KR20030033039A - Ｌ-트레오닌의 제조를 위한 발효방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 엔테로박테리아세애 과의 L-트레오닌 생산 미생물을 유가 방법에 의해 배양한 다음, 추가의 배지를 접종시키는데 사용하기 위해 발효 브로쓰의 일부를 분리 제거하는, L-트레오닌의 발효적 제조방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ-트레오닌의 제조를 위한 발효방법{Fermentation process for the preparation of L-threonine}

L-트레오닌은 동물 사료, 사람 의학 및 약제 산업에서 사용된다.

L-트레오닌은 엔테로박테리아세애 과의 균주, 특히 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)의 발효에 의해 제조되는 것으로 공지되어 있다. 상기 아미노산의 큰 중요성으로 인해, 제조 방법을 개선시키고자 하는 연구가 지속적으로 있어왔다. 방법의 개선은 발효 수단, 예를 들어, 교반 및 산소 공급, 또는 예를 들어, 발효 동안의 당 농도와 같은 영양 배지의 조성, 또는 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 생산 특성, 즉 유전적 기원의 특성에 관련될 수 있다.

예를 들어, 문헌[참조문헌: US-A-5,538,873 및 EP-B-0593792 또는 Okamoto et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 61 (11), 1877-1882, 1997]에 기술된 바와 같이 선행 분야로부터 트레오닌은 뱃치 방법(뱃치) 또는 유가 방법(유가 뱃치)으로 발효에 의해 제조한다는 것이 공지되어 있다.

발명의 목적

본 발명은 L-트레오닌의 발효적 제조를 개선시키기 위한 신규 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.

발명의 요약

본 발명은

(a) 엔테로박테리아세애 과의 L-트레오닌 생산 미생물을 유가 방법(유가 뱃치)에 의해 공지된 방식으로 배양하고,

(b) 발효 브로쓰의 일부를 발효 탱크내에 잔류하는 발효 브로쓰의 총 용적의 1 내지 90용적%, 특히 1 내지 50용적%, 바람직하게는 1 내지 25용적% 및 특히 바람직하게는 5 내지 50용적%의 양으로 제거하고,

(c) 잔류 발효 브로쓰에 성장 배지를 충전시키고, 바람직하게는 성장기 후에 언급한 유가 방법(유가 뱃치)으로 추가의 배양을 수행하고,

(d) 임의로, 단계(b) 및 (c)를 수회 수행하고,

(e) L-트레오닌을 수집된 발효 브로쓰로부터 분리함을 특징으로 하는 발효 방법을 제공한다.

본 발명은 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae)를 사용하여 L-트레오닌을 발효적으로 제조하기 위한 신규한 방법을 제공한다.

본 발명에 따르는 방법을 수행하는 사용하는 미생물은 글루코스, 슈크로스,락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-트레오닌을 생산할 수 있으며, 글루코스, 슈크로스 또는 당밀로부터 생산하는 것이 바람직하다. 엔테로박테리아세애, 특히 에스케리치아, 세라티아 및 프로비덴시아 속 중에서 당해 미생물이 대표적이다. 에스케리치아 속 중에서는 에스케리치아 콜라이 종을, 세라티아 속 중에서는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)를 특별히 언급할 수 있다.

에스케리치아 속, 특히 에스케리치아 콜라이 종의 적합한 L-트레오닌 생산 균주는 예를 들어, 다음과 같다:

에스케리치아 콜라이 TF427

에스케리치아 콜라이 H-4225

에스케리치아 콜라이 H-4226

에스케리치아 콜라이 H-4257

에스케리치아 콜라이 H-4258

에스케리치아 콜라이 H-4435

에스케리치아 콜라이 H-4436

에스케리치아 콜라이 H-4578

에스케리치아 콜라이 H-7256

에스케리치아 콜라이 H-7263

에스케리치아 콜라이 H-7293

에스케리치아 콜라이 H-7294

에스케리치아 콜라이 H-7700

에스케리치아 콜라이 H-7729

에스케리치아 콜라이 H-8309

에스케리치아 콜라이 H-8311

에스케리치아 콜라이 H-9244

에스케리치아 콜라이 KY10935

에스케리치아 콜라이 EL1003

에스케리치아 콜라이 VNIIgenetika MG-442

에스케리치아 콜라이 VNIIgenetika VL334/pYN7

에스케리치아 콜라이 VNIIgenetika M1

에스케리치아 콜라이 VNIIgenetika 472T23

에스케리치아 콜라이 VNIIgenetika TDH-6

에스케리치아 콜라이 BKIIM B-3996

에스케리치아 콜라이 BKIIM B-5318

에스케리치아 콜라이 B-3996-C43

에스케리치아 콜라이 B-3996-C80

에스케리치아 콜라이 B-3996/pTWV-pps

에스케리치아 콜라이 B-3996(pMW::THY)

에스케리치아 콜라이 B-3996/pBP5

에스케리치아 콜라이 Ferm BP-3756

에스케리치아 콜라이 Ferm BP-4072

에스케리치아 콜라이 Ferm BP-1411

에스케리치아 콜라이 kat 13

에스케리치아 콜라이 KCCM-10132

에스케리치아 콜라이 KCCM-10133

세라티아 속, 특히 세라티아 마르센세스 종의 적합한 L-트레오닌 생산 균주는 예를 들어, 다음과 같다:

세라티아 마르센세스 HNr21

세라티아 마르센세스 TLr156

세라티아 마르센세스 T2000

L-트레오닌을 생산하는 엔테로박테리아세애 과로부터의 균주는 바람직하게는 특히 α-아미노-β-하이드록시발레르산에 대한 내성, 티아라이신에 대한 내성, 에티오닌에 대한 내성, α-메틸세린에 대한 내성, 디아미노석신산에 대한 내성, α-아미노부티르산에 대한 내성, 보렐리딘에 대한 내성, 리팜피신에 대한 내성, 발린 유사체(예: 발린 하이드록사메이트)에 대한 내성, 푸린 유사체(예: 6-디메틸아미노푸린)에 대한 내성, L-메티오닌에 대한 요구성, 임의로 L-이소류신에 대한 부분적이고 보완가능한 요구성, 메소-디아미노피멜산에 대한 요구성, 트레오닌 함유 디펩타이드에 관한 영양요구성, L-트레오닌에 대한 내성, L-호모세린에 대한 내성, L-라이신에 대한 내성, L-메티오닌에 대한 내성, L-글루탐산에 대한 내성, L-아스파르테이트에 대한 내성, L-류신에 대한 내성, L-페닐알라닌에 대한 내성, L-세린에대한 내성, L-시스테인에 대한 내성, L-발린에 대한 내성, 플루오로피루베이트에 대한 민감성, 결실된 트레오닌 데하이드로게나제, 임의로 슈크로스 사용 능력, 트레오닌 오페론의 증폭, 바람직하게는 피드백 내성 형태의 호모세린 데하이드로게나나제 I-아스파르테이트 키나제 I의 증폭, 호모세린 키나제의 증폭, 트레오닌 신타제의 증폭, 임의로 피드백 내성 형태의 아스파르테이트 키나제의 증폭, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제의 증폭, 임의로 피드백 내성 형태의 포스포에놀 피루베이트 카복실라제의 증폭, 포스포에놀 피루베이트 신타제의 증폭, 트랜스하이드로게나제의 증폭, RhtB 유전자 생성물의 증폭, RhtC 유전자 생성물의 증폭, YfiK 유전자 생성물의 증폭, 피루베이트 카복실라제의 증폭 및 아세트산 형성의 감쇠로 이루어진 그룹으로부터 선태된 하나 이상의 유전형 또는 표현형 특징을 갖는다.

