CN116121135B - 一种谷氨酸棒杆菌突变株及其在l-异亮氨酸发酵中的应用 - Google Patents
一种谷氨酸棒杆菌突变株及其在l-异亮氨酸发酵中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌突变株及其在L‑异亮氨酸发酵中的应用。突变株为谷氨酸棒杆菌IBCL‑1(Corynebacterium glutamicum)，是以谷氨酸棒杆菌(CICC No.21756)为出发菌株，通过诱导诱变定向培养，筛选出的；是一种高产L‑异亮氨酸、副酸少的生产菌株，其于2022年05月30日保藏在中国典型培养物保藏中心。实验表明，所述突变株在发酵过程中利用硫酸铵控制渗透压的调节方式，L‑异亮氨酸产量大幅度提升，最高可达6.2％，此外，通过控制阶段控制发酵过程中的溶氧与渗透压、残糖，进而大幅度降低其他代谢途径强度，进而减少杂酸浓度，最低杂酸可降至0.15％。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵工程技术领域，特别涉及一种谷氨酸棒杆菌突变株及其在L-异亮氨酸发酵中的应用。
背景技术
L-异亮氨酸属于疏水性支链氨基酸，系统名为“α-氨基β-甲基戊酸；1936年，国外学者Rose等人对动物进行营养实验，结果显示L-异亮氨酸能促进人体新陈代谢，补充人体必备营养物质。人体正常每日需从食物中获取20mg/kg的L-异亮氨酸。如果补充不充分，人体正常的新陈代谢受到影响，营养失衡，人体免疫力下降，甚至可能引起疾病发生。L-异亮氨酸适合作为食品添加剂，保证人体获取充足的物质含量。此外，L-异亮氨酸还具有丰富的药用价值，L-异亮氨酸与L-亮氨酸、L-缬氨酸统称支链氨基酸，支链氨基酸能促进人体肌肉发育，增强肝脏免疫力，缓解疲劳，因此可以作为饮料添加剂以增强能量。氨基酸饮料能促进人体肌肉内蛋白质分解，因此很多饮料生产厂家将其融入到饮料制备中。运动员们经常饮用含有氨基酸的饮料，运动员服用后可以促进肌肉放松，更好的发挥状态。氨基酸饮料市场发展日益繁荣，获得了市场的广泛认可。具有代表的功能饮料生产品牌包括：如日本味之素公司生产的“氨基生命素”、“氨基维他水”、日本明治制草公司的“萨伯斯AMINOSPO”能量饮料等。可以推断，随着未来人们对氨基酸的理解日益深化，功能饮料的发展将在市场中拥有更加广阔的空间。
下述列举了异亮氨酸以及发酵废液(盐)重新利用相关技术的部分专利情况，可见现有技术中氨基酸发酵领域主要热点和工艺如下：
一种降低L-异亮氨酸发酵废液中铵氮含量，CN 101899482 B：该专利通过用氢氧化钠替换pH调节剂氨气，进而减少发酵废液中铵根离子的浓度，该工艺将会减少分离中铵根离子的干扰，并降低铵根成本；
一种氨基酸发酵废水二次增值利用的方法，CN 110981003 A：该专利通过利用蒙脱石粉末将发酵废液上清吸附沉淀，其上清可灌溉使用，沉淀和菌体混合制成肥料，此工艺主要创新点是，发酵废液基本全部重新利用；
一种谷氨酸生产废液的利用方法，CN 101168515 B：该专利主要续创新点是将谷氨酸发酵分离的上清液进行分离并重新利用，其中硫酸铵被回收制成化肥，未被回收的固体部分被磷酸水解后作为发酵配料，实现了资源循环利用。
一种稳定高效生产L-异亮氨酸的发酵方法，CN 113046398 A：该专利主要创新点是在发酵液中添加发酵稳定剂，稳定剂包括钴胺素、吡哆醇、氯化胆碱、叶酸，最终L-异亮氨酸产量可达48g/L。
一种生产L-异亮氨酸的发酵方法，CN 111172086A：该专利主要创新点是控制残糖在0.5g/L以下，以此来进行杂酸控制，最终L-异亮氨酸产酸可达45g/L，杂酸仅有3.5g/L。
一株产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程，CN 111321100 A：该专利主要创新点是对谷氨酸棒杆菌进行基因改造，其改造部分将L-异亮氨酸工业生产菌WM001的启动子ilvA替换为启动子tac，敲除基因alaT、brnQ，在此基础上敲除alr基因获得构建营养缺陷型系统，在该系统中回补alr基因并过表达基因ilvBN和ppnK，并且此菌株最终不用添加任何抗生素，产酸为32.1g/L。
