DE10103778A1

DE10103778A1 - Neues Fermentationsverfahren zur Herstellung von L-Threonin

Info

Publication number: DE10103778A1
Application number: DE10103778A
Authority: DE
Inventors: Thomas Hermann; Mechthild Rieping
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-08-31
Filing date: 2001-01-27
Publication date: 2002-03-14
Also published as: ZA200301636B; KR20030033039A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin, bei dem man einen L-Threonin produzierenden Mikroorganismus der Familie Enterobacteriaceae nach dem Zulaufverfahren kultiviert, anschließend einen Teil der Fermentationsbrühe abtrennt, um sie für die Inokulierung weiterer Medien zu nutzen.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin mit Enterobacteriaceae.

Stand der Technik

L-Threonin findet in der Tierernährung, in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie Anwendung.

Es ist bekannt, dass L-Threonin durch Fermentation von Stämmen der Familie der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli hergestellt werden kann. Wegen der grossen Bedeutung dieser Aminosäure wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet.

Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Massnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen, d. h. die genetisch bedingten Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Aus dem Stand der Technik, wie er beispielsweise in der US-A-5,538,873 und in der EP-B-0593792 oder bei Okamoto et al. (Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 61 (11), 1877-1882, 1997) beschrieben ist, ist bekannt, dass Threonin durch Fermentation im Satzverfahren (batch) oder Zulaufverfahren (fed batch) hergestellt wird.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Massnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Threonin bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Fermentationsverfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man

a) einen L-Threonin produzierenden Mikroorganismus der Familie Enterobacteriaceae nach dem Zulaufverfahren (fed batch) in bekannter Weise kultiviert, anschliessend
b) einen Teil der Fermentationsbrühe abtrennt, wobei 1 bis 90 Vol.-%, insbesondere 1 bis 50 Vol.-%, bevorzugt 1 bis 25 Vol.-% und besonders bevorzugt 5 bis 20 Vol.-% des Gesamtvolumens der Fermentationsbrühe im Fermentationsbehälter verbleiben, anschliessend
c) die verbleibende Fermentationsbrühe mit Wachstumsmedium auffüllt und bevorzugt nach einer Wachstumsphase eine weitere Fermentation nach dem genannten Zulaufverfahren (fed batch) durchführt,
d) die Schritte b) und c) gegebenenfalls mehrfach durchführt, und
e) aus den gesammelten Fermentationsbrühen das L-Threonin isoliert.

Die Mikroorganismen, mit denen das erfindungsgemässe Verfahren durchgeführt werden kann, können L-Threonin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse und Stärke, oder aus Glycerin und Ethanol herstellen, wobei die Herstellung aus Glucose, Saccharose oder Melasse bevorzugt wird. Es handelt sich um Vertreter der Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattungen Escherichia, Serratia und Providencia. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.

Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli EL1003
Escherichia coli VNIIgenetika MG-442
Escherichia coli VNIIgenetika VL334/pYN7
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli VNIIgenetika TDH-6
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli BKIIM B-5318
Escherichia coli B-3996-C43
Escherichia coli B-3996-C80
Escherichia coli B-3996/pTWV-pps
Escherichia coli B-3996(pMW::THY)
Escherichia coli B-3996/pBP5
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132.

Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcecsens sind beispielsweise
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000.

L-Threonin produzierende Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt, unter anderen, ein oder mehrere der genetischen bzw. phänotypischen Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β- Hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α- Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valin-Analoga wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedürftigkeit für L-Methionin, gegebenenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin, Bedürftigkeit für meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich Threonin-haltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L- Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L- Valin, Empfindlichkeit gegenüber Fluoropyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung, Verstärkung des Threonin-Operons, Verstärkung der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I bevorzugt der feed back resistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Aspartatsemialdehyd- Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat- Carboxylase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genproduktes, Verstärkung des RhtC-Genproduktes, Verstärkung des YfiK- Genproduktes, Verstärkung einer Pyruvat-Carboxylase, und Abschwächung der Essigsäurebildung.

