CN1175740C - 一种生物杀线虫剂的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物杀线虫剂的生产方法，属生物农药技术领域。该生产方法的工序包括微生物菌种培养，微生物的大量繁殖及菌剂加工。本发明使用的微生物为指状节丛孢(Arthrobotrys dactyloides)LX-Ad菌株，该菌株2002年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.0805。利用本发明生产的菌剂对植物寄生线虫有很好的防效。具有原料成本低，生产工艺先进，菌体产量高，所制成的菌剂对植物寄生线虫有很好的防效等优点。

Description

一种生物杀线虫剂的生产方法

技术领域：

本发明涉及一种生物杀线虫剂的生产方法，属生物农药领域。

背景技术：

植物寄生线虫可以危害多种重要的农作物、园艺植物和松树等，造成的的危害十分严重的，据FAO统计，全球每年因线虫危害造成的损失高达1000亿美元。目前对线虫的防治仍然以化学防治为主，但由于化学杀线虫剂多数是高毒、高残留农药，对人蓄和环境造成严重的威胁。有的化学杀线虫剂，如用作土壤熏蒸剂的溴甲烷类等，已经在全球多数国家禁止使用或已经规定使用的最后期限。因此开发有效的线虫生防菌剂十分重要。

在线虫的天敌微生物中，食线虫真菌(nematophagous fungi)是最有研究和开发价值的重要资源之一。食线虫真菌按其侵染线虫的机制可以分为四大类：捕食菌，内寄生菌，机会菌和产毒菌。捕食菌(nematode trapping fungi)是指通过菌丝特化形成捕食器(predacious device)，利用捕食器捕杀线虫。捕食菌形成的捕食器目前共发现的有七大类：三维菌网，收缩环，非收缩环，粘球，粘性分枝，粘性菌丝和冠囊体。捕食菌形成的收缩环(constricting ring)是由三个细胞构成，通过一段短的菌丝(2-3个细胞构成)与营养菌丝相连接，收缩环分泌一些物质诱吸线虫穿入环内，一旦线虫接触收缩环，环细胞在千分之一秒的时间内很快收缩，将线虫紧紧地套住。之后，环细胞分泌一些侵染酶，如蛋白酶等，降解线虫的体壁，随后菌丝侵入线虫体内，利用线虫作为营养不断生长繁殖，最后导致线虫死亡。

目前利用捕食菌开发的线虫生防制剂已经有2个商业化产品，一个是利用粗壮节丛孢(Arthrobotrys robusta)开发的Royal 300。在法国用于防治双孢蘑菇线虫，使蘑菇产量比对照提高25％(Cayrol et al.，1978)。另一个是利用不规则节丛孢(A.irregalaris)开发的Royal 350。在法国用于防治番茄根结线虫。所利用的这两种捕食菌都是以三维菌网捕食线虫，捕食器为三维菌网的捕食菌在土壤中营腐生生活的能力比形成其它类型捕食器的捕食菌要强，一般要有线虫诱导才能产生捕食器，因此，在营养丰富的土壤中很难产生捕食器捕捉线虫，导致防治效果不稳定。

发明内容：

本发明的目的是利用捕食线虫真菌指状节丛孢(Arthrobotrys dactyloides)LX-Ad菌株制备防治根结线虫的菌剂。

本发明利用捕食线虫真菌指状节丛孢(Arthrobotrys dactyloides)LX-Ad菌株或由该菌株产生的各种突变株，通过固体和液体培养方法，获得菌体培养物(包括菌丝，分生孢子和代谢物质)，添加农业上允许使用的填充料，粘合剂，表面活性剂等有利于有效成分施用和分散的物质制成种粉剂，颗粒剂，可湿性粉剂等可用于防治根结线虫Meloidogyne spp的菌剂。

本发明通过以下步骤实现：(1)微生物菌种的培养(包括微生物试管斜面种子培养、微生物液体种子培养)；(2)将液体种子接入固体培养料中或液体培养料中，通过固体培养条件或液体培养条件培养，获得大量的菌体培养物；(3)根据剂型需要将菌体培养物与相应的填充料，粘合剂，表面活性剂等有利于有效成分施用和分散的物质制成粉剂，颗粒剂和可湿性粉剂等植物寄生线虫生防菌剂。