一种安全、高效生产1，3丙二醇的方法CN 200710048122.8：该专利发明了一种通过添加NaOH进行转化甘油生产1，3-丙二醇的方法，其发酵过程中通过流加NaOH控制发酵液中的盐浓度进而进行丙二醇发酵过程；其中控制NaOH浓度，可看做一种控制盐浓度即渗透压的方法；
一种调节发酵液渗透压提高赤藓糖醇产量的方法，CN201210204534.7：该专利发明了一种调节发酵液渗透压提高赤藓糖醇产量的方法，其特征在于以假丝酵母为生产菌过程中利用KCl和NaCl并控制对应渗透进行发酵；
但是，上述现有技术均未解决目前国内L-异亮氨酸产酸低、糖酸比转化率较低并且杂酸较多等问题，对于本领域而言，亟需一种高产酸、高糖酸比、杂酸低的新技术以解决上述问题。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明涉及一种谷氨酸棒杆菌突变株及其在L-异亮氨酸发酵中的应用；其有效解决了现有技术中存在的产酸低杂酸高等技术难题，达到了高产酸、高转化率、低杂酸的有益效果。
首先，本申请所述的谷氨酸棒杆菌突变株为谷氨酸棒杆菌IBCL-1(Corynebacterium glutamicum)，保藏编号为CCTCC NO:M 2022764。
进一步的，所述的谷氨酸棒杆菌IBCL-1(Corynebacterium glutamicum)是以谷氨酸棒杆菌(CICC No.21756)为出发菌株，通过诱导诱变定向培养，筛选出的，是一种高产L-异亮氨酸、副酸少的生产菌株—其于2022年05月30日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：中国，武汉，武汉大学。
本发明提供了含有所述谷氨酸棒杆菌IBCL-1(Corynebacterium glutamicum)的菌群，还提供了含有所述谷氨酸棒杆菌IBCL-1或所述菌群的菌剂。
如下I)～III)所示在L-异亮氨酸发酵中的应用：
I)、所述的谷氨酸棒杆菌IBCL-1(Corynebacterium glutamicum)或其培养物和/或提取物；II)、所述的菌群；III)、所述的菌剂。
另外一方面，本申请还公开了所述的谷氨酸棒杆菌突变株在L-异亮氨酸发酵中的应用；具体是一种新型L-异亮氨酸发酵方法，该方法通过条件优化，获得一种依靠渗透压阶段控制的发酵工艺，大大提高了L-异亮氨酸的产量同时降低了杂酸；
进一步的，本发明采用了硫酸铵稀释液控制渗透压，硫酸铵不仅为发酵过程中提供一定的无机氮，而且影响了整个发酵液的渗透压，进而调控了L-异亮氨酸的关键酶活性增加产量，降低杂酸合成；
进一步的，所述的谷氨酸棒杆菌突变株发酵生产L-异亮氨酸的方法，包括如下步骤：
(1)将L-异亮氨酸生产菌IBCL-1经过种子培养并接种至发酵罐中，发酵温度30-34℃，初始pH6.8-7.0，溶氧5-25％，待发酵液中菌种OD562生长至40-45时，pH调至7.0-7.2；待发酵液残糖降至6-7％时，通过流加无机盐补料液控制发酵液渗透压在500-900mosm/L；
(2)待残糖低于1-4％时，通过流加补料糖液控制发酵液的残糖维持在1-4％，同时继续流加无机盐补料液或发酵废液，控制发酵液的渗透压在700-1000mosm/L，糖耗完发酵结束，测得产酸5.4-6.2wt％，糖酸转化率28-33％，杂酸含量0.15-0.4wt％。
对于上文所述的技术方案而言，进一步地，所述的发酵废液为：将步骤(2)获得的L-异亮氨酸发酵液灭菌后，过滤去除菌体，上清液加硫酸调pH至4.0-4.5并脱色，再加入氨水调pH至6.0-6.5，浓缩、过滤、去除下层结晶，取上清液、过滤杂质制得。本发明利用发酵分离后收集的废液(此废液中富含高浓度的硫酸铵，即发酵废液)，进而将其用做发酵过程中渗透压控制液，大大节省了发酵成本。
对于上文所述的技术方案而言，进一步地，所述的无机盐补料液为5-20wt％的硫酸铵；更优选8-12wt％的硫酸铵；
