pythium sp.GY1938是由贵阳医学院苏晓庆教授从中国西南土壤中分离得到的丝状腐霉Pyghium guiyangense，于2005年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCC NO：M205020，又名：贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su，GY，Pggy)，记载在专利申请号：200510003027.7，发明名称：“一种腐霉属菌种及其用途”的专利申请中。该腐霉能够对尚处于水生阶段、高度密集的蚊蚴——孑孓进行有效灭杀，可以有效切断蚊虫传播疾病的途径，但是，其灭蚊的应用尚处于起步阶段，因腐霉只有在有活力的情况下才能灭蚊，直接将腐霉制成灭蚊产品，活力差，难以满足实际应用的需要，目前，还未见报道使用该腐霉制备的灭蚊产品。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种灭蚊凝胶剂。本发明的另一技术方案是提供了该灭蚊凝胶剂的制备方法。
本发明灭蚊凝胶剂，它是以Pythium sp.GY1938游动孢子为活性成分，加上辅料制备而成的凝胶剂，所述凝胶剂含有如下用量的组分：Pythiumsp.GY1938游动孢子1×10101011个/L、1/4~2×常用真菌培养基和凝固剂1~8g/L。
1/4~2×常用真菌培养基：溶质浓度为常用真菌培养基1/4~2倍的培养基。常用真菌培养基，是指用于真菌培养的常规培养基，如马丁氏培养基、察氏培养基、马铃薯培养基。
本发明Pythium sp.GY1938，于2005年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCC NO：M205020，又名：贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su，GY，Pggy)。
凝固剂：是使溶液凝固为不溶性凝胶状态的添加剂，又被称为组织硬化剂。
优选地，所述凝胶剂含有如下用量的组分：Pythium sp.GY1938游动孢子5×1010个/L、1/4×常用真菌培养基和凝固剂1g/L。
优选地，所述常用真菌培养基为KPYG2培养基，所述培养基每升含有如下成分：蛋白胨1.5g、酵母膏0.5g、葡萄糖3g、胆固醇25mg、氯化钙110mg、植物油10g，余量为水。所述植物油为玉米油。
其中，所述凝固剂是琼脂、明胶或硅胶。
其中，所述凝胶剂中还包括如下辅料：抗逆保护剂5~25g/L、抗孢子萌发剂20~30g/L和/或乳化剂0.1~1g/L。
抗逆保护剂，是指在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下维持生命体的生命过程和生物特征的物质。
抗孢子萌发剂：抑制孢子萌发的物质。
乳化剂：乳浊液的稳定剂，是一类表面活性剂。
优选地，所述抗逆保护剂的用量为10g/L；所述抗孢子萌发剂的用量为25g/L；所述乳化剂的用量为0.5g/L。
优选地，所述抗逆保护剂为海藻糖、丙三醇或赤藻糖醇；所述抗孢子萌发剂为惰性油剂；所述乳化剂为Tween-80或OP-10。
所述惰性油剂为玉米油、色拉油、菜籽油或矿物油。
本发明灭蚊凝胶包括如下步骤：
a、按前述配比取Pythium sp.GY1938游动孢子和辅料；
b、将辅料混匀，溶化，调pH值至7.0~10.0，冷却至40~60℃，加入游动孢子，匀浆搅拌，得凝胶混悬液，成型，即可。
