BR122012033754B1 - método para a produção de l-treonina ou l-isoleucina - Google Patents

Abstract

método parta a produção de l-treonina ou l-isoleucina. treonina ou isoleucina é para ser produzida pelo cultivo de uma bactéria pertecente ao gênero escherichia, que tem uma capacidade de produzir l-treonina ou l-isoleucina, e em que a atividade fosfoenolpiruvato carboxilase intracelular e a atividade transdrogenase são intensificadas, em um meio para produzir e acumular treonina ou isoleucina no meio, e coletar a treonina ou isoleucina do meio.

Description

"MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE L-TREONINA OU L-ISOLEUCINA". “Pedido dividido de PI0103319-0, depositado em 10/08/2001” FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Campo da invenção A presente invenção diz respeito a uma técnica utilizada na indústria de fermentação, e diz respeito a uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia, que produz L-treonina ou L-isoleucina, e a um método para produzir L-treonina ou L-isoleucina usando-se a bactéria.

Descrição da técnica relacionada A produção industrial de L-aminoácidos tais como L-treonina e L-isoleucina tem sido convencionalmente obtida pelo método de fermentação usando-se microorganismos tais como as bactérias corineformes e bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, que têm a capacidade de produzir tais L-aminoácidos. Como estas bactérias produtoras de aminoácidos, são usadas cepas isoladas da natureza, suas cepas mutantes artificiais ou suas cepas recombinantes, em que as enzimas de biossíntese de L-aminoácidos são intensificadas pela recombinação genética de modo a obter-se produtividade melhorada.

Especificamente, como métodos para produzir L-treonina, foi apresentado um método que utiliza uma cepa mutante de bactéria pertencente ao gênero Escherichia na Publicação Aberta ao Público da Patente Japonesa (Kokai) número 5-304969, métodos que utilizam as cepas recombinantes de Escherichia coli na Publicação de Patentes Japonesas números 1-29559, 2109985, 56-15696 e na Publicação da Patente Internacional em Japonês (Kohyo) número 3-501682, e um método que utiliza uma cepa mutante da bactéria Corynebacterium na Publicação Aberta ao Público de Patente Japonesa número 62-239996, e um método que utiliza uma cepa mutante da bactéria Corynebacterium é relatado na Publicação Aberta ao Público da Patente Japonesa número 61-195695. Além disso, métodos para produzir L-treonina mediante a utilização de cepas transformadas com plasmídeos contendo o óperon de treonina foram apresentados na Publicação Aberta ao Público de Patentes Japonesas números 55-131397, 59-31691, 56-15696 e na Publicação de Patente Internacional em Japonês número 3-501682.

Além disso, como métodos para produzir L-isoleucina, foi apresentado um método que utiliza Escherichia coli na Publicação Aberta ao Público de Patente Japonesa número 5-130882, um método que utiliza uma cepa recombinante de Escherichia coli na Publicação Aberta ao Público de Patente Japonesa número 2-458, um método que utiliza a cepa mutante da bactéria Corynebacterium na Publicação de Patente Japonesa número 362395, e um método que utiliza uma cepa recombinante da bactéria Corynebacterium na Publicação de Patente Japonesa (Kokocu) número 547196. Sabe-se também que a capacidade de produção da L-isoleucina pode ser transmitida pela introdução do óperon thrABC contendo o gene thrA codificando a aspartocinase I-homoserina desidrogenase I derivada de Escherichia coli, cuja inibição pela L-treonina é substancialmente dessensibilizada, e o óperon ilvGMEDA contendo o gene ilvA que codifica a treonina desaminase, cuja inibição pela L-isoleucina é substancialmente dessensibilizada, e da qual uma região necessária para atenuação é removida (ver a Publicação Aberta ao Público de Patente Japonesa número 8-47397.

Por enquanto, a sequência do gene fosfoenolpiruvato carboxilase de Escherichia coli é conhecida (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. e Katsuki H.. J. Biochem. 95, 909-916 (1984)), e tem sido apresentado fosfoenolpiruvato carboxilase cuja inibição da regeneração por ácido aspártico é substancialmente dessensibilizada e um método para a utilização de um gene por isto (WO 95/06114). Ademais, é também conhecido um exemplo de intensificação do gene fosfoenolpiruvato carboxilase com o propósito de intensificação da capacidade de produção do ácido L-glutâmico de bactérias coriformes (Publicação Aberta ao Público de Patente Japonesa número 60-87788). Além disso, foram também apresentado técnicas de melhorar a capacidade de produção do aminoácido mediante a intensificação de um gene fosfoenoilpiruvato carboxilase juntamente com outros genes de enzima. Por exemplo, um exemplo foi relatado, em que a capacidade de produção do ácido L-glutâmico foi intensificada pela intensificação do gene glutamato desidrogenase, gene citrato sintetase e gene fosfoenolpiruvato carboxilase em bactérias corineformes em que o gene a-cetoglutarato desidrogenase foi anulado (WO 96/06180). Como para Escherichía coli, tem sido apresentado que a capacidade produtora de L-treonina não foi significativamente aumentada mesmo se um gene fosfoenolpiruvato carboxilase tipo silvestre foi introduzido em uma cepa produtora de L-treonina de Escherichía coli, B-3996, que foi transformado com um plasmídeo recombinante contendo o óperon de treonina (WO 95/06114).