So besitzt beispielsweise der Stamm 472T23 eine verstärkte, "feed back" resistente Aspartatkinase I- Homoserindehydrogenase I, eine abgeschwächte Threonin- Desaminase, eine Resistenz gegen 5 g/l L-Threonin und die Fähigkeit Saccharose als Kohlenstoffquelle zu verwerten.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens oder Allels bzw. der Gene oder Allele erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Erfindungsgemäss wird die Anlagenleistung einer L-Threonin produzierenden Fermentationseinheit dadurch gesteigert, dass nach einem ersten Fermentationsschritt ein Teil der so erhaltenen Fermentationsbrühe im Produktionsfermenter verbleibt und als Inokulum für einen oder mehrere weitere Fermentationsschritte (Ansätze) dient.

Erfindungsgemäß verbleiben 1 bis 90 Vol.-%, vorzugsweise 1 bis 50 Vol.-%, bevorzugt 1 bis 25 Vol.-% und besonders bevorzugt 5 bis 20 Vol.-% des Gesamtvolumens der Fermentationsbrühe im Fermentationsbehälter.

Die in dem Fermentationsbehälter verbleibende Brühe wird bevorzugt mit einem Wachstumsmedium aufgefüllt. Nach gegebenenfalls < 0 bis maximal 10 Stunden, vorzugsweise nach 1 bis 10 Stunden, bevorzugt 2 bis 10 Stunden und besonders bevorzugt 3 bis 7 Stunden wird ein Produktionsmedium zugeführt. Alternativ können die Komponenten dieses Mediums auch separat zugefüttert werden. Nach 20 bis 72 Stunden, vorzugsweise 20 bis 48 Stunden, wird der Ansatz beendet und ein Teil der Fermentationsbrühe, wie oben beschrieben, abgetrennt. Anschliessend wird mit dem verbliebenen Rest gegebenenfalls eine neue Fermentationsstufe gestartet. In Abhängigkeit von der Stabilität des verwendeten Stammes kann das Verfahren mindestens 1 mal, vorzugsweise ca. 2- bis 6mal wiederholt werden.

Für das beschriebene Verfahren sind entsprechend stabile Stämme, die ihre Produktionseigenschaften im Laufe des Verfahrens nicht verlieren, besonders geeignet.

Das Wachstumsmedium enthält als Kohlenstoffquelle typischerweise Zucker wie z. B. Glucose, Stärkehydrolysat, Saccharose oder Melasse. Als Stickstoffquelle können organische, Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schliesslich werden essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren (z. B. Homoserin) und Vitamine (z. B. Thiamin) zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden.

Das Produktionsmedium enthält im allgemeinen lediglich einen Zucker wie z. B. Sacharose oder Glucose und gegebenenfalls eine anorganische Stickstoffquelle wie z. B. Ammoniumsulfat. Alternativ können diese und andere Komponenten auch separat zugefüttert werden.

Während der Wachstums- bzw. Produktionsphase wird die Temperatur in einem Bereich von 29 bis 42°C, vorzugsweise 33 bis 40°C, eingestellt. Die Fermentation kann bei Normaldruck oder gegebenenfalls bei Überdruck, vorzugsweise bei 0 bis 1,5 bar Überdruck durchgeführt werden. Der Sauerstoffpartialdruck wird auf 5 bis 50%, vorzugsweise ca. 20%, Luftsättigung geregelt. Die Regelung des pH-Wertes auf pH ca. 6 bis 8, vorzugsweise 6,5 bis 7,5 kann mit 25%igem Ammoniakwasser erfolgen.

Das erfindungsgemässe Verfahren zeichnet sich gegenüber dem üblichen fed batch-Verfahren, vor allem durch eine erhöhte Raum-Zeit-Ausbeute aus.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wurde, wenn nicht anders beschrieben, nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175) durchgeführt.

Beispiel 1 Herstellung des Escherichia coli K-12 Stammes DM1265

Eine plasmidfreie Variante des E. coli Stamm 472T23 wurde von der American Type Culture Collection (Manasas, VA., USA) als ATCC98082 bezogen. Der Stamm ATCC98082 ist in der Patentschrift US-A-5,631,157 beschrieben. Der E. coli Stamm VL334/pYN7 wurde von der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) als CMIM B-1684 bezogen. Der Stamm CMIM B-1684 ist in der Patentschrift US-A-4,278,765 beschrieben.

Aus dem Stamm VL334/pYN7 wurde das Plasmid pYN7 isoliert. Aus Plasmid pYN7 wurde mit Hilfe der Restriktionsenzyme HindIII und BamHI durch präparative Agarosegel- Elektrophorese ein 6,25 kbp langes DNA-Fragment isoliert, welches das thrABC-Operon trägt.