따라서, 예를 들어, 균주 472T23[참조문헌: US-A-5,631,157]은 특히, 증폭된 "피드백" 내성 아스파르테이트 키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I, 감쇠된 트레오닌 데아미나제, 5g/ℓ 이상의 L-트레오닌에 대한 내성 및 슈크로스를 탄소원으로서 이용하는 능력을 지닌다.

따라서, 예를 들어, 균주 B-3996[참조문헌: US-A-5,175,107]은 특히, 증폭된 "피드백" 내성 아스파르테이트 키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I, 감쇠된 트레오닌 데아미나제, 감쇠된 트레오닌 데하이드로게나제, 5g/ℓ 이상의 L-트레오닌에 대한 내성 및 슈크로스를 탄소원으로서 이용하는 능력을 지닌다.

따라서, 예를 들어, 균주 kat-13[참조문헌: US-A-5,939,307]은 특히, 증폭된"피드백" 내성 아스파르테이트 키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I, 감쇠된 트레오닌 데하이드로게나제, 보렐리딘에 대한 내성 및 슈크로스를 탄소원으로서 이용하는 능력을 지닌다.

따라서, 예를 들어, 균주 KCCM-10132[참조문헌: WO 00/09660]은 α-메틸세린에 대한 내성, 디아미노석신산에 대한 내성, 플루오로피루베이트에 대한 민감성, L-글루탐산에 대한 내성 및 7% 이상의 L-트레오닌에 대한 내성을 지닌다. 당해 균주는 또한 아미노산 L-메티오닌 및 L-이소류신을 필요로 한다.

이와 관련하여, 용어 "증폭"은 예를 들어, 유전자나 대립유전자 또는 유전자들이나 대립유전자들의 복제수를 증가시키거나, 강한 프로모터를 사용하거나, 활성이 높은 상응하는 효소를 암호화하는 유전자 또는 대립유전자를 사용하고 임의로 이들 수단을 병용함으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 미생물내의 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 증가시키는 것을 말한다.

증폭 수단, 특히 과발현에 의해, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도는 출발 미생물에 기초하여, 일반적으로 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 이상, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가된다.

이와 관련하여, 용어 "감쇠"는 예를 들어, 약한 프로모터를 사용하거나 활성이 낮은 상응하는 효소를 암호화하거나 상응하는 유전자 또는 효소(단백질)을 불활성화시키는 유전자 또는 대립유전자를 사용하고 임의로 이들 수단을 병용함으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 미생물내의 하나 이상의 효소(단백질)의 세포내 활성을 감소시키거나 제거하는 것을 말한다.

감쇠 수단에 의해, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도는 일반적으로 야생형 단백질의 활성 또는 농도의 0 내지 50%, 0 내지 25%, 0 내지 10% 또는 0 내지 5%로 감소된다.

본 발명에 따라서, L-트레오닌을 생산하는 발효 단위의 시스템 산출량은, 첫번째 발효 단계 후에 상기 방식으로 수득된 발효 브로쓰의 일부가 생산 발효조내에 잔류하고 1회 이상의 추가 발효 단계(뱃치)를 위한 접종물로서 작용하는 방법에 의해 증가된다.

본 발명에 따라서, 발효 브로쓰의 총 용적의 1 내지 90용적%, 바람직하게는 1 내지 50용적%, 보다 바람직하게는 1 내지 25용적%, 1 내지 20용적%, 1 내지 15용적% 또는 1 내지 10용적% 및 특히 바람직하게는 5 내지 20용적%, 5 내지 15용적% 또는 1 내지 10용적%가 발효 탱크내에 잔류한다.

발효 탱크내에 잔류하는 브로쓰는 바람직하게는 성장 배지로 충전시킨다. 임의로 0시간 초과 내지 10시간 이하 후, 바람직하게는 1시간 내지 10시간 후, 보다 바람직하게는 2시간 내지 10시간 후 및 특히 바람직하게는 3시간 내지 7시간 후에, 생산 배지를 공급한다. 또는, 상기 배지의 성분을 별도로 공급할 수 있다. 20시간 내지 72시간 후, 바람직하게는 20시간 내지 48시간 후에, 뱃치를 중단하고, 발효 브로쓰의 일부를 상기 기술한 바와 같이 분리 제거한다. 이어서 임의로 새로운 발효 단계를 잔류물로 개시한다. 당해 방법은 사용되는 균주의 안정성에 따라서 1회 이상, 바람직하게는 약 2회 내지 6회 반복할 수 있다. 또한, 약 2회 내지 8회 또는 2회 내지 10회 또는 2회 내지 4회 반복도 가능하다.

방법 과정중에 생산 특성을 상실하지 않는 적절하게 안정한 균주가 기술한 방법에 특히 적합하다.

성장 배지는 통상적으로 탄소원으로서 당(예: 글루코스, 전분 가수분해물, 슈크로스 또는 당밀)을 포함한다. 질소원으로서는, 유기 질소 함유 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아) 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 사용할 수 있다. 질소원은 단독으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 인 공급원으로서는, 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 사용할 수 있다.

배양 배지는 성장에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘, 황산망간 또는 황산철)을 추가로 포함해야 한다. 마지막으로, 상기 언급된 물질 이외에도 아미노산(예: 호모세린) 및 비타민(예: 티아민)과 같은 필수 성장 물질을 사용한다. 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 발생을 조절할 수 있다.

일반적으로, 생산 배지는 단지 하나의 당(예: 슈크로스 또는 글루코스) 및 임의로 유기 질소원(예: 황산암모늄)을 포함한다. 또는, 이들 성분 및 기타 성분을 별도로 공급할 수도 있다.

성장기 또는 생산기 동안에, 온도는 29℃ 내지 42℃, 바람직하게는 33℃ 내지 40℃ 범위로 설정한다. 27℃ 내지 39℃ 범위의 온도가 또한 가능하다. 발효는 정상압하에 또는 임의로 증압하에, 바람직하게는 0 내지 1.5bar의 증압하에 수행할수 있다. 산소 분압은 5 내지 50%, 바람직하게는 약 20%의 공기 포화도로 조절한다. 25% 수성 암모니아로 pH를 약 6 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 pH로 조절할 수 있다.

본 발명에 따르는 방법은 무엇보다도 증가된 공간/시간 수율 및 생산성에 의해 종래 방법과 구별된다.

본 발명은 하기의 양태 실시예를 사용하여 보다 상세히 설명한다.