Ademais, foi também apresentado que a capacidade de produzir substâncias tais como aminoácidos pode ser melhorada mediante o aumento da atividade enzimática de nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (também referida como “transidrogenase” daqui em diante) nas células microbianas, e aumentando a capacidade produtora de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato tipo reduzida (WO 95/11985). Nesta referência, é também mencionado um exemplo de melhora da capacidade produtora de L-treonina por intensificar um gene transidrogenase em Escherichía coli transformado com um plasmídeo recombinante contendo o óperon de treonina. Como um aminoácido do qual a produtividade é melhorada por elevação da atividade transidrogenase, a L-isoleucina foi mencionada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é melhorar a capacidade de produção da L-treonina ou L-isoleucina de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia.

Os inventores da presente invenção observaram que a capacidade de produzir L-treonina ou L-isoleucina foi marcadamente aumentada pela intensificação tanto da atividade fosfoenoilpiruvato carboxilase quanto da atividade transidrogenase, e ainda observaram que a capacidade produtora foi também melhorada pela intensificação da atividade aspartase.

Isto é, a presente invenção fornece os seguintes. (1) Uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia, que tem uma capacidade de produzir L-treonina ou L-isoleucina, e em que a atividade fosfoenolpiruvato carboxilase intracelular e a atividade transidrogenase são intensificadas. (2) A bactéria pertencente ao gênero Escherichia de acordo com (1), em que a atividade de uma enzima ou enzimas codificadas por óperon de treonina ou uma parte deste é intensificada, e que tem capacidade produtora de L-treonina. (3) A bactéria pertencente ao gênero Escherichia de acordo com (2), em que o óperon de treonina consiste de thrABC. (4) A bactéria pertencente ao gênero Escherichia de acordo com (1), em que a atividade de uma enzima ou enzimas codificadas por óperon ilv ou uma parte deste é intensificada, e que tem capacidade produtora de L-isoleucina. (5) A bactéria pertencente ao gênero Escherichia de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que a atividade aspartase é intensificada. (6) A bactéria pertencente ao gênero Escherichia de acordo com qualquer um de (1) a (5), em que a atividade de cada enzima é intensificada mediante o aumento do número de cópias de um gene ou óperon codificando cada enzima, ou modificando uma sequência reguladora da expressão de modo que a expressão intracelular do gene ou óperon deva ser intensificada. (7) A bactéria pertencente ao gênero Escherichia de acordo com (6), em que o gene é derivado de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia. (8) Um método para a produção de L-treonina ou L-isoleucina, que compreende o cultivo de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia de acordo com qualquer um de (1) a (7) e um meio para produzir e acumular L-treonina ou L-isoleucina no meio, e coletar a L-treonina ou L-isoleucina do meio.

De acordo com a presente invenção, a capacidade de produtora de L-treonina ou L-isoleucina de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia pode ser melhorada.

BREVE EXPLICAÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra a construção do plasmídeo pMW118::aspA contendo o gene aspA. A Fig. 2 mostra a construção do plasmídeo contendo o gene pntAB e o gene ppc (pPTS). A Fig. 3 mostra a construção do plasmídeo contendo o gene aspA e o gene ppc (pAPW). A Fig. 4 mostra a construção do plasmídeo contendo o gene aspA, o gene pntAB e o gene ppc (pAPT). A Fig. 5 mostra a construção do plasmídeo pHSGSK. A Fig. 6 mostra a construção do plasmídeo pdGMl. A Fig. 7 mostra a construção do plasmídeo pMWGMA2. A Fig. 8 mostra a construção do plasmídeo pMWD5. A Fig. 9 mostra a construção de pMWD5-aspA, pMWD5-THY, pMWD5-ppc, pMWD5-PTS e pMWD5-APT.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Daqui em diante, a presente invenção será explicada em detalhes.

Uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia da presente invenção é uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia que tem uma capacidade de produzir L-treonina ou L-isoleucina, e tem atividade fosfoenolpiruvato carboxilase intracelular intensificada (também abreviada como “PEPC” daqui em diante) e atividade transidrogenase (também abreviada como “THY” daqui em diante).

Como as bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, especificamente, aquelas mencionadas no trabalho de Neidhardt et al. (Neidhardt, F. C. et al., Escherichia coli e Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabela 1) podem ser usadas. Por exemplo, a Escherichia coli pode ser mencionada. A expressão “tendo capacidade de produzir L-treonina ou L-isoleucina” aqui usada significa que, quando a bactéria de interesse for cultivada em um meio, ela mostra uma capacidade de acumula L-treonina ou L-isoleucina no meio. Esta capacidade produtora de L-treonina ou L-isoleucina pode ser uma propriedade possuída por uma cepa silvestre ou uma propriedade transmitida ou intensificada pela reprodução.