本发明使用的微生物是指状节丛孢(Arthrobotrys dactyloides)LX-Ad菌株或由该菌株通过突变、遗传改造获得的衍生物。该菌株已于2002年10月9日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.0805。其特征是：在CMA培养基(玉米粉20克，琼脂18克，水1000毫升)上培养7-14天，菌落白色，菌丝无色，分枝，分隔，分生孢子梗直立，不分枝，长200-600μm，顶端形成小齿梗，小齿梗上着生棒状分生孢子，分生孢子一个分隔，大小为35-60×7-9μm，小型分生孢子长棍棒形至梨形，有时稍弯，0-2个分隔，大小为16-26×3-5μm。该种微生物以收缩环捕食线虫。

微生物斜面种子培养方法：(为叙述方便，将成分为：糖蜜20g，玉米粉5g，硫酸铵5g，氯化钠6g，硫酸二氢钾0.5g，柠檬酸三钠4.5g，水1000ml的培养基命名为MC培养基)将微生物的菌丝或孢子接种到MC培养基斜面上，15-35℃下培养4-20天后获得斜面种子。

液体种子的培养方法：将斜面种子接种到三角瓶中的MC液体培养基中，15-35℃，摇床培养(转速为50-200rpm，培养3-7天)，也可以静止培养(4-14天)。

微生物固体培养条件下的大量繁殖方法：固体培养料的成分可以是单一的麦麸，小麦粒或粉，高粱粉，玉米粉或者粒，红薯粉，米糠，大米，棉籽壳，禾本科植物的茎叶粉碎物，淀粉，黄豆粉，也可以是其中的两种或两种以上成分的组合。将固体培养料用水润湿，调节水分含量至混合物重量百分比的20-45％，用塑料袋(瓶)，玻璃瓶或浅盘等容器装料，灭菌后用斜面种子或液体种子接种，15-35℃下培养10-60天。

微生物液体培养条件下的大量繁殖方法：将斜面菌种接种到MC平板上，20-29℃下培养4-10天获得平板种子，取平板种子菌丝块15-40块(直径＝3mm)，接种到装有1升MC培养基的2升三角瓶中，在20-29℃，转速为100-250 rpm的摇床上培养4-8天后的培养物作为在20立升，50立升，1000-4000立升发酵罐生产这种微生物时的接种体。在20立升，50立升中发酵罐的培养温度控制在28-32℃，培养时间40-96小时。在1000-4000立升发酵罐中的培养温度控制在25-37℃，作为一级种时培养时间为48-120小时。将一级种接入10000-30000立升发酵罐，培养温度控制在28-35℃，培养时间为96-150小时，在发酵罐中培养的转速为300-500rmp。

菌剂各种剂型的制备如下：

粉剂的制备：微生物大量菌体制备好以后作为原药与粉碎(粒径小于1毫米以下)的单一或组合的各种植物、矿物或合成材料的填料(如草粉，米糠，木屑，滑石，叶蜡石，高岭土，膨润土，凹凸棒土，硅藻土，陶土，草炭等)和助剂(如烷基芳基聚氧乙基醚，脂肪醇，氧乙基醚，烷基萘磺酸盐，木质素磺酸盐以及它们的复配物)混合，混合物中微生物的重量百分比为15-75％。混合之后将水分相对湿度调节到10％以下，包装，室温或4-10℃下保存。

颗粒剂的制备：按粉剂的方法将菌体与填料和助剂混合，用造粒机制成直径为1-4mm，长度为0.5-8cm的颗粒，在30-35℃下烘干到水分含量小于10％，制成颗粒剂。颗粒剂中微生物的重量百分比为15-75％。

可湿性粉剂的制备：微生物大量发酵生产以后，将发酵物与填料(同粉剂)，润湿剂(茶枯，皂角，土温60，拉开粉，洗衣粉，十二烷基苯磺酸钠等)，分散剂(No，NNO，PolyFON，SOPA，HO，拉散剂MF等)，稳定剂(如抗坏血酸)均匀混合，将水分调节到2％以下。在制备时先将微生物发酵物以外的成分混合并粉碎小于44微米后再与菌体混合。可湿性粉剂中微生物的重量百分比为15-75％。