에스케리치아 콜라이로부터 플라스미드 DNA의 분리 및 모든 제한 기술, 클레노우 및 알칼리 포스파타제 처리는 문헌[참조문헌: Sambrook et al., Molecular Cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press]의 방법으로 수행한다. 달리 기술하지 않는 한, 에스케리치아 콜라이의 형질전환은 문헌[참조문헌: Chung et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Americal USA (1989) 86: 2172-2175]의 방법으로 수행한다.

실시예 1

에세리콜라이 K-12 균주 DM1265의 제조

이. 콜라이 균주 472T23의 플라스미드를 함유하지 않는 변이체를 ATCC98082로서 기관[American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스 소재]로부터 입수한다. 균주 ATCC98082는 특허 명세서 US-A-5,631,157에 기술되어 있다. 이. 콜라이 균주 VL334/pYN7은 CMIM B-1684로서 기관[Russian National Collectionof Industrial Microorganisms(VKPM), 러시아 모스코바 소재]로부터 입수한다. 균주 CMIM B-1684는 특허 명세서 US-A-4,278,765에 기술되어 있다.

플라스미드 pYN7을 균주 VL334/pYN7로부터 분리한다. thrABC 오페론을 지니는 6.25kbp 길이의 DNA 단편을 제한 효소 HindIII 및 BamHI을 사용한 예비 아가로스 겔 전기영동에 의해 플라스미드 pYN7로부터 분리한다.

플라스미드 pBR322[참조문헌: Bolivar et al., Gene 2, 95-113 (1977)]을 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)으로부터 입수하고, 제한 효소 HindIII 및 BamHI으로 처리한다. 4.3kbp 길이의 DNA 단편을 예비 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리한다. 2개의 DNA 단편을 혼합하여 T4 DNA 리가제로 처리하고, 균주 DH5α를 연결 혼합물로 형질전환시킨다. 암피실린 함유(50㎍/㎖) LB 아가에서 선별한 후, 구조가 플라스미드 pYN7에 상응하는 플라스미드를 함유하는 형질전환체를 수득한다.

플라스미드를 형질전환체로부터 분리하고 효소 EcoRI으로 부분적으로 절단하고 효소 HindIII으로 완전히 절단한 다음, 분리된 parB 유전자 영역과 연결시킨다. 이를 위해, 플라스미드 pKG1022[참조문헌: Gerdes, Biotechnology (1988) 6:1402-1405]를 효소 EcoRI 및 HindIII로 절단하고, 절단 뱃치를 1% 아가로스 겔에서 분리하고 629bp 크기의 parB 단편을 퀴아퀵 겔 추출 키트(QIAquick Gel Extraction Kit, 제조원: QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 분리한다. 연결 혼합물을 균주 ATCC98082를 형질전환시키는데 사용한다. 플라스미드 함유 세포를 50㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 LB 아가[참조문헌: Lennox, Virology 1:190 (1955)에서 선별한다.플라스미드 DNA를 분리하고 절단을 EcoRI 및 HindIII로 조절하고 절단 뱃치를 아가로스 겔 전기영동으로 분석한 후, 성공적인 parB 유전자 영역의 클로닝을 검출할 수 있다. 당해 플라스미를 pYN7parB라 지정한다.

타입 ATCC98082/pYN7parB의 형질전환체는 DM1265라 지정하였으며, 부다페스트 조약에 따라서, 1999년 4월 30일자로 독일 브라운슈바이크에 소재하는 도이췌 잠룽 퓌어 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌[Deutsche Sammlung fur Mikrorganismen und Zellkulturen(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures=DSMZ)]에 DSM12790으로서 순수한 배양물 형태로 기탁하였다.

균주 DM1265는 특히, 증폭된 "피드백" 내성 아스파르테이트 키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I, 감쇠된 트레오닌 데아미나제, 5g/ℓ 이상의 트레오닌에 대한 내성 및 슈크로스를 탄소원으로 이용하는 능력을 지닌다.

상기 균주는 높은 안정성, 특히 분리 안정성에 있어 두드러진다.

비교 실시예 A

종래의 발효법에 의해 에스케리치아 콜라이 K-12 균주 DM1265를 사용한 L-트레오닌의 제조

균주 DM1265의 단일 콜로니를 3.5g/ℓ Na₂HPO₄*2H₂O, 1.5g/ℓ KH₂PO₄, 1g/ℓ NH₄Cl, 1.0g/ℓ MgSO₄*7H₂O, 2g/ℓ 슈크로스, 20g/ℓ 아가, 50mg/ℓ 암피실린의 조성을 갖는 최소 배지에 트랜스접종(transinoculation)시킨다. 배양물을 37℃에서 약 5일 동안 배양한다. 2g/ℓ 효모 추출물, 10g/ℓ (NH₄)₂SO₄, 1g/ℓ KH₂PO₄, 0.5g/ℓ MgSO₄*7H₂O, 15g/ℓ CaCO₃, 20g/ℓ 슈크로스 , 50mg/ℓ 암피실린의 조성을 갖는 예비배양 배지 10㎖를 접종 루프로 접종시키고 ESR 배양기(제조원: Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland)에서 180rpm으로 37℃에서 16시간 동안 배양한다.

1㎖ 용적의 상기 제1 예비배양물을 영양 배지 A1-144 1402g에 접종시킨다. 배양 발효를 2ℓ들이 교반 반응기 발효조(제조원: B. Braun, BBI, Germany, Melsungen, Biostat MD model)에서 수행한다. 영양 배지 A1-144는 표 1에 기재된 성분을 함유한다. 상기 제2 예비배양물을 37℃의 온도에서 22.5 시간 동안 0.71vvm(분당 용적당 용적)의 용적-특이적 가스발생율에서 공기 포화도의 10%의 산소 분압 및 7.0의 pH에서, 16.3의 흡광도(OD)(660nm)가 달성될 때까지 배양한다.

2ℓ들이 교반 반응기 발효조(제조원: B. Braun, BBI, Germany, Melsungen, Biostat MD model)에 함유된 성장 배지 M1-463 1233g을 접종하기 위해, 영양 배지 A1-144내의 제2 예비배양물 157.6g을 첨가한다. 성장 배지 M1-463은 표 2에 기재된 성분을 함유한다. 배양물을 37℃의 온도에서 1ℓ/분의 통기율로 800rpm으로 최소로 교반하면서 7.0의 pH 및 공기 포화도의 20%의 산소 분압에서, 약 3g/ℓ의 잔류 당 농도가 달성될 때까지 배양한다. 이어서, 상기 방식으로 수득된 브로쓰를 37℃의 온도에서 추가로 30시간 동안 공기 포화도의 20%의 산소 분압 및 pH 7.0의 pH에서, 33.4의 OD(660nm)가 달성될 때까지 배양한다. 상기 시간 동안, 농도가 650g/ℓ인 슈크로스 용액을 포함하는 생산 배지 450g을 연속적으로 공급한다.

이어서 흡광도(OD)를 LP1W 타입 디지탈 광도계(제조원: Dr. Bruno LangeGmbH, 독일 베를린 소재)를 사용하여 660nm의 측정 파장에서 측정하고, 형성된 L-트레오닌의 농도를 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)를 사용하여, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌히드린 검출법을 사용하는 컬럼후 반응에 의해 측정한다.