Na bactéria pertencente ao gênero Escherichia da presente invenção, a atividade aspartase intracelular (L-aspartato amônia-liase, também referido como “AspA” daqui em diante) pode ser ainda intensificada.

De modo a intensificar a atividade de PEPC, THY ou AspA nas bactérias pertencentes aos gênero Escherichia, um gene codificando PEPC, THY ou AspA pode ser clonado em um plasmídeo adequado, e uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia que serve como um hospedeiro pode ser transformada com o plasmídeo obtido. Isto aumenta o número de cópias de um gene que codifica PEPC, THY ou AspA (daqui em diante abreviado como “gene ppc”, “gene pntAB” e “gene apsA”, respectivamente, nesta ordem) no transformante, e como um resultado, a atividade de PEPC, THY ou AspA é intensificada. O gene ppc, gene pntAB e gene apsA são introduzidos em uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia como uma combinação do gene ppc e gene pntAB, ou uma combinação destes genes e o gene AspA. Estes genes podem ser introduzidos em um hospedeiro como uma espécie de plasmídeo em que dois ou três dos genes são clonados, ou duas ou três espécies de plasmídeos que podem coexistir, em que os genes são respectivamente clonados. A intensificação da atividade PEPC, THY ou AspA pode também ser alcançada por permitir a existência de múltiplas cópias do gene ppc, gene pntAB ou gene apsA no DNA cromossômico da cepa parente original que serve como um hospedeiro. De modo a introduzir múltiplas cópias no gene ppc, gene pntAB ou gene apsA para dentro do DNA cromossômico de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia, uma sequência da qual múltiplas cópias existem no DNA cromossômico, por exemplo, DNA respectivo, repetições invertidas existindo na extremidade de um elemento transponível etc., pode ser usada. Altemativamente, é também possível incorporar o gene ppc, gene pntAB ou gene apsA para dentro do transposon, e permitir sua transferência para introduzir múltiplas cópias de cada gene no DNA cromossômico. Por cada método, o número de cópias do gene ppc, gene pntAB ou gene apsA dentro das células da cepa transformante aumenta, e como um resultado, a atividade PEPC, THY ou AspA é intensificada. A intensificação da atividade PEPC, THY ou AspA pode também ser alcançada pela, além de ser baseada na amplificação do gene acima mencionado, substituição de uma sequência reguladora da expressão de gene ppc, gene pntAB ou gene apsA tal como um promotor com um mais forte (ver Publicação Aberta ao Público de Patente Japonesa número 1- 215280). Por exemplo, promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR e promotor PL da fago lambda, promotor tet, promotor amyE, promotor spac e assim por diante são conhecidos como promotores fortes. A substituição destes promotores intensifica a expressão do gene ppc, gene pntAB ou gene apsA, e em consequência a atividade PEPC, THY ou AspA é intensificada. A intensificação de uma sequência reguladora da expressão pode ser combinada com o aumento do número de cópias do gene ppc, gene pntAB ou gene apsA. O organismo como a fonte do gene ppc, gene pntAB ou gene apsA pode ser qualquer organismo tendo a atividade PEPC, THY ou AspA. Particularmente preferidas são as bactérias que são procariotas, por exemplo, bactérias pertencentes ao gênero Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacteriuym ou Bacilus. Como um exemplo específico, a Escherichia coli pode ser mencionada. O gene ppc, gene pntAB ou gene apsA pode ser obtido do DNA cromossômico de tais microorganismos como mencionados acima. O gene ppc de Escherichia coli pode ser obtido de um plasmídeo tendo este gene, plasmídeo pS2 (Sabe, H. et al., Gene, 31, 219 (1984)) ou pT2. Por digerir o pS2 com Aatll e αβΙΙ, um fragmento de DNA contendo o gene ppc pode ser obtido. Um fragmento de DNA tendo o gene ppc pode também ser obtido mediante a digestão do pT2 com Smal e Seal. A cepa E. coli F15 (AJ12873) abrigando pT2 foi depositada em 15 de julho de 1993 no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japan, postal code: 305-8566) (correntemente, a associação administrativa independente, o National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Chuo Daí-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, postal code: 305-5466) e recebeu um número de acesso FERM P-13752. Então, foi transferida a um depósito internacional sob as condições do tratado de Budapest em 11 de julho de 1994, e recebeu um número de acesso FERM BP-4732. O gene pntAB pode ser obtido pela digestão do plasmídeo pMW::THY (WO 95/11985) contendo o gene com Smal e Hindlll. A cepa de Escherichia coli AJ12929 abrigando pMW::THY foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (postal code: 305-8566, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japan) em 4 de outubro de 1993 e recebeu um número de acesso FERM P-13890. Então, foi transferida do depósito original acima para um depósito internacional sob as condições do tratado de Budapest em 14 de setembro de 1994, e recebeu um número de acesso FERM BP-4798. A transidrogenase de Escherichia coli consiste de duas subunidades, que são codificadas por pntA e pntB, respectivamente.