对于上文所述的技术方案而言，进一步地，所述的步骤(1)中控制发酵液渗透压为650-750mosm/L，溶氧9-11％；
对于上文所述的技术方案而言，进一步地，所述的步骤(2)中控制发酵液渗透压为850-950mosm/L，残糖0.8-1.2％；
对于上文所述的技术方案而言，进一步地，所述的步骤(2)中控制残糖的补料糖液为38-42wt％葡萄糖、磷酸二氢钾0.08-0.12wt％，硫酸镁0.04-0.06wt％；
对于上文所述的技术方案而言，进一步地，所述的步骤(1)中将L-异亮氨酸生产菌IBCL-1经过逐级扩大接种体积的过程中的培养基包括：
一级种子培养基：葡萄糖3-5wt％，玉米浆干粉1.0-1.2wt％，硫酸铵0.5-1.0wt％，KH2PO40.1-0.13wt％，MgSO4·7H2O 0.05-0.07wt％，碳酸钙0.5-1.0wt％，pH7.0-7.2；
二级种子罐培养基：葡萄糖3-5wt％，玉米浆干粉1.0-1.2wt％，硫酸铵0.5-1.0wt％，KH2PO40.1-0.13wt％，MgSO4·7H2O 0.05-0.07wt％，pH6.8-7.2；
标准发酵罐发酵初始培养基：葡萄糖12-15wt％，玉米浆干粉0.8-1.2wt％，硫酸铵0.5-1.0wt％，磷酸二氢钾0.1-0.13wt％，硫酸镁0.05-0.07wt％，pH6.8-7.2。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明通过筛选优化，获得一株L-异亮氨酸高产菌株，其产酸高，杂酸少；
2.在微生物培养中，渗透压不仅仅影响菌种的生长，并且在研究发现中，渗透压还影响菌种代谢糖的能力以及其他代谢途径中关键酶的活性，因此本发明采取了发酵过程中利用硫酸铵控制渗透压的调节方式，L-异亮氨酸产量大幅度提升，最高可达6.2％，为国内领先水平；
3.本发明通过控制阶段控制发酵过程中的溶氧与渗透压、残糖，进而大幅度降低其他代谢途径强度，进而减少杂酸浓度，最低杂酸可降至0.15％；
4.本发明在渗透压控制时，采取10％硫酸铵溶液进行控制，主要原因是在分离阶段，需要添加硫酸和氨水进行pH调节，从而产生了大量的硫酸铵，因此在发酵阶段使用高浓度的硫酸铵废液进行发酵使用，可以很好的解决硫酸铵废盐问题，从而达到了硫酸铵的循环使用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但应当理解本发明的保护范围并不受实施例的限制。
本发明中，除非另有其他明确说明，否则百分比、百分含量均以质量计。如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
L-异亮氨酸且副酸少的生产菌株IBCL-1，于2022年05月30日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M 2022764。
一、谷氨酸棒杆菌的特性
以L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌(CICC No.21756)为出发菌株，通过诱变筛选的得到高产L-异亮氨酸且副酸少的生产菌株——谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)IBCL-1(CCTCC NO：M 2022764)；AHV(a-氨基-β-羟基戊酸)、Eth(乙硫氨酸)、异亮氨酸氧肟酸抗性；蛋氨酸缺陷型；L-亮氨酸不完全缺陷型。
1.培养基组成如下：
完全培养基(CM)：葡萄糖0.5wt％，牛肉膏1wt％，蛋白胨1wt％，酵母膏0.5wt％，氯化钠0.5wt％，pH7.0-7.2；
基本培养基(MM)：葡萄糖3wt％，硫酸铵0.5wt％，KH2PO40.1wt％，MgSO4·7H2O0.05wt％，pH7.0-7.2；
补充培养基(SM)：在基本培养基(MM)中加入氨基酸的结构类似物，pH7.0；氨基酸的结构类似物包括α-氨基-β-羟基戊酸、乙硫氨酸、L-异亮氨酸氧肟酸；