Das Plasmid pBR322 (Bolivar et al., Gene 2, 95-113 (1977)) wurde von der Firma Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) bezogen und mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI behandelt. Das 4,3 kbp lange DNA-Fragment wurde durch präparative Agarosegel-Elektrophorese isoliert. Die beiden DNA-Fragmente wurden gemischt, mit T4-DNA-Ligase behandelt und der Stamm DHSoc mit dem Ligationsgemisch transformiert. Nach Selektion auf Ampicillin-haltigem (50 µg/mL) LB-Agar wurden Transformanten enthalten, die ein Plasmid enthielten, das in seiner Struktur dem Plasmid pYN7 entsprach.

Das Plasmid wurde aus einer Transformante isoliert, partiell mit dem Enzym EcoRI und vollständig mit dem Enzym HindIII gespalten und mit dem isolierten parB-Genbereich ligiert. Dazu wurde das Plasmid pKG1022 (Gerdes, Biotechnology (1988) 6: 1402-1405) mit den Enzymen EcoRI und HindIII gespalten, der Spaltungsansatz im 1%igen Agarosegel aufgetrennt und das 629 bp grosse parB-Fragment mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von Stamm ATCC98082 eingesetzt. Die Selektion Plasmid tragender Zellen erfolgte auf LB Agar (Lennox, Virology 1: 190 (1955)), der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt war. Die erfolgreiche Klonierung des parB-Genbereiches konnte nach Plasmid-DNA-Isolierung, Kontrollspaltung mit EcoRI und HindIII und Analyse des Spaltungsansatzes durch Agarosegel-Elektrophorese nachgewiesen werden. Das Plasmid wurde als pYN7parB bezeichnet.

Eine Transformante vom Typ ATCC98082/pYN7parB wurde als DM1265 bezeichnet und in Form einer Reinkultur am 30. April 1999 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM, Braunschweig, Deutschland) als DSM12790 gemäss Budapester Vertrag hinterlegt.

Der Stamm DM1265 besitzt eine verstärkte, "feed back" resistente Aspartatkinase I-Homoserindehydrogenase I, eine abgeschwächte Threonin-Desaminase, eine Resistenz gegen 5 g/l L-Threonin und die Fähigkeit Saccharose als Kohlenstoffquelle zu verwerten.

Dieser Stamm zeichnet sich durch eine hohe Stabilität aus.

Beispiel 2 Herstellung von L-Threonin mit Hilfe des Escherichia coli K-12 Stammes DM1265 durch konventionelle Fermentation

Eine Einzelkolonie des Stammes DM1265 wurde auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung überimpft: 3,5 g/l Na₂HPO₄.2H₂O, 1,5 g/l KH₂PO₄, 1 g/l NH₄Cl, 0,1 g/l MgSO₄.7H₂O, 2 g/l Glucose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin. Die Kultur wurde für ca. 5 Tage bei 37°C bebrütet. 10 ml Vorkulturmedium mit der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄.7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin, wurde mit einer Impföse beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert.

Ein Volumen von 1 ml dieser ersten Vorkultur wurde in 1402 g des Nährmediums A1-144 angeimpft. Die Anzuchtfermentation wurde in 2-l-Rührreaktor-Fermentern der Firma B. Braun (BBI, Deutschland, Melsungen, Modell Biostat MD) durchgeführt. Das Nährmedium A1-144 enthielt die in Tabelle 1 aufgeführten Bestandteile. Diese zweite Vorkultur wurde für 22,5 Stunden bei einer Temperatur von 37°C, einer volumenspezifischen Begasung von 0,71 vvm, einem Sauerstoffpartialdruck von 10% der Luftsättigung und einem pH von pH 7,0 bis zum Erreichen einer OD660 von 16,3 kultiviert.