Enquanto a bactéria pertencente ao gênero Escherichia da presente invenção não é particularmente limitada já que tem a capacidade produtora de L-treonina ou L-isoleucina, exemplos específicos destes incluem, por exemplo, bactérias pertencentes ao gênero Escherichia comunicada com a capacidade produtora de L-treonina mediante a intensificação da atividade de uma enzima codificada pelo óperon de treonina ou uma parte deste e além disso, as bactérias pertencentes ao gênero Escherichia comunicadas com a capacidade produtora de L-isoleucina pela intensificação da atividade de uma enzima codificada pelo óperon ilv ou uma parte deste. O óperon de treonina ou uma parte deste pode ser, por exemplo, thrABC ou uma parte deste. O óperon ilv ou uma parte deste pode ser, por exemplo, ilvGMEDA ou uma parte deste.

Como a Escherichia coli tendo a capacidade produtora de L- treonina, pode ser especificamente mencionada a Escherichia coli VKPM B-3996 (depositada em 19 de novembro de 1987 em All-Union Scientific Center of Antibiotics, Nagatinskaya Street 3-A, 113105, Moscow, Russiam Federation com um número de registro RIA 1867, ver a Patente U.S. número 5.175.107), Escherichia coli AJ11335 (Publicação Aberta ao Público de Patente Japonesa número 55-131397) e assim por diante. A cepa VKPM B3996 abriga um plasmídeo pVIC40 (International Patent Publication WO 90/04636), que é obtido por inserir um gene do sistema da biossíntese de treonina (óperon de treonina: thrABC) em um plasmídeo de vetor de faixa ampla de hospedeiro tendo um marcador de resistência da estreptomicina, pAYC32 (ver Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid, 1986, 16, 161-167). A inibição da regeneração por L-treonina da aspartocinase I-homoserina desidrogenase I codificada por thrA em que o óperon é dessensibilizado.

Como bactérias pertencentes ao gênero Escherichia tendo capacidade produtora de L-isoleucina, a Escherichia coli KX141 (VKPM B-4781, ver a Publicação Aberta ao Público de Patente Européia número 519.113) e Escherichia coli AJ12919 (Publicação Aberta ao Público de Patente Japonesa número 8-47397) podem ser mencionadas. A cepa VKPM B-3996 em que o óperon ilv é amplificado é também uma bactéria produtora de L-isoleucina preferida. O óperon de treonina contém os genes thrA, thrB e thrC, e eles codificam as aspartocinase I-homoserina desidrogenase I, homoserina cinase e treonina sintase, respectivamente, nesta ordem. Como para estas enzimas, é preferível que a inibição da aspartocinase I-homoserina desidrogenase I por L-treonina deva ser substancialmente dessensibilizada. O óperon de ilvGMEDA contém os genes ilvG, ilvM, ilvE, ilvD e ilvA, e eles codificam a subunidade grande, a subunidade pequena, a transaminase, a desidratase de ácido di-hidróxi e a treonina desaminase de isozima II da sintase de ácido aceto-hidróxi, respectivamente, nesta ordem. Visto que o óperon ilvGMEDA esta sob controle (atenuação) da expressão do óperon por L-valina e/ou L-isoleucina e/ou L-leucina, uma região requerida para a atenuação pode ser removida ou mudada em uma bactéria produtora de L-isoleucina de modo a dessensibilizar a supressão da expressão pela L-isoleucina produzida. Como o óperon ilvGMEDA, esses derivados das bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, em particular, o óperon ilvGMEDA derivado da E. coli, podem ser mencionados. O óperon ilvGMEDA é detalhado na WO 96/26289. Como para o óperon ilvGMEDA, é preferível que a região requerida para a atenuação deva ser removida, e entre as enzimas codificadas por este óperon, a inibição da treonina desaminase por L-isoleucina deve ser substancialmente dessensibilizada (ver a Publicação Aberta ao Público da Patente Japonesa número 8-47397). A intensificação das atividades das enzimas codificadas pelo óperon de treonina ou óperons ilv ou uma parte destes pode ser alcançada da mesma maneira como aquela para PEPC, THY e AspA.

Em um microorganismo usado para a presente invenção, se um gene para uma enzima responsável por um caminho envolvido na biossíntese do aminoácido alvo for intensificado, ou um gene ou óperon codificando uma enzima tipo dessensibilizada (inibição tipo dessensibilizada) de uma enzima sofrendo da inibição da regeneração for introduzido, a capacidade produtora de L-aminoácido pode ainda ser melhorada. A treonina ou isoleucina pode ser produzida pelo cultivo de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia em que PEPC e THY assim como AspA, se requerido, são intensificados como descrito acima e que tem uma capacidade para produzir L-treonina ou L-isoleucina em um meio de produzir e acumular treonina ou isoleucina no meio, e coletar a treonina ou isoleucina do meio. O meio usado para o cultivo pode ser um meio usual contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio, íons inorgânicos, e outros componentes orgânicos como requerido.