种子培养基：葡萄糖3wt％，玉米浆干粉1.0wt％，硫酸铵0.5wt％，KH2PO40.1wt％，MgSO4·7H2O 0.05wt％，碳酸钙1.0wt％，pH7.0-7.2；分装1000毫升/5000毫升；灭菌条件121℃/20min；
摇瓶发酵培养基：葡萄糖14wt％，玉米浆干粉1.1wt％，硫酸铵1wt％，KH2PO40.1wt％，MgSO4·7H2O 0.05wt％，碳酸钙1wt％；分装25毫升/100毫升；灭菌条件121℃/20min；
2.选育过程如下：
(1)诱变前处理：
取一环活化的菌种接入装有25mL液态完全培养基的锥形瓶中，置于30℃、85rpm的往复式摇床中振荡培养12h。再取1mL培养液接入另一盛有25mL液态完全培养基的锥形瓶中，置于30℃、85rpm的往复式摇床中振荡4h，使细胞处于对数生长期。
(2)菌悬液的制备
取10mL培养液于无菌离心管中，5000rpm离心10min，弃去上清液，采用生理盐水重悬细胞后倒入锥形瓶中，振荡10min，调整细胞浓度为5*108个/mL。
(3)紫外诱变
取制备好的菌悬液于紫外光下诱变一定时间，并取样稀释涂布平板培养后计算致死率。采用饥饿培养和青霉素法淘汰野生型、浓缩缺陷型，通过影音培养法检出缺陷型，并验证发酵产酸能力。
(3)硫酸二乙酯诱变
取制备好的菌悬液加入0.5wt％硫酸二乙酯(DES)，30℃振荡处理20min，中止处理后涂布于筛选培养基SM平板上，31℃静止培养4-6天。挑选在SM上生长的突变株单菌落转接至分别添加α-氨基-β-羟基戊酸、乙硫氨酸、L-异亮氨酸氧肟酸MM平板上，31℃静止培养24小时后进入摇瓶复筛。
(4)摇瓶复筛
接一环突变株于摇瓶发酵培养基中，30℃、110rpm振荡培养72小时，然后用高效液相法检测突变株发酵液中积累的L-异亮氨酸，在所有突变株中产L-亮氨酸最高的菌株为IBCL-1。
(5)摇瓶培养工艺：
制备摇瓶种子液：取一环谷氨酸棒杆菌突变株IBCL-1接种于种子培养基中，30℃，90rpm培养16h，此时OD562约在20左右，备用；
按照8％(V/V)将摇瓶种子接种至摇瓶发酵培养基中，30℃，120rpm培养72h，使用高效液相色谱检测L-异亮氨酸产量，原始菌CICC No.21756产量为1g/L，突变株IBCL-1产量为33.2g/L，杂酸0.15％，比原始菌株提高33.2倍；可见突变菌株相比原始菌株具备更强的产酸能力具备更加优异的L-异亮氨酸生产能力，并且其杂酸比较少。
实施例1利用渗透压控制进行Ile发酵的方法
1.种子培养基组成如下：
一级种子培养基：
葡萄糖3wt％，玉米浆干粉1.0wt％，硫酸铵0.5wt％，KH2PO40.1wt％，MgSO4·7H2O0.05wt％，碳酸钙1.0wt％，pH6.7-7.2；分装500毫升/5000毫升；灭菌条件121℃/20min；
二级种子罐培养基：
葡萄糖5wt％，玉米浆干粉1.0wt％，硫酸铵0.5wt％，KH2PO40.1wt％，MgSO4·7H2O0.05wt％，pH6.8-7.2；灭菌条件121℃/20min；
2.发酵培养基如下：
标准发酵罐发酵初始培养基：葡萄糖12wt％，玉米浆干粉0.8wt％，硫酸铵0.5wt％，磷酸二氢钾0.1wt％，硫酸镁0.05wt％；
补料糖液：40wt％葡萄糖、磷酸二氢钾0.1wt％，硫酸镁0.05wt％；
无机盐补料液：硫酸铵10wt％；
发酵废液：发酵分离获得的分离废液，富含大量硫酸铵，约10-12wt％；3.发酵罐工艺
步骤1：
将一环L-异亮氨酸生产菌IBCL-1接入摇瓶的一级种子培养基中，30℃，90rpm，振荡培养16h后，得到摇瓶种子液500mL，一级成熟标志：OD562为0.6-0.7*25。
步骤2：
将摇瓶种子液以1％(V/V)比例接入50L的二级种子罐培养基中，30℃90rpm，pH6.8，溶氧不低于10％，进行发酵培养，种子罐培养16h后，二级成熟标志：OD562为0.7-0.8*25；得到二级种子液；
步骤3：
(1)将二级种子液10％接种至500L发酵罐的标准发酵罐发酵初始培养基中，初始发酵温度30℃，pH6.8，发酵过程中不断调整通气与转速控制溶氧在10％左右，待发酵液中菌种OD562生长至40左右，pH调至7.0左右；待发酵液残糖降至6wt％时，开始通过流加无机盐补料液控制其发酵液渗透压在700mosm/L左右；