以上菌剂的使用方法可以是拌种，拌土穴施、沟施，也可以是喷雾。

以上菌剂的使用时期可以是种子期，苗期和成株期。

本发明产品对根结线虫的防治试验：

试验一液体培养法制备的粉剂防治根结线虫的室内和温室实验

1.试验菌剂：粉剂(其中，填料为85％草炭，15％硅藻土，助剂为烷基萘磺酸盐和木质素磺酸盐，菌剂中微生物的重量百分比为15％)。

2.试验方法：将粉剂与沙土(40％的粗沙，10％的细沙，5煤渣，45％的泥土)混合。设以下处理，a.以20g菌剂/升沙土的比例混合，b.以10g菌剂/升沙土的比例混合，c.以5g菌剂/升沙土的比例混合，d.用经高温灭菌的菌剂，以10g菌剂/升沙土的比例混合，e.不加菌剂的沙土。

室内实验是取200ml的每种土样放到250ml有螺旋盖的的容器内，轻轻压实，接种花生根结线虫(Meloidogyne incognita)的卵约10000粒，将湿度调到8％，盖上盖子后将整个容器置于一密闭的温度为25℃，湿度为100％的大容器中，放置4周后，用漏斗分离法(Whitehead and Hemming，1965)分离、记数土壤中的线虫。

温室实验是以10g菌剂/升沙土的比例混合，在直径为15cm的塑料钵中填加1000ml菌剂-沙土混合物，设5个重复，接种花生根结线虫(Meloidogyne incognita)的卵约10000粒/钵，2周后，移栽刚发芽的番茄种子，每钵2粒。4周后记数根系上的瘤结数。以不加菌剂的沙土做对照。

3.结果：

室内试验结果显示(表1)，在每升沙土加10g菌剂的处理中，菌剂对花生根结线虫(M.incognita)卵的致死率高达92.36％。

    表1：菌剂对花生根结线虫M.incognita卵的致死率(％)

    处理                幼虫数量           致死率

    A                    73                94.07

    B                    94                92.36

    C                    521               57.64

    D                    1175              4.47

    E                    1230              /

温室试验的结果为对照的瘤结数为302个/株，菌剂处理的瘤结数为64个/株，瘤结减少率为78.80％。

试验二  固体培养法制备的颗粒剂防治根结线虫的温室实验

1.试验菌剂：颗粒剂(其中，填料为75％草炭，10％硅藻土，15％高岭土，助剂为烷基萘磺酸盐和木质素磺酸盐，菌剂中微生物的重量百分比为75％)。

2.试验方法：按试验一的方法进行。

3.结果：对照的瘤结数为351个/株，菌剂处理的瘤结数为43个/株，瘤结减少率为84.9％。

试验三  颗粒剂防治根结线虫的温室实验

1.试验菌剂：本发明液体培养法制备的颗粒剂，其中，填料为75％草炭，10％硅藻土，15％高岭土，助剂为烷基萘磺酸盐和木质素磺酸盐，菌剂中微生物的重量百分比为45％。

对照药剂：5％涕灭威颗粒剂(山东宁阳化工厂)

2、试验处理

(1)生物杀线虫颗粒剂1千克/亩

(2)生物杀线虫颗粒剂1.5千克/亩

(3)生物杀线虫颗粒剂2千克/亩

(4)生物杀线虫颗粒剂2.5千克/亩

(5)5％涕灭威颗粒剂1千克/亩

(6)5％涕灭威颗粒剂2.5千克/亩

(7)空白对照

3、实验方法

供试作物为烟草(Nicotiana tabacum)的云烟87品种，感染花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)；地点为云南嵩明县接届村，黄壤土。试验小区面积为20平方米，每处理四次重复，小区排列采取随机排列法。在烟苗移栽时，将药剂与部分土壤混合，施于根际，实验期间按常规管理。实验时间2001年5月1日至2001年8月30日。

4、调查方法

2001年8月30日烟叶全部采收后调查根结病情指数，病株率，土壤中的幼虫数，平均每克根系的卵粒数，雌虫数。病情指数按烟草病害药效试验方法Y/cT40-1996计算。防治效果＝对照线虫数[幼虫+卵+雌虫]-处理线虫数]/对照线虫数*100％。

5、实验结果

                            表1实验结果

处理	幼虫数(条/200cm3土)	卵粒数(粒/100克根)	雌虫数(条/100克根)	病情指数	防治效果(％)	差异显著性(P＝0.01)
							对照	106	875	87	9.7	0	A
(1)	72	543	65	6.7	36.3	B
							(5)	65	434	53	3.4	48.3	B