39.5 시간 후, 69.6g/ℓ의 L-트레오닌 농도가 최종 발효 샘플 중에서 발견된다. 따라서, 당해 실험에서 공간/시간 수율은 1.76g/ℓ·h이다.

영양 배지 A1-144의 조성

성분	농도(kg당)
슈크로스	30g
효모 추출물	2g
(NH4)2SO4	5g
K2HPO4	2g
NaCl	0.6g
MgSO4·7H2O	0.4g
FeSO4·7H2O	20㎎
MnSO4·H2O	20㎎
암피실린	50㎎
스트럭톨(Structol)	0.3g

성장 배지 M1-463의 조성

성분	농도(kg당)
슈크로스	27.7g
효모 추출물	1.87g
NaCl	0.62g
(NH4)2SO4	4.7g
K2HPO4	1.9g
MgSO4·7H2O	0.38g
MnSO4·H2O	18㎎
FeSO4·7H2O	18㎎
암피실린	50㎎
스트럭톨	0.1g

실시예 2

2회의 연속적 유가 방법 및 각 경우에 10% 접종에 의해 균주 DM1265를 사용한 L-트레오닌의 제조

균주 DM1265의 단일 콜로니를 3.5g/ℓ Na₂HPO₄*2H₂O, 1.5g/ℓ KH₂PO₄, 1g/ℓ NH₄Cl, 0.1g/ℓ MgSO₄*7H₂, 글루코스 2g/ℓ, 20g/ℓ 아가, 암피실린 50mg/ℓ의 조성을 갖는 최소 배지로 트랜스접종시킨다. 배양물을 37℃에서 약 5일 동안 배양한다. 2g/ℓ 효모 추출물, 10g/ℓ (NH₄)₂SO₄, 1g/ℓ KH₂PO₄, 0.5g/ℓ MgSO₄*7H₂O, 15g/ℓ CaCO₃, 20g/ℓ 글루코스, 50mg/ℓ 암피실린의 조성을 갖는 예비배양 배지 10㎖를 접종 루프로 접종시키고 ESR 배양기(제조원: Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland)에서 180rpm으로 37℃에서 16시간 동안 배양한다.

1㎖ 용적의 상기 제1 예비배양물을 영양 배지 A1-144 1402g에 접종시킨다. 배양 발효를 2ℓ들이 교반 반응기 발효조(제조원: B. Braun, BBI, Germany, Melsungen, Biostat MD model)에서 수행한다. 영양 배지 A1-144는 표 1에 기재된 성분을 함유한다. 상기 제2 예비배양물을 37℃의 온도에서 22.5시간 동안 0.71vvm의 용적-특이적 가스발생율, 공기 포화도의 20%의 산소 분압 및 pH 7.0의 pH에서, 16.3의 흡광도(OD)(660nm)가 달성될 때까지 배양한다.

2ℓ들이 교반 반응기 발효조(제조원: B. Braun, BBI, Germany, Melsungen, Biostat MD model)에 함유된 성장 배지 M1-463 1233g을 접종하기 위해, 영양 배지A1-144내의 제2 예비배양물 157.6g을 첨가한다. 성장 배지 M1-463은 표 2에 기재된 성분을 함유한다. 배양물을 비교 실시예 A에 기술되어 있는 바와 같이, 37℃의 온도에서 1ℓ/분의 통기율로 800rpm으로 최소로 교반하면서 7.0의 pH 및 공기 포화도의 20%의 산소 분압에서, 약 3g/ℓ의 잔류 당 농도가 9.5시간 후에 달성될 때까지 배양한다. 이어서, 상기 방식으로 수득된 발효 브로쓰를 37℃의 온도에서 추가로 30시간 동안 공기 포화도의 20%의 산소 분압 및 pH 7.0의 pH에서, 33.4의 OD(660nm)가 달성될 때까지 배양한다. 상기 시간 동안, 농도가 650g/ℓ인 슈크로스 용액을 포함하는 생산 배지 450g을 연속적으로 공급한다. 공급액이 소비되고 당해 제1 실행의 발효 브로쓰가 소비된 후, 발효조 내용물 중 발효 브로쓰의 90%(1656g)를 펌핑시켜 제거한다.

잔류 용적 10%(184g)에 성장 배지 M1-474 1200g를 충전시키고 발효를 다시 개시한다. 성장 배지 M1-474는 표 3에 기재된 성분을 함유한다. 당해 제2 실행의 배양물을 비교 실시예 A에서 기술한 바와 같이, 37℃의 온도에서 1ℓ/분의 통기율로 800rpm으로 최소로 교반하면서 7.0의 pH 및 공기 포화도의 20%의 산소 분압에서, 약 3g/ℓ의 잔류 당 농도가 5시간 후에 달성될 때까지 배양한다. 이어서, 브로쓰를 37℃의 온도에서 추가로 31.25시간 동안 공기 포화도의 20%의 산소 분압 및 pH 7.0의 pH에서, 35.7의 OD(660nm)가 달성될 때까지 배양한다. 상기 시간 동안, 농도가 650g/ℓ인 슈크로스 용액을 포함하는 생산 배지 450g을 연속적으로 공급한다. 공급액이 소비되고 발효 브로쓰 중의 잔류 당이 소비된 후, 발효 브로쓰의 90%(1656g)를 펌핑시켜 발효조로부터 제거한다.

남아있는 총 양의 10%(184g)에 성장 배지 M1-474 1200g를 충전시키고 발효를 다시 개시한다. 상기 배지 M1-474는 표 3에 기재된 성분을 함유한다. 당해 제2 실행의 배양물을 비교 실시예 A에서 기술한 바와 같이 37℃의 온도에서 1ℓ/분의 통기율로 800rpm으로 최소로 교반하면서 7.0의 pH 및 공기 포화도의 20%의 산소 분압에서, 약 3g/ℓ의 잔류 당 농도가 5.25시간 후에 달성될 때까지 배양한다. 이어서 배양물을 37℃의 온도에서 추가로 30.5시간 동안 공기 포화도의 20%의 산소 분압 및 pH 7.0의 pH에서, 32.5의 OD(660nm)가 달성될 때까지 배양한다. 상기 시간 동안 농도가 650g/ℓ인 슈크로스 용액을 포함하는 생산 배지 450g을 공급한다.

각 발효의 종결시에, OD 및 형성된 L-트레오닌의 농도를 비교 실시예 A에서와 같이 측정한다. 특정 실행의 결과를 표 4에 제시한다.

본원에서 용어 "공간/시간" 수율은 용적 생산성, 즉 발효 종결시의 L-트레오닌의 농도와 발효 시간의 몫을 말한다.