Quanto à fonte de carbono, é possível usar açúcares tais como glicose, lactose, galactose, frutose e hidrosilato de amido; álcoois tais como glicerol e sorbitol; ou ácidos orgânicos tais como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico.

Quanto à fonte de nitrogênio, é possível usar sais de amônio inorgânico tal como sulfato de amônio, cloreto de amônio ou fosfato de amônio; nitrogênio orgânico tal como hidrolisato de feijão de soja; gás de amônia; ou amônia aquosa.

Como para os nutrientes de traço orgânico, é desejável adicionar substâncias requeridas tais como vitamina Bi, extrato de levedura e assim por diante em uma quantidade adequada. Além destes, quantidades pequenas de fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íons de ferro, íons de manganês e assim por diante são adicionados. O cultivo é preferivelmente realizado sob uma condição aeróbica por 16 a 72 horas. A temperatura de cultivo é controlada para ser de 25°C a 45°C, e o pH é controlado para ser de 5 a 8 durante o cultivo. As substâncias inorgânicas ou orgânicas, acídicas ou alcalinas assim como gás de amônia e assim por diante podem ser usadas para o ajuste do pH. A coleta de L-treonina ou L-isoleucina do líquido fermentado é geralmente realizada por uma combinação de uma técnica de resina de troca de íon, precipitação e outras técnicas conhecidas.

MELHOR MANEIRA DE REALIZAR A INVENÇÃO A presente invenção será ainda especificamente explicada em seguida com referência aos seguintes exemplos.

Exemplo 1: Produção de plasmídeo contendo vários genes (1) Produção de plasmídeo contendo o gene aspA (pMWl 18::aspA) Um fragmento de DNA contendo o gene aspA foi amplificado por PCR usando o DNA cromossômico da cepa Escherichia coli W3110 como um padrão e os seguintes iniciadores.

Iniciador 1: 5’-TGATCAGCGAAACACTTTTA-3’(SEQ IDNO: 1) Iniciador 2: 5 ’-C AGCAAACTATGATGAGAA-3 ’(SEQ ID NO: 2) O fragmento amplificado obtido foi inserido no sítio de divagem Smal de pMW 118 (Nippon Gene) para obter pMW 118::aspA (Fig- 1). (2) Produção do plasmídeo contendo o gene pntAB e o gene ppc (pPTS) O plasmídeo pMW:THY contendo o gene pntAB descrito na WO 95/11985 foi digerido com Smal e Hindlll, e um fragmento de DNA contendo pntAB foi coletado. Depois, o plasmídeo pppc contendo o gene ppc descrito na WO 95/16042 foi digerido com Xbal. Após ambas as extremidades terem sido terminadas embotadas, foi ainda digerido com Hindlll, e inserido com o fragmento de DNA acima contendo pntAB no sítio de divagem para obter um plasmídeo pPTS (Fig. 2). (3) Produção de plasmídeo contendo o gene aspA e o gene ppc (pAPW) pMWI18::aspA foi digerido com Saci, e ambas as extremidades foram terminadas embotadas. Foi ainda digerido com Hindlll para se obter um fragmento de DNA contendo aspA. Depois, o pppc acima mencionado foi digerido com Xbal, e ambas as extremidades foram terminadas embotadas. Foi ainda digerido com Hindlll, e inserido com o fragmento de DNA acima mencionado contendo aspA no sítio de divagem para obter pAPW (Fig. 3). (4) Produção de plasmídeo contendo o gene aspA, o gene pntaB, e o gene ppc (pAPT) Um fragmento de DNA contendo pntAB foi obtido por digerir pMW:: THY com Smal e Hindlll. Depois, o pAPW acima mencionado foi digerido com Xbal, e ambas as extremidades foram terminadas embotadas. Foi ainda digerido com Hindlll e inserido com o pntAB acima mencionado no sítio de divagem para obter pAPT (Fig. 4). (5) Produção de plasmídeo contendo óperon ilvGMEDA (pMWD5) Um fragmento de DNA contendo óperon ilvGMEDA foi preparado do plasmídeo pMWD5 contendo o óperon ilvGMED, que é apresentado na WO 96/26289. O plasmídeo pMWD5 foi construído como se segue. O DNA cromossômico foi extraído da Escherichia coli MI 162. O DNA cromossômico foi clivado com a enzima de restrição Hindill. O tamanho de um fragmento de DNA hindlll-Hindlll incluindo os genes ilvGM foi observado ser 4,8 kb. Portanto, o fragmento de DNA Hindíll-Hindlll com aproximadamente 4,8 kb e o fragmento de DNA obtido pela digestão do vetor plasmídeo pBR322 (adquirido da Takara Shuzo, Co, Ltd.) com Hindill, foram ligados. A mistura ligada ao DNA resultante foi induzida na Escherichia coli MI 162 que é uma cepa deficiente da sintase de ácido aceto-hidróxi. As cepas em que a deficiência da sintase de ácido aceto-hidróxi foi complementada por transformação foram selecionadas e a estrutura do plasmídeo foi isolada das cepas selecionadas. Os resultados da análise do plasmídeo revelaram que um fragmento de DNA de 4,8 kb contendo o gene ilvGM e uma porção de 5’-terminal do gene ilvE foi inserido na sítio Hindill do pBR322. O plasmídeo foi denominado pBRGM7.