(2)	56	312	21	4.5	63.6	C
							(3)	42	172	19	3.8	78.2	D
(4)	31	159	12	3.3	81.1	D
							(6)	27	127	9	3.2	84.7	D

6.结果分析

从表1可以看出，使用本发明制备的菌剂对田间防治烟草根结线虫都有不同程度的防治效果，与对照相比较能显著降低田间的线虫数量，根结线虫造成的危害明显比对照减轻。防治效果随施用量的增加而增加，当施用量在2.0-2.5千克/亩的防治效果没有显著性差异，防效在78.2-81.1％之间，其防治效果与每亩施用2.5千克5％涕灭威颗粒剂(防效84.7％)相当。从表中结果可以看出用本发明制备的菌剂在田间的施用量适宜在每亩2千克左右。

本发明具有原料成本低，生产工艺先进，菌体产量高，所制成的菌剂对植物寄生线虫有很好的防效等优点。

具体实施方式：

实施例1：液体培养小规模化制备粉剂的方法

在20升发酵罐发酵的具体方法和工艺是：在发酵罐中装入16升MC培养基中，121℃灭菌90分钟，接入1升液体培养菌种，在通气率为0.7，转速为450rpm，温度为28℃的条件下培养4天。然后用板框过滤去2/3的液体，按60毫升菌体∶40克草炭的比例混合，在32℃下烘干到水分含量小于10％，这样制备的菌剂中微生物的重量百分比约60％。最后用塑料袋密封，室温保存于通风避光处。

实施例2：液体培养大规模化生产制备粉剂的方法

按液体种子∶MC培养基＝1∶20(V/V)的比例将种子接入装有3200立升MC培养基的4000立升发酵罐中，32℃，450rpm，培养96小时后接入装有28000立升MC培养基30000立升发酵罐，32℃，450rpm条件下培养4天。按实例1中的方法生产和制备粉剂，其中，按菌体(体积)∶草炭(重量)∶硅藻土(重量)＝45毫升∶45克∶10克的比例混合，这样制备的菌剂中微生物含量约45％。

实施例3：固体培养小规模化生产制备颗粒剂的方法

将培养料(25％麦麸，45％红薯粉，25％草粉，5％黄豆粉)混合均匀，用适量的水调节培养料的水分含量到35％，然后将培养料装入塑料袋，每袋1公斤，121℃下灭菌4小时，冷却后在塑料袋培养料的两端分别接种5毫升液体种子，25℃下培养30天后，将菌丝长满培养料按体积比为1∶1与25％的硅藻酸钠溶液混合，然后用造粒机制成直径为4mm，长度为4.5cm的颗粒，在32℃下烘干到水分含量小于10％，制成颗粒剂。这样制备的颗粒剂中微生物的重量百分比约75％，

实施例4：可湿性粉剂的小量制备

按实施例1方法生产微生物，用板框过滤去2/3的液体，将菌体与填料按15克∶85克的比例混合，其中填料为95％草炭，2％吐温-60，1％十二烷基苯磺酸钠，1％拉散剂MF，1％抗坏血酸，混合后将水分调节到2％以下。这样制备的可湿性粉剂中微生物的重量百分比约15％。

Claims (1)

1.一种生物杀线虫剂的生产方法，其生产工序包括微生物试管斜面种子培养、微生物液体种子培养；将液体种子接入固体培养料中或液体培养料中，通过固体培养条件或液体培养条件培养，获得大量的菌体培养物；根据剂型需要将菌体培养物与相应的填充料，粘合剂，表面活性剂制成粉剂，颗粒剂和可湿性粉剂的菌剂加工，其特征在于：

1.1所用的微生物为指状节丛孢(Arthrobotrys dactyloides)LX-Ad菌株，该菌株2002年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.0805；

1.2微生物液体培养下大量繁殖所用的培养基成分为：糖蜜20g，玉米粉5g，硫酸铵5g，氯化钠6g，硫酸二氢钾0.5g，柠檬酸三钠4.5g，水1000ml；

1.3微生物固体培养下大量繁殖的培养基成分可以是单一的麦麸，小麦粒或粉，高粱粉，玉米粉或者粒，红薯粉，米糠，大米，棉籽壳，禾本科植物的茎叶粉碎物，淀粉，黄豆粉，也可以是其中两种或两种以上成分的组合；

1.4微生物在该菌剂中的重量百分比为15％-75％，菌剂的相对湿度小于10％。