성장 배지 M1-474의 조성

성분	농도(kg당)
슈크로스	27.7g
효모 추출물	1.68g
NaCl	0.62g
(NH4)2SO4	4.7g
K2HPO4	1.9g
MgSO4·7H2O	0.38g
MnSO4·H2O	18㎎
FeSO4·7H2O	18㎎
암피실린	50㎎
스트럭톨	0.1g

실시예 2의 결과

실행	시간[h]	L-트레오닌[g/ℓ]	OD(660nm)	공간/시간 수율[g/ℓ·h]
1	39.5	68.4	33.4	1.73
2	36.25	69.8	35.7	1.93
3	35.75	69.2	32.5	1.94

실시예 3

4회의 연속적 유가 방법 및 각 경우의 25% 접종물에 의해 균주 DM1265를 사용한 L-트레오닌의 제조

균주 DM1265의 단일 콜로니를 3.5g/ℓ Na₂HPO₄*2H₂O, 1.5g/ℓ KH₂PO₄, 1g/ℓ NH₄Cl, 0.1g/ℓ MgSO₄*7H₂O, 2g/ℓ 글루코스, 20g/ℓ 아가, 50mg/ℓ 암피실린의 조성을 갖는 최소 배지에 트랜스접종시킨다. 배양물을 37℃에서 약 5일 동안 배양한다. 2g/ℓ 효모 추출물, 10g/ℓ (NH₄)₂SO₄, 1g/ℓ KH₂PO₄, 0.5g/ℓ MgSO₄*7H₂O, 15g/ℓ CaCO₃, 20g/ℓ 글루코스, 50mg/ℓ 암피실린의 조성을 갖는 예비배양 배지 10㎖를 접종 루프로 접종시키고 ESR 배양기(제조원: Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland)에서 180rpm으로 37℃에서 16시간 동안 배양한다.

1㎖ 용적의 상기 제1 예비배양물을 영양 배지 A1-144 1402g에 접종시킨다. 배양 발효를 2ℓ들이 교반 반응기 발효조(제조원: B. Braun, BBI, Germany, Melsungen, Biostat MD model)에서 수행한다. 영양 배지 A1-144는 표 1에 기재된 성분을 함유한다. 상기 제2 예비배양물을 37℃의 온도에서 22.5시간 동안 0.71vvm의 용적-특이적 가스발생율, 공기 포화도의 10%의 산소 분압 및 7.0의 pH에서, 16.3의 흡광도(OD)(660nm)가 달성될 때까지 배양한다.

2ℓ들이 교반 반응기 발효조(제조원: B. Braun, BBI, Germany, Melsungen, Biostat MD model)에 함유된 성장 배지 M1-463 1233g을 접종하기 위해, 영양 배지 A1-144내의 제2 예비배양물 157.6g을 첨가한다. 성장 배지 M1-463은 표 2에 기재된 성분을 함유한다. 배양물을 비교 실시예 A에 기술되어 있는 바와 같이, 37℃의 온도에서 1ℓ/분의 통기율로 800rpm으로 최소로 교반하면서 7.0의 pH 및 공기 포화도의 20%의 산소 분압에서, 약 3g/ℓ의 잔류 당 농도가 9.5시간 후에 달성될 때까지 배양한다. 이어서, 상기 방식으로 수득된 발효 브로쓰를 37℃의 온도에서 추가로 32시간 동안 공기 포화도의 20%의 산소 분압 및 pH 7.0의 pH에서, 35.8의 OD(660nm)가 달성될 때까지 배양한다. 상기 시간 동안, 농도가 650g/ℓ인 슈크로스 용액을 포함하는 생산 배지 450g을 연속적으로 공급한다. 공급액이 소비되고 당해 제1 실행의 발효 브로쓰 중 잔류 당이 소비된 후, 발효조 내용물 중 발효 브로쓰의 75%를 펌핑시켜 제거한다. 제1 발효(제1 수행)를 41.5시간 후에 종결시키면 67.1g/ℓ 트레오닌의 역가가 달성된다.

남아있는 총 양의 25%(453g)에 성장 배지 M1-527 700g를 충전시키고 발효를 다시 개시한다. 성장 배지 M1-527는 표 5에 기재된 성분을 함유한다. 당해 제2 실행의 배양물을 비교 실시예 A에서 기술한 바와 같이, 37℃의 온도에서 1ℓ/분의 통기율로 800rpm으로 최소로 교반하면서 7.0의 pH 및 공기 포화도의 20%의 산소 분압에서, 약 3g/ℓ의 잔류 당 농도가 달성될 때까지 배양한다. 이어서, 배양물을37℃의 온도에서 추가로 30시간 동안 공기 포화도의 20%의 산소 분압 및 pH 7.0의 pH에서, 36.2의 OD(660nm)가 달성될 때까지 배양한다. 농도가 650g/ℓ인 슈크로스 용액을 포하하는 생산 배지 450g을 제1 수행에서와 같이 공급한다. 발효 브로쓰를 25%까지 배출시키고 발효조에 M1-527를 충전시키는 것을 총 4회 반복한다.

각 발효 종결시에, OD 및 형성된 L-트레오닌의 농도를 비교 실시예 A에서와 같이 측정한다.

표 6은 특정 실행의 결과를 제시한 것이다. 용어 "형성된 총 L-트레오닌"은 발효 실행 동안에 효과적으로 형성되거나 생산된 L-트레오닌을 말한다. 형성된 총 L-트레오닌을 계산하기 위해서, 접종물에 의해 도입된 L-트레오닌의 양을 수행 종결시에 발효 탱크내에 존재하는 L-트레오닌의 양으로부터 공제한다. 용어 "생산성"은 발효 실행마다 형성된 총 L-트레오닌 및 실행당 발효 시간의 몫을 의미한다.

성장 배지 M1-527의 조성

성분	농도(kg당)
슈크로스	34.10g
효모 추출물	2.31g
NaCl	0.76g
(NH4)2SO4	5.78g
K2HPO4	2.314g
MgSO4·7H2O	0.464g
MnSO4·H2O	22.7㎎
FeSO4·7H2O	22.7㎎
암피실린	60㎎
스트럭톨	120㎎

실시예 3의 결과

수행	시간[h]	L-트레오닌[g/ℓ]	OD(660nm)	형성된 총 L-트레오닌[g]	생산성[g/h]
1	41.5	67.1	35.8	120.7	2.91
2	35.7	74.5	36.2	100.5	2.82
3	34.5	80.0	31.4	108.0	3.13
4	35.0	76.3	33.4	103.0	2.94
5	41.5	73.0	31.7	98.6	2.37

비교 실시예 B

종래의 발효법에 의해 에스케리치아 콜라이 K-12 균주 kat-13를 사용한 L-트레오닌의 제조

L-트레오닌 생산 이. 콜라이 균주 kat-13은 US-A-5,939,307에 기재되어 있으며, 미국 일리노이주 피오리아에 소재하는 기관[Agriculature Research Service Patent Culture Collection]에 NRRL B-21593으로서 기탁되었다.

균주 kat-13은 특히, 증폭된 "피드백" 내성 아스파르테이트 키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I, 감쇠된 트레오닌 데하이드로게나제, 보렐리딘에 대한 내성 및 슈크로스를 탄소원으로서 이용하는 능력을 지닌다.