Os oligonucleotídeos sintéticos apresentados na SEQ ID NO: 3 e NO: 4 foram sintetizados com referência à sequência de DNA do gene ilvGM descrito em Gene, 97, 21 (1991), Pro. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 78, 922, (1981) e J. Bacteriol., 149, 294, (1982). O DNA foi amplificado pelo método PCR, usando tanto oligonucleotídeos como iniciadores quanto o DNA cromossômico da cepa MI 162 como um padrão. O fragmento amplificado foi denominado Fragmento (A).

Similarmente, os oligonucleotídeos sintéticos apresentados na SEQ ID NO: 5 e NO: 6 foram sintetizados com referência à sequência de DNA descrita em Gene, 97, 21 (1991), Pro. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 78, 922, (1981) e J. Bacteriol., 149, 294, (1982). O DNA foi amplificado pelo método PCR, usando tanto DNAs sintetizados como iniciadores quanto o DNA cromossômico da cepa Ml 162 como um padrão. O fragmento de DNA amplificado foi denominado Fragmento (B). O plasmídeo pUCA foi preparado pela ligação do fragmento grande obtido pela digestão do Fragmento (A) com Smal e o fragmento de DNA obtido pela digestão do vetor, pUC18 (Takara Shuzo, Co., Ltd.) com Smal. O plasmídeo pHSGB foi preparado pela ligação do fragmento grande obtido pela digestão do Fragmento (B) com Kpnl e o fragmento obtido pela digestão do vetor, pHSG399 (Takara Shuzo, Co., Ltd.) com hincll e Kpnl. O pUCA plasmídeo foi digerido com Kpnl, o fragmento de final embotado foi preparado com o fragmento grande de DNA polimerase I (fragmento Klenow), e digerido com Pstl, e finalmente, um fragmento DNA contendo o Fragmento (A) foi isolado. O plasmídeo pHSGB foi digerido com HindIII, o fragmento de final embotado foi preparado com o fragmento grande de DNA polimerase I (fragmento Klenow), e digerido com Pstl, e finalmente, um fragmento DNA contendo o Fragmento (B) foi isolado. O plasmídeo pHSGSK foi preparado pela ligação de ambos os fragmentos de DNA. O fragmento Smal-Kpnl derivado dos Fragmentos (A) e (B) em pHSHSK foi denominado Fragmento (C). O Fragmento (C) correspondido a um fragmento com Smal e Kpnl, continha um promotor, a sequência SD e uma região a montante do gene ilvG, mas perdeu a sequência de DNA de 0,2 kb de uma sequência líder para um atenuador. O esquema de construção de pHSGSK é resumido na Fig. 5. O fragmento (C) foi obtido pela digestão do plasmídeo pHSGSK com Smal e Kpnl, o fragmento de DNA grande foi obtido pela digestão do plasmídeo pBRGM7 com Smal e Kpn\, e ambos os dois fragmentos foram ligados. O plasmídeo obtido foi denominado pdGMl. O pdGMl abrigou um fragmento Hindlll-Hinálll de 4,6 kb incluindo o gene ilvGM, que perdeu a região necessária para a atenuação. Este gene ilvGM que perde a região necessária para a atenuação representa “attGM”. O esquema da construção de pdGMl é resumido na Figura 6. O plasmídeo pDRIA4 descrito no Pedido de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-458 (1990) é preparado pela combinação do vetor de laçadeira pDR1120, que permite a réplica autônoma tanto em um microorganismo pertencente ao gênero Escherichia quanto em um microorganismo pertencente ao gênero Brevibacterium, com um fragmento BamHl-BamWl incluindo o gene ilvA codificando a treonina desaminase e uma porção do 3’-terminal do gene ilvD derivado da E. coli K-12. O Pedido de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-458 (1990) descreve que o tamanho do fragmento BamHl-BamHl é de 2,3 kb; no entanto, presentemente, o tamanho deste fragmento foi observado ser de 2,75 kb. O plasmídeo pDRIA4 não está presente dentro do DNA cromossômico de Brevibacterium flavum AJ12358 (FERM P-9764) ou Brevibacterium flavum AJ12359 (FERM 0-9765). Destas cepas, o plasmídeo pDRIA4 pode ser preparado de acordo com o método usual.