(2)残糖低于1wt％时，通过流加补料糖液控制发酵液的残糖在1.0wt％左右，同时继续流加无机盐补料液控制其发酵液渗透压在900mosm/L左右，糖耗完发酵结束，下罐产酸6.2wt％，糖酸转化率32.6％，杂酸含量0.15wt％。
实施例2
在实施例1的基础上：将渗透压控制进行调整；
改变步骤3(1)待发酵液残糖降至6wt％时，开始通过流加无机盐补料液控制其发酵液渗透压在500-900mosm/L左右；
其他参数不变；糖耗完发酵结束，下罐产酸如下表
实施例3
在实施例1的基础上：将渗透压控制进行改变；
改变步骤3(2)残糖低于1.5wt％时，通过流加补料糖液控制发酵液的残糖在1.5％左右，同时控制其发酵液渗透压在700-1000mosm/L；
其他参数不变；糖耗完发酵结束，下罐产酸如下表
实施例4
在实施例1的基础上：
改变步骤3(2)残糖低于2-4wt％时，通过流加补料糖液控制发酵液的残糖在2-4wt％左右，同时继续流加无机盐补料液控制其发酵液渗透压在900mosm/L左右；
其他参数不变；糖耗完发酵结束，下罐产酸如下表
实施例5
在实施例1的基础上：将溶氧控制进行调整
步骤3(1)过程中不断调整通气与转速控制溶氧在5％和20％左右，待发酵液中菌种OD562生长至45，pH调至7.2左右；
其他参数不变；糖耗完发酵结束，下罐产酸如下表
实施例6
将实施例1获得的L-异亮氨酸发酵液灭菌后，经过陶滤去除菌体，上清液加入浓硫酸调pH至4.0并经过活性炭脱色，再加入氨水调pH至6.0(由于前面加入硫酸，因此上清液中含有大量的硫酸根和铵根离子)，蒸发浓缩至原体积的1/8，过滤后冷却结晶，下层结晶为L-异亮氨酸粗品，上清液板框过滤去除杂质，获取发酵废液，通过硫酸根离子检测以及铵根离子检测，将发酵废液中的硫酸铵进行折算，硫酸铵含量约在12wt％，加水稀释至10wt％并重新利用到发酵后期(指实施例1中步骤3的(1)(2)中)，作为无机盐补料加到发酵液中以控制渗透压；
发酵初始条件不变，改变步骤3(1)待残糖低于7％时，流加发酵废液控制渗透压在600mosm/L左右；
且改变步骤3(2)的残糖，当其低于2.0wt％时，通过流加补料糖液控制发酵液的残糖在2.0wt％左右，同时继续流加发酵废液控制其发酵液渗透压在800mosm/L左右，糖耗完发酵结束，产酸5.95wt％，糖酸比31.3％，杂酸0.25wt％。
对比例1–不同残糖浓度控制
在实施例1的其他参数都不变的基础上，控制步骤3(2)中的残糖，通过流加补料糖液控制发酵液的残糖在下表中的范围，糖耗完发酵结束；
结果如下：
对比例2–不同渗透压控制下
在实施例1的其他参数都不变的基础上，改变步骤3(1)(2)中渗透压控制，不采取分段控制的方式，而将3(1)(2)中渗透压同时控制在1100或者1300mosm/L，糖耗完发酵结束；
结果如下：
对比例3–不同溶氧控制条件
在实施例1的其他参数都不变的基础上，将步骤3溶氧控制在下表中的范围，结果如下：
对比例4：谷氨酸棒杆菌(CICC No.21756)的50L发酵工艺
在实施例1的其他参数都不变的基础上，将步骤1的发酵菌体替换异亮氨酸生产菌CICC No.21756，经对比可知，糖耗完发酵结束，产酸2.2g/L，本实验证明定向筛选的新菌相比原始菌株已经具有较大的产酸优势。
对比例5：渗透压不控制
实施例1，省略步骤3(1)中的下述步骤——待发酵液残糖降至6wt％时，开始通过流加无机盐补料液控制其发酵液渗透压在700mosm/L左右；
其他参数都不变的基础上，发酵结束，产酸3.9wt％，糖酸比20.5％，杂酸1.1wt％。
对比例6：以硫酸钠进行中后期渗透压控制
在实施例1的其他参数都不变的基础上，对步骤3中“流加无机盐补料液”改为继续流加10％硫酸钠溶液控制其发酵液渗透压；糖耗完发酵结束，其产酸4.9wt％，糖酸转化率28.4％，杂酸含量0.25wt％。