균주 kat-13의 단일 콜로니를 3.5g/ℓ NH₂HPO₄*2H₂O, 1.5g/ℓ KH₂PO₄, 1g/ℓ NH₄Cl, 0.1g/ℓ MgSO₄*7H₂O, 2g/ℓ 글루코스, 20g/ℓ 아가의 조성을 갖는 최소 배지로 트랜스접종시킨다. 배양물을 37℃에서 약 5일 동안 배양한다. 2g/ℓ 효모 추출물, 1g/ℓ (NH₄)₂SO₄, 1g/ℓ KH₂PO₄, 0.5g/ℓ MgSO₄*7H₂O, 15g/ℓ CaCO₃, 글루코스20g/ℓ의 조성을 갖는 예비배양 배지 10㎖를 접종 루프로 접종시키고 ESR 배양기(제조원: Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland)에서 180rpm으로 37℃에서 16시간 동안 배양한다.

0.45㎖ 용적의 상기 제1 예비배양물을 영양 배지 A1-158 1500g에 접종시킨다. 배양 발효를 2ℓ들이 교반 반응기 발효조(제조원: B. Braun, BBI, Germany, Melsungen, Biostat MD model)에서 수행한다. 영양 배지 A1-158는 표 7에 기재된 성분을 함유한다. 상기 제2 예비배양물을 19.75시간 동안 0.16vvm의 용적-특이적 가스발생율, 공기 포화도의 20%의 산소 분압 및 pH 6.9의 pH에서, 모든 글루코스가 소비될 때까지 배양한다. 발효를 39℃의 온도에서 개시하고, 18시간 시간 발효한 후 온도를 37℃로 저하시킨다.

2ℓ들이 교반 반응기 발효조(제조원: B. Braun, BBI, Germany, Melsungen, Biostat MD model)에 함유된 성장 배지 M1-530 725g을 접종하기 위해, 영양 배지 A1-158 내의 제2 예비배양물 110g을 첨가한다. 성장 배지 M1-530은 표 8에 기재된 성분을 함유한다. 배양물을 37℃의 온도에서 1.3ℓ/분의 통기율로 800rpm으로 최소로 교반하면서 7.0의 pH 및 공기 포화도의 20%의 산소 분압에서, 8시간 후에 초기에 도입된 모든 글루코스가 소비될 때까지 배양한다. 이어서, 상기 방식으로 수득된 발효 브로쓰를 37℃의 온도에서 추가로 57시간 동안 공기 포화도의 20%의 산소 분압, 1.5ℓ/분의 통기율 및 pH 7.0의 pH에서 배양한다. 상기 시간 동안, 농도가 550g/ℓ인 글루코스·H₂O를 포함하는 생산 배지 1000g을 연속적으로 공급한다.

이어서, OD 및 형성된 L-트레오닌을 비교 실시예 A에서와 같이 측정한다.

65시간 후, 101.3g/ℓ의 L-트레오닌 농도가 최종 발효 샘플중에서 발견된다. 따라서, 당해 실험에서의 공간/시간 수율은 1.56g/ℓ·h이다.

영양 배지 A1-158의 조성

성분	농도(kg당)
글루코스·H2O	88g
옥수수 침지액(50%)	20g
(NH4)2SO4	0.5g
KH2PO4	2.5g
시트르산	0.192g
MgSO4·7H2O	2g
FeSO4·7H2O	30mg
MnSO4·H2O	21mg
가나마이신	50mg
스트럭톨	0.3g

성장 배지 M1-530의 조성

성분	농도(kg당)
글루코스·H2O	88g
옥수수 침지액(50%)	20g
시트르산	0.192g
(NH4)2SO4	0.5g
KH2PO4	2.5g
MgSO4·7H2O	2.0g
MnSO4·H2O	21mg
FeSO4·7H2O	30mg
가나마이신	50mg
스트럭톨	0.3g

실시예 4

연속적 유가 방법 및 10% 접종에 의해 균주 kat-13을 사용한 L-트레오닌의 제조

균주 kat-13의 단일 콜로니를 3.5g/ℓ NH₂HPO₄*2H₂O, 1.5g/ℓ KH₂PO₄, 1g/ℓ NH₄Cl, 0.1g/ℓ MgSO₄*7H₂O, 2g/ℓ 글루코스, 20g/ℓ 아가의 조성을 갖는 최소 배지에 트랜스접종시킨다. 배양물을 37℃에서 약 5일 동안 배양한다. 2g/ℓ 효모 추출물, 10g/ℓ (NH₄)₂SO₄, 1g/ℓ KH₂PO₄, 0.5g/ℓ MgSO₄*7H₂O, 15g/ℓ CaCO₃, 20g/ℓ 글루코스의 조성을 갖는 예비배양 배지 10㎖를 접종 루프로 접종시키고 ESR 배양기(제조원: Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland)에서 180rpm으로 37℃에서 16시간 동안 배양한다.

0.45㎖ 용적의 상기 제1 예비배양물을 영양 배지 A1-158 1500g에 접종시킨다. 배양 발효를 2ℓ들이 교반 반응기 발효조(제조원: B. Braun, BBI, Germany, Melsungen, Biostat MD model)에서 수행한다. 영양 배지 A1-158는 표 7에 기재된 성분을 함유한다. 상기 제2 예비배양물을 19.75시간 동안 0.16vvm의 용적-특이적 가스발생율, 공기 포화도의 20%의 산소 분압 및 pH 6.9의 pH에서, 모든 글루코스가 소비될 때까지 배양한다. 발효를 39℃의 온도에서 개시하고, 18시간 동안 발효시킨 후 온도를 37℃로 저하시킨다.

2ℓ들이 교반 반응기 발효조(제조원: B. Braun, BBI, Germany, Melsungen, Biostat MD model)에 함유된 성장 배지 M1-530 725g을 접종하기 위해, 영양 배지 A1-158 내의 제2 예비배양물 110g을 첨가한다. 성장 배지 M1-530은 표 8에 기재된성분을 함유한다. 배양물을 37℃의 온도에서 1.3ℓ/분의 통기율로 800rpm으로 최소로 교반하면서 7.0의 pH 및 공기 포화도의 20%의 산소 분압에서, 8시간 후에 초기에 도입된 모든 글루코스가 소비될 때까지 배양한다. 이어서, 상기 방식으로 수득된 발효 브로쓰를 37℃의 온도에서 추가로 57시간 동안 공기 포화도의 20%의 산소 분압, 1.5ℓ/분의 통기율 및 pH 7.0의 pH에서, 46.4의 OD(660nm)가 달성될 때까지 배양한다. 상기 시간 동안, 농도가 550g/ℓ인 글루코스·H₂O 용액을 포함하는 생산 배지 1000g을 연속적으로 공급한다. 공급액이 소비되고 당해 제1 실행의 발효 브로쓰 중의 잔류 당이 소비된 후, 발효조 내용물 중 발효 브로쓰의 90%(1651g)을 펌핑시켜 제거한다.

잔류 용적 10%(184g)에 성장 배지 M1-531 650g를 충전시키고 발효를 다시 개시한다. 성장 배지 M1-531은 표 9에 기재된 성분을 함유한다. 배양물을 37℃의 온도에서 1.5ℓ/분의 통기율로 800rpm에서 최소로 교반하면서 7.0의 pH 및 공기 포화도의 20%의 산소 분압에서 배양한다. 상기 시간 동안, 농도가 550g/ℓ인 글루코스·H₂O 용액을 포함하는 생산 배지 1000g을 연속적으로 공급한다.