Zur Inokulierung von 1233 g des Wachstumsmediums M1-463, das in 2-l-Rührreaktor-Fermentern der Firma B. Braun (BBI, Deutschland, Melsungen, Modell Biostat MD) enthalten war, wurden 157,6 g der zweiten Vorkultur in Nährmedium A1-144 zugegeben. Das Wachstumsmedium M1-463 enthielt die in Tabelle 2 aufgeführten Bestandteile. Die Kultur wurde bei einer Temperatur von 37°C, einer Belüftung von 1 l/min., einer minimalen Rührung von 800 rpm und einem pH von 7,0 und einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung bis zum Erreichen einer Restzuckerkonzentration von ca. 3 g/l kultiviert. Die so erhaltene Brühe wurde anschliessend für weitere 30 Stunden bei einer Temperatur von 37°C, einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung und einem pH-Wert von pH 7,0 bis zum Erreichen einer OD660 von 33,4. Während dieser Zeit wurden 450 g eines Produktionsmediums bestehend aus einer Saccharose-Lösung mit einer Konzentration von 650 g/l kontinuierlich zugefüttert.

Anschliessend wurden die optische Dichte (OD) mit einem Digitalphotometer vom Typ LP1W der Firma Dr. Bruno Lange GmbH (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm und die Konzentration an gebildetem L-Threonin mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt.

In der Fermentationsendprobe wurde nach 39,5 Stunden eine L-Threonin Konzentration von 69,6 g/l festgestellt. Somit betrug die Raum-Zeit-Ausbeute in diesem Experiment 1,76 g/l×Std.

Tabelle 1

Zusammensetzung des Nährmediums A1-144

Tabelle 2

Zusammensetzung des Wachstumsmediums M1-463

Beispiel 3 Erfindungsgemässe Herstellung von L-Threonin mit Hilfe des Stammes DM1265

Eine Einzelkolonie des Stammes DM1265 wurde auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung überimpft: 3,5 g/l Na₂HPO₄.2H₂O, 1,5 g/l KH₂PO₄, 1 g/l NH₄Cl, 0,1 g/l MgSO₄.7H₂O, 2 g/l Glucose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin. Die Kultur wurde für ca. 5 Tage bei 37°C bebrütet. ZO ml Vorkulturmedium mit der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄) 2SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄.7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin, wurde mit einer Impföse beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR-Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert.

Ein Volumen von 1 ml dieser ersten Vorkultur wurde in 1402 g des Nährmediums A1-144 angeimpft. Die Anzuchtfermentation wurde in 2-l-Rührreaktor-Fermentern der Firma B. Braun (BBI, Deutschland, Melsungen, Modell Biostat MD) durchgeführt. Das Nährmedium A1-144 enthielt die in Tabelle 1 aufgeführten Bestandteile. Diese zweite Vorkultur wurde für 22,5 Stunden bei einer Temperatur von 37°C, einer volumenspezifischen Begasung von 0,71 vvm, einem Sauerstoffpartialdruck von 10% der Luftsättigung und einem pH von pH 7,0 bis zum Erreichen einer ODGGO von 16,3 kultiviert.

Zur Inokulierung von 1233 g des Wachstumsmediums M1-463, das in 2-l-Rührreaktor-Fermentern der Firma B. Braun (BBI, Deutschland, Melsungen, Modell Biostat MD) enthalten war, wurden 157,6 g der zweiten Vorkultur in Nährmedium A1-144 zugegeben. Das Wachstumsmedium M1-463 enthielt die in Tabelle 2 aufgeführten Bestandteile. Die Kultur wurde wie in Beispiel 2 beschrieben bei einer Temperatur von 37°C, einer Belüftung von 1 l/min., einer minimalen Rührung von 800 rpm und einem pH von 7,0 und einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung bis zum Erreichen einer Restzuckerkonzentration von ca. 3 g/l nach 9,5 Stunden kultiviert. Die so erhaltene Fermentationsbrühe wurde anschliessend für weitere 30 Stunden bei einer Temperatur von 37°C, einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung und einem pH-Wert von pH 7,0 bis zum Erreichen einer OD660 von 33,4 kultiviert. Während dieser Zeit wurden 450 g eines Produktionsmediums bestehend aus einer Saccharose-Lösung mit einer Konzentration von 650 g/l kontinuierlich zugefüttert. Nach Verbrauch der Zufütterungslösung und Verbrauch des Restzuckers in der Fermentationsbrühe dieses ersten Laufes wurden 90% der Fermentationsbrühe (1656 g) des Fermenterinhaltes durch Abpumpen entnommen.