本发明以Pythium sp.GY1938孢子为活性成分，以1/4~2×常用真菌培养基、凝固剂、抗逆保护剂、惰性油剂和乳化剂为辅料，成功制备得到灭蚊凝胶剂，凝胶剂中孢子保持休眠状态，活力强，稳定性好，放置1个月后投放水体，灭蚊活性好，持续时间长，使用方便，不会污染环境，生产工艺简单，成本低廉，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1孢子形态观察结果（激光共聚焦显微镜Olympus FV1000，Calcofluor White M2R）A.明场，10×40×1.6；B.365nm激发，10×40×1.6；C.merge，10×40×1.6
图2KPYG2的终浓度对本发明灭蚊凝胶剂中孢子活力的影响
图3海藻糖的终浓度梯度（g/L）对本发明灭蚊凝胶剂中孢子活力的影响
图4惰性油剂（25g/L）对本发明灭蚊凝胶剂中孢子活力的影响
图5乳化剂终浓度梯度（‰）对本发明灭蚊凝胶剂中孢子活力的影响
图6本发明灭蚊凝胶剂实验室灭蚊结果
具体实施方式
实施例1本发明灭蚊凝胶剂的制备
取1/4KPYG2培养基（组成：蛋白胨0.375g，酵母膏0.125g，葡萄糖0.75g，胆固醇6.25mg，氯化钙27.5mg，玉米油2.5g，加水至1L），加入海藻糖10g，玉米油25g，OP-100.5g，调pH值至7.0~10.0，加入琼脂粉1g，溶化，冷却至60℃，加入Pythium sp.GY1938孢子至数量为5×1010个，匀浆搅拌，得凝胶混悬液，立即置于模具中，凝固后切块定型，4～8℃封装保存。
实施例2本发明灭蚊凝胶剂的制备
取2×KPYG2培养基（组成：蛋白胨3g，酵母膏1g，葡萄糖6g，胆固醇50mg，氯化钙220mg，玉米油20g，加水至1L），调pH值至7.0~10.0，加入琼脂粉8g，溶化，冷却至40℃，加入Pythium sp.GY1938孢子至数量为1×1011个，匀浆搅拌，得凝胶混悬液，立即置于模具中，凝固后切块定型，4～8℃封装保存。
实施例3本发明灭蚊凝胶剂的制备
取1/2KPYG2培养基（组成：蛋白胨0.75g，酵母膏0.25g，葡萄糖1.5g，胆固醇12.5mg，氯化钙55mg，玉米油5g，加水至1L），加入海藻糖25g，玉米油30g，OP-101g，调pH值至7.0~10.0，加入琼脂粉2g，溶化，冷却至60℃，加入Pythium sp.GY1938孢子至数量为1×1010个，匀浆搅拌，得凝胶混悬液，立即置于模具中，凝固后切块定型，4～8℃封装保存。
实施例4本发明灭蚊凝胶剂的制备
取1/4马铃薯培养基（组成：马铃薯50g，葡萄糖5g，加水至1L），加入赤藻糖醇5g，菜籽油20g，Tween-800.1g，调pH值至7.0~10.0，加入明胶粉0.5g，溶化，冷却至60℃，加入Pythium sp.GY1938孢子至数量为5×1010个，匀浆搅拌，得凝胶混悬液，立即置于模具中，凝固后切块定型，4～8℃封装保存。
下面以实验例的方式说明本发明的有益效果：
实验例1本发明灭蚊凝胶剂的制备及应用
1、材料、主要试剂与仪器
Pythium sp.GY1938高毒力菌株，贵阳医学院苏晓庆教授赠送，常规保存，定期转种。
SFE培养基：将100g葵花籽粉碎，浸泡于1000ml ddH2O中，6层纱布过滤，再加1000ml ddH2O蒸馏水，分装贮存于-20℃，临用时取出解冻，用ddH2O稀释1倍，pH9.0。
KPYG2常规传代培养基：：蛋白胨1.5g/L，酵母膏0.5g/L，葡萄糖3.0g/L，胆固醇25mg/L，氯化钙110mg/L，玉米油10g/L，pH9.0。
KPYG2标准固体培养基：蛋白胨1.5g/L，酵母膏0.5g/L，葡萄糖3.0g/L，胆固醇25mg/L，氯化钙110mg/L，玉米油10g/L，4g/L琼脂粉，pH9.0。
1/2KPYG2固体培养基：蛋白胨0.75g/L，酵母膏0.25g/L，葡萄糖1.5g/L，胆固醇12.5mg/L，氯化钙55mg/L，玉米油5g/L，2g/L琼脂粉，pH9.0。