각 발효 종결시에 OD 및 L-트레오닌의 농도를 비교 실시예 A에서와 같이 측정한다.

당해 2회 실행의 결과를 표 10에 제시한다. 용어 "형성된 총 L-트레오닌"은 발효 실행 동안에 효과적으로 형성되거나 생산된 L-트레오닌을 말한다. 형성된 총 L-트레오닌을 계산하기 위해서, 접종물에 의해 도입된 L-트레오닌의 양을 실행 종결시에 발효 탱크내에 존재하는 L-트레오닌의 양으로부터 공제한다. 용어 "생산성"은 발효 실행마다 형성된 총 L-트레오닌 및 실행당 발효 시간의 몫을 의미한다.

성장 배지 M1-531의 조성

성분	농도(kg당)
옥수수 침지액(50%)	22.3g
시트르산	0.214g
(NH4)2SO4	0.56g
KH2PO4	2.79g
MgSO4·7H2O	2.23g
MnSO4·H2O	24mg
FeSO4·7H2O	34mg
가나마이신	50mg
스트럭톨	0.3g

실시예 4의 결과

실행	시간[h]	L-트레오닌[g/ℓ]	OD(660nm)	형성된 총 L-트레오닌[g]	생산성[g/h]
1	65.0	101.3	46.4	159.5	2.45
2	59.0	102.6	49.0	147.9	2.51

비교 실시예 C

종래의 발효법에 의해 에스케리치아 콜라이 K-12 균주 B-3996을 사용한 L-트레오닌의 제조

L-트레오닌을 생산하는 이. 콜라이 균주 B-3996은 US-A-5,175,107에 기술되어 있으며, 러시아 모스코바에 소재하는 기관[Russian National Collection for Industrial Microorganisms(VKPM)]에 기탁되어 있다.

균주 B-3996은 특히, 증폭된 "피드백" 내성 아스파르테이트 키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I, 감쇠된 트레오닌 데아미나제, 감쇠된 트레오닌 데하이드로게나제, 5g/ℓ 이상의 L-트레오닌에 대한 내성 및 슈크로스를 탄소원으로서 이용하는 능력을 지닌다.

균주 B-3996의 단일 콜로니를 3.5g/ℓ NH₂HPO₄*2H₂O, 1.5g/ℓ KH₂PO₄, 1g/ℓ NH₄Cl, 0.1g/ℓ MgSO₄*7H₂O, 2g/ℓ 슈크로스, 20g/ℓ 아가, 20㎍/㎖ 스트렙토마이신의 조성을 갖는 최소 배지로 트랜스접종시킨다. 배양물을 37℃에서 약 5일 동안 배양한다. 2g/ℓ 효모 추출물, 10g/ℓ (NH₄)₂SO₄, 1g/ℓ KH₂PO₄, 0.5g/ℓ MgSO₄*7H₂O, 15g/ℓ CaCO₃, 20g/ℓ 슈크로스, 20㎍/ℓ스트렙토마이신의 조성을 갖는 예비배양 배지 10㎖를 접종 루프로 접종시키고 ESR 배양기(제조원: Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland)에서 180rpm으로 37℃에서 16시간 동안 배양한다.

20㎖ 용적의 상기 제1 예비배양물을 영양 배지 A1-160 1000g에 접종시킨다. 배양 발효를 2ℓ들이 교반 반응기 발효조(제조원: B. Braun, BBI, Germany, Melsungen, Biostat MD model)에서 수행한다. 영양 배지 A1-160는 표 11에 기재된 성분을 함유한다. 상기 제2 예비배양물을 37℃의 온도에서 14시간 동안 1.00vvm의 용적-특이적 가스발생율에서 공기 포화도의 20%의 산소 분압 및 pH 6.9의 pH에서, 모든 글루코스가 소비될 때까지 배양한다.

2ℓ들이 교반 반응기 발효조(제조원: B. Braun, BBI, Germany, Melsungen, Biostat MD model)에 함유된 성장 배지 M1-546 1000g을 접종하기 위해, 영양 배지A1-160 내의 제2 예비배양물 100g을 첨가한다. 성장 배지 M1-546은 표 12에 기재된 성분을 함유한다. 배양물을 37℃의 온도에서 1.0ℓ/분의 통기율로 800rpm으로 최소로 교반하면서 6.9의 pH 및 공기 포화도의 20%의 산소 분압에서, 7시간 후에 초기에 도입된 모든 슈크로스가 소비될 때까지 배양한다. 이어서, 상기 방식으로 수득된 발효 브로쓰를 37℃의 온도에서 추가로 29시간 동안 공기 포화도의 20%의 산소 분압, 1.0ℓ/분의 통기율 및 pH 6.9의 pH에서 배양한다. 상기 시간 동안, 농도가 600g/kg인 슈크로스 용액을 포함하는 생산 배지를 슈크로스 농도가 항상 0.5g/ℓ 이상이 되도록 공급한다.

이어서, 흡광도(OD)를 LP1W 타입 디지탈 광도계(제조원: Dr. Bruno Lange GmbH, 독일 베를린 소재)를 사용하여 660nm의 측정 파장에서 측정하고, 형성된 L-트레오닌의 농도를 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)를 사용하여, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌히드린 검출법을 사용하는 컬럼후 반응에 의해 측정한다.

36시간의 발효에서 L-트레오닌 63.8g이 생산된다. 따라서, 당해 실험에서의 생산성은 1.77g/h이다.

영양 배지 M1-160의 조성

성분	농도(kg당)
슈크로스	40g
효모 추출물	2g
(NH4)2SO4	5g
K2HPO4	2g
MgSO4·7H2O	0.4g
FeSO4·7H2O	20㎎
MnSO4·H2O	20㎎
스트렙토마이신	100㎎
스트럭톨	0.2g

성장 배지 M1-546의 조성

성분	농도(kg당)
슈크로스	30g
효모 추출물	2g
(NH4)2SO4	5g
KH2HPO4	2g
MgSO4·7H2O	0.4g
MnSO4·H2O	20㎎
FeSO4·7H2O	20㎎
NaCl	0.6
스트럭톨	0.3g

실시예 5

5회의 연속적 유가 방법 및 각 경우의 10% 접종에 의해 에스케리치아 콜라이 K-12 균주 B-3396을 사용한 L-트레오닌의 본 발명에 따른 제조

2ℓ들이 교반 반응기 발효조(제조원: B. Braun, BBI, Germany, Melsungen, Biostat MD model)에 함유된 성장 배지 M1-546 1000g을 접종하기 위해, 실시예 7에서 기술한 바와 같이 영양 배지 A1-160내의 제2 예비배양물 100g을 첨가한다. 성장 배지 M1-546은 표 12에 기재된 성분을 함유한다. 배양물을 37℃의 온도에서 1.0ℓ/분의 통기율로 800rpm으로 최소로 교반하면서 6.9의 pH 및 공기 포화도의 20%의 산소 분압에서, 7시간 후에 초기에 도입된 모든 슈크로스가 소비될 때까지 배양한다. 이어서, 상기 방식으로 수득된 발효 브로쓰를 37℃의 온도에서 공기 포화도의 20%의 산소 분압, 1.0ℓ/분의 통기율 및 및 pH 6.9의 pH에서 추가로 29시간 동안 배양한다. 상기 시간 동안, 농도가 600g/kg인 슈크로스 용액을 포함하는 생산 배지 411.8g을 연속적으로 공급한다.