Die verbleibenden 10% des Volumens (184 g) wurden mit 1200 g des Wachstumsmediums M1-474 aufgefüllt und die Fermentation neu begonnen. Das Wachstumsmedium M1-474 enthielt die in Tabelle 3 aufgeführten Bestandteile. Die Kultur dieses zweiten Laufes wurde wie in Beispiel 2 beschrieben bei einer Temperatur von 37°C, einer Belüftung von 1 l/min., einer minimalen Rührung von 800 rpm und einem pH von 7,0 und einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung bis zum Erreichen einer Restzuckerkonzentration von ca. 3 g/l nach 5 Stunden kultiviert. Die Brühe wurde anschliessend für weitere 30 Stunden bei einer Temperatur von 37°C, einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung und einem pH-Wert von pH 7,0 bis zum Erreichen einer OD660 von 35,7 kultiviert. Während dieser Zeit wurden 450 g eines Produktionsmediums bestehend aus einer Saccharose-Lösung mit einer Konzentration von 650 g/l kontinuierlich zugefüttert. Nach Verbrauch der Zufütterungslösung und Verbrauch des Restzuckers in der Fermentationsbrühe wurden 90% der Fermentationsbrühe (1656 g) dem Fermenter durch Abpumpen entnommen.

Die verbleibenden 10% der Gesamtmenge (184 g) wurden mit 1200 g des Wachstumsmediums M1-474 aufgefüllt und die Fermentation neu begonnen. Das Wachstumsmedium M1-474 enthielt die in Tabelle 3 aufgeführten Bestandteile. Die Kultur dieses dritten Laufes wurde wie in Beispiel 2 beschrieben bei einer Temperatur von 37°C, einer Belüftung von 1 l/min., einer minimalen Rührung von 800 rpm und einem pH von 7,0 und einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung bis zum Erreichen einer Restzuckerkonzentration von ca. 3 g/l nach 5,25 Stunden kultiviert. Die Kultur wurde anschliessend für weitere 30 Stunden bei einer Temperatur von 37°C, einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung und einem pH-Wert von pH 7,0 bis zum Erreichen einer ODEEO von 32,5 kultiviert. Während dieser Zeit wurden 450 g eines Prouduktionsmediums bestehend aus einer Saccharose-Lösung mit einer Konzentration von 650 g/l zugefüttert.

Am Ende jeder Fermentation wurden die optische Dichte (OD) mit einem Digitalphotometer vom Typ LP1W der Firma Dr. Bruno Lange GmbH (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm und die Konzentration an gebildetem L-Threonin mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt. Die Ergebnisse der jeweiligen Läufe sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 3

Zusammensetzung des Wachstumsmediums M1-474

Tabelle 4

Claims

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin,
dadurch gekennzeichnet, dass man

a) einen L-Threonin produzierenden Mikroorganismus der Familie Enterobacteriaceae nach dem Zulaufverfahren (fed batch) kultiviert, anschliessend
b) einen Teil der Fermentationsbrühe abtrennt, wobei 1 bis 90 Vol.-%, insbesondere 1 bis 50 Vol.-%, bevorzugt 1 bis 25 Vol.-% des Gesamtvolumens der Fermentationsbrühe im Fermentationsbehälter verbleiben, anschliessend
c) die verbleibende Fermentationsbrühe mit Wachstumsmedium auffüllt und bevorzugt nach einer Wachstumsphase eine weitere Fermentation gemäss a) durchführt,
d) die Schritte b) und c) gegebenenfalls mehrfach durchführt, und
e) aus den gesammelten Fermentationsbrühen das L-Threonin isoliert.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schritte b) und c) zwei- bis sechsfach durchführt und aus den gesammelten Fermentationsbrühen das L-Threonin isoliert.

3. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen der Art Escherichia coli einsetzt.

4. L-Threonin produzierende und ausscheidende Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die eine verstärkte resistente Aspartatkinase I- Homoserindehydrogenase I, eine abgeschwächte Threonin- Desaminase, eine Resistenz gegen 5 g/l Threonin und die Fähigkeit, Saccharose als Kohlenstoffquelle zu verwerten, besitzen.

5. Transformante gemäß Anspruch 4, hinterlegt unter der Nummer DSM 12790 bei der DSMZ, Braunschweig.

6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man L-Threonin produzierende und ausscheidende Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die eine verstärkte resistente Aspartatkinase I-Homoserindehydrogenase I, eine abgeschwächte Threonin-Desaminase, eine Resistenz gegen 5 g/l Threonin und die Fähigkeit, Saccharose als Kohlenstoffquelle zu verwerten, besitzen, verwendet.