De um fragmento de DNA BamYH-BamYlA de 2,75 kb no plasmídeo pDRIA4, um fragmento Hindlll-BamHl incluindo o gene ilvA codificando a treonina desaminase, em que a inibição por L-isoleucina foi liberada, foi preparado, e ligado a um fragmento de DNA obtido pela divagem do vetor pMW119 (NIPPON GENE) com Hinálll e BamlAl. O plasmídeo resultante foi denominado pMWAl.

Um fragmento de DNA obtido pela divagem do plasmídeo pMWAl com Hinálll e um fragmento de DNA obtido pela divagem do plasmídeo pdGMl com Hinálll foram ligados. De acordo com a análise da posição dos sítios de restrição dos plasmídeos ligados, o plasmídeo em que as orientações transcricionais dos genes ilvGM e ilvA foram os mesmos foi selecionado, e denominado pMWGMA2. O pMWGMA2 inclui o gene ilvGM em que uma atenuante foi anulado, uma porção 5’-terminal do gene ilvE, e uma porção 3’ -terminal do gene ilvD. O esquema da construção de pMWGMA2 é resumido na Figura 7. O DNA cromossômico de Escherichia coli MI 162 foi preparado e clivado com Sall e PStl para preparar a mistura de fragmentos de DNA. Por outro lado, um fragmento de DNA foi preparado pela divagem do vetor pUC19 (Takara Shuzo, Co., Ltd.) com Sall e Psti. A mistura de fragmentos de DNA foi ligada ao fragmento de DNA obtido pela divagem do pUC19, e a mistura de DNA foi obtida. A mistura de DNA foi induzida em AB2070, uma cepa deficiente transaminase B. (fornecida da Escherichia coli Genetics Stock Center. J. Bacteriol., 109, 703, (1972), CGSC2070) e um transformante, em que a necessidade de aminoácido de cadeia ramificada foi recuperada, foi selecionada. Como um resultado da preparação de um plasmídeo da cepa, o plasmídeo abrigou um fragmento de DNA obtido pela divagem do plasmídeo pUC19 com Sall e Pstl, e um fragmento de DNA Sall-Pstl incluindo o gene ilvE, que foram ligados. O plasmídeo foi denominado pUCEl. O pUCEl inclui uma porção 3’-terminal do gene ilvM, o gene ilvE, e uma porção 5’-terminal do gene ilvD.

Uma mistura de fragmento de DNA foi preparada por parcialmente digerir o pMWGMA2 com Hinálll. Por outro lado, um fragmento de DNA Hinálll-Hinálll de 1,7 kb contendo uma porção do gene ilvE e uma porção 5’-terminal do gene ilvD foi preparado pela divagem de pUCEl com Hinálll. Usando uma mistura de DNA obtida pela ligação de ambos os fragmentos de DNA, AB1280, uma cepa deficiente desidratase de ácido di-hidróxi (produto de gene ilvD), foi transformada, e a cepa que recuperou a necessidade de aminoácido de cadeia ramificada foi selecionada dos transformantes. No plasmídeo preparado do transformante resultante, um fragmento de DNA obtido por clivagem apenas o sítio HindUI entre attGM e ilvA de pMWGMA2 com HinàWl, e um fragmento de DNA HindWl-HIndWl 1,7-kb incluindo uma porção do gene ilvE e uma porção do gene ilvD derivado do pUCEl foram ligados, e o óperon ilvGMEDA foi reconstruído. O plamídeo foi denominado pMWD5. O esquema da construção de pMWD5 é resumido na Figura 8. O plasmídeo resultante pMWD5 derivado do vetor pMW 119 abriga o óperon ilvGMEDA em que a região necessária para a atenuação é anulada. O plasmídeo pMWD5 (Apr) obtido como descrito acima é um plasmídeo contendo pMW 119 como um vetor e carregando o óperon ilvGMEDA do qual a região requerida para a atenuação foi removida. (6) Produção de plasmídeo contendo óperon ilvGMEDA e gene aspA (pMWD5-aspA) pMWI18::aspA foi digerido com Saci e HindUI, e terminado embotado para se obter um fragmento de DNA contendo aspA. O pMWD5 foi digerido com AflU, terminado embotado e inserido com o sítio de clivagem com o fragmento de DNA acima contendo aspA para obter pMWD5-aspA (Fig. 9). (7) Produção de plasmídeo contendo óperon ilvGMEDA e gene pntAB (pMWD5-THY) pMW::THY foi digerido com Smal e HindUI, e terminado embotado para se obter um fragmento de DNA contendo pntAB. O pMWD5 foi digerido com AflU, terminado embotado e inserido com o sítio de clivagem com o fragmento de DNA acima contendo pntAB para obter pMWD5-THY (Fig. 9). (8) Produção de plasmídeo contendo óperon ilvGMEDA e gene ppc (pMWD5-ppc) pppc foi digerido com Saci e Xbal, e terminado embotado para se obter um fragmento de DNA contendo ppc. O pMWD5 foi digerido com 4/711, terminado embotado e inserido com o sítio de divagem com o fragmento de DNA acima contendo ppc para obter pMWD5-ppc (Fig. 9). (9) Produção de plasmídeo contendo óperon ilvGMEDA, gene pntAB e gene ppc (pMWD5-PTS) pPTS foi digerido com Saci e Hindlll, e terminado embotado para se obter um fragmento de DNA contendo ppc e pntAB. O pMWD5 foi digerido com Aflll, terminado embotado e inserido no sítio de divagem com o fragmento de DNA acima contendo ppc e pntAB para obter pMWD5-PTS (Fig. 9). (10) Produção de plasmídeo contendo óperon ilvGMEDA, gene aspA, gene pntAB e gene ppc (pMWD5-APT) pAPT foi digerido com Saci e Hindlll, e terminado embotado para se obter um fragmento de DNA contendo ppc, pntAB e aspA. O pMWD5 foi digerido com Aflll, terminado embotado e inserido no sítio de divagem com o fragmento de DNA acima contendo ppc, pntAB e aspA para obter pMWD5-APT (Fig. 9).