이어서, 발효 브로쓰를 총 양의 10%까지 배출시킨다. 남아있는 총 양의 10%에 성장 배지 M1-546을 출발 중량 1100g이 되도록 충전시키고, 발효를 다시 개시한다. 상기 성장 배지 M1-546은 표 13에 기재된 성분을 함유한다. 당해 제3 실행의 배양물을 실시예 7에서 기술한 바와 같이 37℃의 온도에서 1.0ℓ/분의 통기율로 800rpm에서 최소로 교반하면서 6.9의 pH 및 공기 포화도의 20%의 산소 분압에서, 8시간 후에 초기에 도입된 모든 슈크로스가 소비될 때까지 배양한다. 이어서, 배양물을 37℃의 온도에서 추가로 28시간 동안 공기 포화도의 20%의 산소 분압 및 pH 6.9의 pH에서 배양한다. 상기 시간 동안, 농도가 600g/kg인 슈크로스 용액을 포함하는 생산 배지를 발효조내 슈크로스 농도가 항상 0.5g/ℓ가 되도록 공급한다. 총 36시간 후, 발효 실행을 중단한다. 발효 브로쓰를 10%까지 배출시키고 발효조에 M-546을 충전시키는 것을 총 5회 반복한다.

각 발효 종결시에 OD 및 형성된 L-트레오닌의 농도를 비교 실시예 A에서와같이 측정한다.

표 13은 특정 실행의 결과를 제시한 것이다. 용어 "형성된 총 L-트레오닌"은 발효 실행 동안에 효과적으로 형성되거나 생산된 L-트레오닌을 말한다. 형성된 총 L-트레오닌을 계산하기 위해, 접종물에 의해 도입된 L-트레오닌의 양을 실행 종결시에 발효 탱크내에 존재하는 L-트레오닌의 양으로부터 공제한다. 용어 "생산성"은 발효 실행마다 형성된 총 L-트레오닌 및 실행당 발효 시간의 몫을 의미한다.

실시예 5의 결과

실행	시간[h]	L-트레오닌 수율[g/g 슈크로스]	OD(660nm)	형성된 총 L-트레오닌[g]	생산성[g/h]
1	36	22.7	39.1	63.8	1.77
2	36	25.9	26.2	45.2	1.26
3	36	19.9	39.0	47.5	1.32
4	36	27.5	40.0	79.3	2.20
5	36	21.3	40.0	63.2	1.76
6	36	26.3	41.7	82.4	2.29

Claims (12)

1. (a) 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 과의 L-트레오닌 생산 미생물을 유가 방법(유가 뱃치)으로 배양하고,

   (b) 발효 브로쓰의 일부를 발효 탱크내에 잔류하는 발효 브로쓰의 총 용적의 1 내지 90용적%, 특히 1 내지 50용적%, 바람직하게는 1 내지 25용적%의 양으로 분리하고,

   (c) 잔류 발효 브로쓰에 영양 배지를 충전시키고, 바람직하게는 성장기 후에 추가의 발효를 (a)에 따라서 수행하고,

   (d) 임의로, 단계 (b) 및 (c)를 수회 수행하고,

   (e) L-트레오닌을 수집된 발효 브로쓰로부터 분리시킴을 포함하는, L-트레오닌의 발효적 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 단계 (b) 및 (c)를 2회 내지 6회 수행하고 L-트레오닌을 수집된 발효 브로쓰로부터 분리시키는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 종의 미생물이 사용되는 방법.
4. 증폭된 내성 아스파르테이트 키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I, 감쇠된트레오닌 데아미나제, 5g/ℓ 이상의 트레오닌에 대한 내성 및 슈크로스를 탄소원으로 이용하는 능력 및 parB 유전자 영역을 지니는 엔테로박테리아세애 과의 L-트레오닌 생산 및 분비 미생물.
5. 브라인슈바이크에 소재하는 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하[German Collection of Microorganisms and Cell Cultures]에 기탁 번호 DSM 12790로서 기탁된, 제4항에 따르는 형질전환체.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 증폭된 피드백 내성 아스파르테이트 키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I, 감쇠된 트레오닌 데아미나제, 감쇠된 트레오닌 데하이드로게나제, 5g/ℓ 이상의 트레오닌에 대한 내성, 보렐리딘에 대한 내성, α-메틸세린에 대한 내성, 디아미노석신산에 대한 내성, 플루오로피루베이트에 대한 민감성, L-글루탐산에 대한 내성, L-메티오닌에 대한 요구성 및 슈크로스를 탄소원으로서 이용하는 능력으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 지니는 엔테로박테리아세애 과의 L-트레오닌 생산 및 분비 미생물이 사용되는 방법.
7. 제6항에 있어서, 증폭된 내성 아스파르테이트 키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I, 감쇠된 트레오닌 데아미나제, 5g/ℓ 이상의 트레오닌에 대한 내성 및 슈크로스를 탄소원으로서 이용하는 능력을 지니는 엔테로박테리아세애 과의 L-트레오닌 생산 및 분비 미생물이 사용되는 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 증폭된 피드백 내성 아스파르테이트 키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I, 감쇠된 트레오닌 데아미나제, 감쇠된 트레오닌 데하이드로게나제, 5g/ℓ 이상의 트레오닌에 대한 내성 및 슈크로스를 탄소원으로 이용하는 능력으로 이루어진 그룹으로부터 선태되는 하나 이상의 특징을 지니는 엔테로박테리아세애 과의 L-트레오닌 생산 및 분비 미생물이 사용되는 방법.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 증폭된 피드백 내성 아스파르테이트 키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I, 감쇠된 트레오닌 데아미나제, 보렐리딘에 대한 내성 및 슈크로스를 탄소원으로서 이용하는 능력으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 지니는 엔테로박테리아세애 과의 L-트레오닌 생산 및 분비 미생물이 사용되는 방법.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, α-메틸세린에 대한 내성, 디아미노석신산에 대한 민감성, 플루오로피루베이트에 대한 민감성, L-글루탐산에 대한 내성 및 7% 이상의 L-트레오닌에 대한 내성, L-메티오닌 요구성 및 L-이소류신 요구성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 지니는 엔테로박테리아세애 과의 L-트레오닌 생산 및 분비 미생물이 사용되는 방법.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, DSM12790, B-3996, kat 13, KCCM-1032 및 KCCM-1033으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 균주의 하나 이상의 특징 또는 특성을 지니는 엔테로박테리아세애 과의 L-트레오닌 생산 및 분비 미생물이 사용되는 방법.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, DSM12790, B-3996, kat 13, KCCM-1032 및 KCCM-1033으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 균주가 사용되는 방법.