1/2KPYG2定型固体培养基：蛋白胨0.75g/L，酵母膏0.25g/L，葡萄糖1.5g/L，胆固醇12.5mg/L，氯化钙55mg/L，玉米油5g/L，2g/L琼脂粉，20g/L海藻糖，pH9.0。
1×PBS含NaCl8.5g/L，Na2HPO4·12H2O3.5g/L，NaH2PO4·2H2O0.25g/L，pH7.6。
Calcofluor White M2R（Sigma）。
供试蚊虫：致倦库蚊（Culex quinquefasciatu）1龄幼虫（孑孓），采自四川省成都市新都镇稻田。
Sorvall Biofuge Stratos台式高速冷冻离心机(Thermo)；MJPS-150霉菌培养箱（上海精宏）；ZHWY-200B恒温摇床（上海智诚）；SW-CJ-1F超净工作台（苏州苏净）；激光共聚焦显微镜Olympus FV1000。
2、本发明灭蚊凝胶剂的制备
（1）菌种活化与传代
无菌接种环挑取KPYG2斜面培养基上Pythium sp.GY1938保种菌丝体，接种于90mm SFE固体培养基中央，25±1℃倒置培养7d，观察菌丝形态；无菌手术刀片切取培养皿周边新鲜菌丝块（1.0×1.0cm2），倒置于SFE固体培养基中央，25±1℃常规培养，每7d传代一次。
（2）游动孢子制备和收集
从KPYG2固体传代培养基上挑起少许菌丝，接种于100ml KPYG2液体培养基中，25±1℃，110r/min，振荡培养72h，无菌纱布过滤，1×PBS缓冲液冲洗2次，无菌刮勺收集菌丝体，20ml1×PBS重悬菌丝体，匀浆搅拌器中速搅拌5～10min，得到长度约为0.5～1.0cm的菌丝体悬液，取0.5ml菌丝体悬液，均匀涂布于KPYG2固体传代培养基上，25±1℃培养8d，用无菌打孔器取直径为1.5cm菌丝块备用；按1：40比例（1个菌丝块/40ml dd H2O）将适量菌丝块与dd H2O混匀，25±1℃静置24h，轻柔混匀，取20ul孢子液，CalcofluorWhite M2R染色，荧光显微镜（WU激发，365nm)观察孢子状态；4层无菌纱布过滤去除残余菌丝体，收集孢子悬液，25±1℃，10000r/min离心10min，小心弃上清，dd H2O重悬孢子沉淀，调整孢子浓度至108个/ml。
（3）“游动孢子－KPYG2”凝胶剂型制备
按1：1体积比例将调整好浓度的孢子悬液加入1/2KPYG2定型固体培养基（需预热，冷却至60℃左右），适当匀浆搅拌，得到“游动孢子－1/4KPYG2”凝胶混悬液，立即将孢子凝胶混悬液倒入模具（长10.0cm，宽10.0cm，高1.0cm），凝固彻底后切块定型（2.0×2.0×1.0cm3），即得本发明灭蚊凝胶剂，无菌塑封，4～8℃保存。
3、凝胶剂的辅料筛选
（1）营养剂
以KPYG2培养基为孢子的营养载体并优化其浓度梯度，使其在凝胶剂中的终浓度分别为2×KPYG2，1×KPYG2，1/2×KPYG2，1/4×KPYG2，1/8×KPYG2。
（2）抗逆剂
对海藻糖浓度进行梯度选择，使其在凝胶剂中的终浓度分别为5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L。
（3）抗孢子萌发剂
在辅料中添加终浓度为25g/L的惰性油剂，提高孢子凝胶剂的孢子贮存稳定性。候选植物油包括市售玉米油、色拉油、菜籽油，矿物油包括煤油、石蜡油。
（4）乳化剂
在辅料中添加惰性油剂，使其在凝胶剂中的终浓度分别为Tween-80（0.5g/L，1g/L，1.5g/L,2g/L）或OP-10（0.5g/L，1g/L，1.5g/L,2g/L）。
4、生物活性测定
（1）活力实验
随机抽取20组4～8℃下保存1m的本发明灭蚊凝胶剂制品，观察制剂中孢子萌发状态；并将凝胶剂置于KPYG2常规传代固体培养基上常规培养7d后，监测菌丝生长状态及速度，把有菌丝生长且菌丝体生长超过1cm的制剂标记为合格，统计合格率。
（2）实验室灭蚊实验