硫酸铵不仅作为一种渗透压控制体系还可以作为一种无机氮供体，采取硫酸铵进行补料进行渗透压控制要明显好于硫酸钠，因此本发明中采用了硫酸铵作为渗透压控制盐。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.谷氨酸棒杆菌IBCL-1(Corynebacterium glutamicum)，保藏编号为CCTCCNO:M2022764。
2.包括权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌IBCL-1(Corynebacterium glutamicum)的菌剂。
3.如下I)～II)所示在L-异亮氨酸发酵中的应用：
I)、权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌IBCL-1(Corynebacterium glutamicum)；
II)、权利要求2所述的菌剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用包括如下步骤：
(1)将L-异亮氨酸生产用的谷氨酸棒杆菌IBCL-1(Corynebacterium glutamicum)经过种子培养并接种至发酵罐中，发酵温度30-34℃，初始pH6.8-7.0，溶氧5-25％，待发酵液中菌种OD562生长至40-45时，pH调至7.0-7.2；待发酵液残糖降至6-7％时，通过流加无机盐补料液控制发酵液渗透压在500-900mosm/L；
(2)待残糖低于1-4％时，通过流加补料糖液控制发酵液的残糖维持在1-4％，同时继续流加无机盐补料液或发酵废液，控制发酵液的渗透压在700-1000mosm/L，糖耗完发酵结束。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的发酵废液为：将步骤(2)获得的L-异亮氨酸发酵液灭菌后，过滤去除菌体，上清液加硫酸调pH至4.0-4.5并脱色，再加入氨水调pH至6.0-6.5，浓缩、过滤、去除下层结晶，取上清液、过滤杂质制得。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的无机盐补料液为5-20wt％的硫酸铵。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的无机盐补料液为8-12wt％的硫酸铵。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的步骤(1)中控制发酵液渗透压为650-750mosm/L，溶氧9-11％；所述的步骤(2)中控制发酵液渗透压为850-950mosm/L，残糖0.8-1.2％。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的步骤(2)中控制残糖的补料糖液为38-42wt％葡萄糖、磷酸二氢钾0.08-0.12wt％，硫酸镁0.04-0.06wt％。
10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的步骤(1)中将谷氨酸棒杆菌IBCL-1(Corynebacterium glutamicum)经过逐级扩大接种体积的过程中的培养基包括：
一级种子培养基：葡萄糖3-5wt％，玉米浆干粉1.0-1.2wt％，硫酸铵0.5-1.0wt％，KH2PO4 0.1-0.13wt％，MgSO4·7H2O 0.05-0.07wt％，碳酸钙0.5-1.0wt％，pH7.0-7.2；
二级种子罐培养基：葡萄糖3-5wt％，玉米浆干粉1.0-1.2wt％，硫酸铵0.5-1.0wt％，KH2PO4 0.1-0.13wt％，MgSO4·7H2O 0.05-0.07wt％，pH6.8-7.2；
标准发酵罐发酵初始培养基：葡萄糖12-15wt％，玉米浆干粉0.8-1.2wt％，硫酸铵0.5-1.0wt％，磷酸二氢钾0.1-0.13wt％，硫酸镁0.05-0.07wt％。
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