Exemplo 2: Produção de aminoácidos por Escherichia coli abrigando vários plasmídeos (1) Produção de L-treonina Os vários plasmídeos obtidos no Exemplo 1 foram cada um introduzido em Escherichia coli VKPM B-3996. Estas cepas foram cultivadas sob as seguintes condições. O cultivo foi executado por 38 horas em 37°C com agitação em 114 a 116 rpm mediante o uso de um meio tendo a composição apresentada na Tabela 1. O componente A, o Componente B e o Componente C mencionados na Tabela 1 foram preparados e esterilizados separadamente, e depois eles foram esfriados e misturados em uma relação de 16/20 volume do Componente A, 4/20 volume do Componente B e 30 g/1 do Componente C. Os resultados da medição das quantidades acumuladas de L-treonina no meio são apresentados na Tabela 2. Foi observado que, nas bactérias produzindo L-treonina pertencentes ao genêro Escherichia, a produtividade da L-treonina pode ser melhorada pela intensificação da atividade THY intracelular e atividade PEPC. Ademais, foi também observado que a produtividade da L-treonina pode ser ainda melhorada pela intensificação da atividade AspA. TABELA 1: Meio de produção da treonina TABELA 2 (2) Produção de L-isoleucina Os vários plasmídeos obtidos no Exemplo 1 foram cada um introduzido em Escherichia coli VKPM B-3996. Estas cepas foram cultivadas sob as seguintes condições. O cultivo foi executado em um meio para a produção de L-isoleucina (contendo 40 g de glicose, 16 g de sulfato de amônio, 1 g de fosfato de monopotássio, 1 g de heptaidrato de sulfato de magnésio, 0,01 g de heptaidraqto de sulfato ferroso, 0,01 g de tetraidrato de cloreto de manganês, 2 g de extrato de levedura e 40 g de carbonato de cálcio em 1 L de água, pH = 7,0) em 37°C por 24 horas. A L-Isoleucina contida no meio foi quantificada por cromatografia líquida de alto desempenho. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Foi observado que, nas bactérias produzindo L-treonina pertencentes ao gênero Escherichia, a produtividade da L-isoleucina pode ser melhorada pela intensificação da atividade THY intracelular e atividade PEPC. Ademais, foi também observado que a produtividade da L-isoleucina pode ser ainda melhorada pela intensificação da atividade AspA. TABELA 3 REIVINDICAÇÕES

Claims (5)

1. Método para a produção de L-treonina ou L-isoleucina, caracterizado pelo feto de compreender o cultivo de uma Escherichici coii em um meio para produzir e acumular L-treonina ou L-isoleucina no meio, em que a Escherichia coii tem uma capacidade de produzir L-treonina ou L-isoleucina, e em que a atividade da fosfoenolpiruvato carboxilase intracelular, atividade da transi droge nase e a atividade da aspartase são intensificadas na Escherichia coii pela introdução de múltiplas cópias de um gene ou óperon codificando para cada enzima no DNA cromossoma), em que cada um do gene ou óperon é derivado de Escherichia coii, e em que cada um do gene ou óperon derivado do plasmídeo pAPT é excluído.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a atividade de uma enzima ou enzimas codificadas pelo óperon de treonina ou uma parte deste é intensificada em Escherichia coii pelo aumento do número de cópias de um gene ou óperon codificando para cada enzima, em que a Escherichia coii tem capacidade de produção da L-treonina.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o óperon de treonina consiste de ihrABC.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo feto de que a atividade de uma enzima ou enzimas codificadas pelo óperon ilv ou uma parte deste é intensificada em Escherichia coii pelo aumento do número de cópias de um gene ou óperon codificando para cada enzima, e em que a Escherichia coii tem capacidade de produção da L-isoleucina.

5. Método de acordo com qualquer urna das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo feto de que o óperon de treonina, o óperon iív c o gene codificando para aspartase são derivados de Escherichia coii.