取2只容积为200ml的塑料杯，各加注100ml脱氯水，分别标记为实验组和对照组；实验组加入2块高活力本发明灭蚊凝胶剂（各成分配比为上述优选的配比，凝胶剂保存时间为1.0m），对照组加入2块“KPYG2凝胶块”；待实验组孢子萌发后，再各自滴加6滴4％兔肝粉悬液和25只第一龄致倦库蚊幼虫，室温喂养（25±1℃，湿度为60～70％，明场：暗场=14h:10h），每日观察2次，连续观察7d，将死亡幼虫挑出，镜下观察确认系由真菌感染致死，记录蚊蚴感染数量，并统计蚊蚴感染率。
5、实验结果
（1）孢子生长活力
如图1所示，本发明灭蚊凝胶剂放置1月后，孢子未萌发，说明本发明灭蚊凝胶剂可以维持孢子的休眠状态，活力强；
如图2所示，经过7d培养，本发明灭蚊凝胶剂均有菌丝体长出；辅料为1/4~2×KPYG2时，孢子活力高，活力实验合格率达35%以上，辅料为1/8×KPYG2时，孢子活力低，活力实验合格率仅为13％；综合成本和合格率，1/4×KPYG2最优，活力实验合格率为45％，成本也较低。
如图3所示，在本发明灭蚊凝胶剂中添加5~25g/L海藻糖，可以提高孢子活力，海藻糖终浓度终浓度为10g/L时，孢子活力最高，活力实验合格率可升至68％。
如图4所示，菜籽油、煤油和石蜡油均显示出较好的抗孢子萌发效果，菜籽油对水体环境影响较小。
如图5，Tween-80和OP-10作为乳化剂辅料均有助于惰性油剂成分的均匀分散，维持孢子休眠，Tween-80和OP-10对孢子活力有一定抑制作用，综合孢子活力与孢子休眠，在本发明凝胶剂中加入OP-10，更为优良。
根据上述活力实验结果，优化后孢子和辅料的配比应为：游动孢子5×107个/ml，1/4×KPYG2，10g/L海藻糖，25g/L菜籽油，0.5‰OP-10乳化剂。
（2）实验室灭蚊效果
表1实验室灭蚊效果
由图6和表1可以看出，本发明灭蚊凝胶剂放置1个月后，灭蚊效果仍然非常优良，说明其稳定性强，保质期长；投入水体后，不会立即产生灭蚊效果，1~3天后具有灭蚊效果，随着时间延长，灭蚊效果增强，且持续时间长。
综上，本发明灭蚊凝胶剂灭蚊效果良好，持续时间长，稳定性好，可长期保存，制备工艺简单，具有良好的市场应用前景。
Claims (3)
1.一种灭蚊凝胶剂，其特征在于：它是以Pythium sp.GY1938游动孢子为活性成分，加上辅料制备而成的凝胶剂，所述凝胶剂含有如下用量的组分：Pythium sp.GY1938游动孢子5×1010个/L、1/4×常用真菌培养基和凝固剂1g/L；所述常用真菌培养基为KPYG2培养基，所述培养基每升含有如下重量的成分：蛋白胨1.5g、酵母膏0.5g、葡萄糖3g、胆固醇25mg、氯化钙110mg、植物油10g，余量为水；
所述植物油为玉米油；所述凝固剂是琼脂、明胶或硅胶；所述凝胶剂中还包括如下用量的辅料：抗逆保护剂5～25g/L、抗孢子萌发剂20～30g/L和/或乳化剂0.1～1g/L；
所述抗逆保护剂为海藻糖、丙三醇或赤藻糖醇；所述抗孢子萌发剂为惰性油剂；所述乳化剂为Tween-80或OP-10；
所述惰性油剂为玉米油、色拉油、菜籽油或矿物油。
2.根据权利要求1所述的灭蚊凝胶剂，其特征在于：所述抗逆保护剂的用量为10g/L；所述抗孢子萌发剂的用量为25g/L；所述乳化剂的用量为0.5g/L。
3.一种制备权利要求1或2所述灭蚊凝胶剂的方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、按权利要求1或2所述配比，取Pythium sp.GY1938游动孢子和辅料；
b、将辅料混匀，溶化，调pH值至7.0～10.0，冷却至40～60℃，加入游动孢子，匀浆搅拌，得凝胶混悬液，成型，即可。
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