KR20220072781A - 헤모필루스 인플루엔자 타입 b의 PRP 항원 정제 공정의 품질 평가 방법 - Google Patents

헤모필루스 인플루엔자 타입 b의 PRP 항원 정제 공정의 품질 평가 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헤모필루스 인플루엔자 타입 b(Hib)의 PRP 항원 정제 공정의 품질 평가 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, Hib의 PRP 정제 공정 단계에서 조(crude) PRP의 분자량 또는 원말 PRP의 분자량을 측정함으로써, 최종적으로 생산되는 Hib PRP 제품의 품질을 평가하고 미리 예측할 수 있다.

Description

헤모필루스 인플루엔자 타입 b의 PRP 항원 정제 공정의 품질 평가 방법{Method of Quality Evaluation for Purification Process of PRP Antigen of Haemophilus Influenza Type b}
본 발명은 헤모필루스 인플루엔자 타입 b(Hib)의 폴리리보실 리비톨 포스페이트(polyribosyl ribitol phosphate, PRP) 항원 정제 공정의 품질 평가 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 헤모필루스 인플루엔자 타입 b의 백신 제조의 원료가 되는 폴리리보실 리비톨 포스페이트(PRP)의 정제 공정에서의 품질 평가 방법에 관한 것이다.
헤모필루스 인플루엔자 타입 b (Haemophilus Influenza Type b, Hib)는 소아에게서 수막염, 균혈증, 후두개염, 폐렴, 화농성 관절염 등 침습성 및 국소성 세균 감염을 일으키는 주요 원인균이다. 헤모필루스 인플루엔자 타입 b(Hib)의 폴리리보실 리비톨 포스페이트(polyribosyl ribitol phosphate, PRP)는 Hib의 피막을 구성하는 주요 다당류 성분이다. 헤모필루스 인플루엔자 타입 b(Hib)의 피막의 다당류 캡슐은 주요한 독성 인자(virulence factor)가 된다.
PRP에 대한 항체는 혈청에서 감염된 Hib를 살균하여 억제하는데 주요한 기여자가 된다. PRP 단독으로도 백신 성분으로 이용될 뿐만 아니라, PRP를 T-세포 의존적 단백질 항원과 공유결합시킨 접합 백신으로도 이용되고 있다.
Hib의 PRP는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b를 배양하여 이를 정제하는 공정을 거쳐 최종 원말 형태로 제조하고 있으나, 최종 제품에서 품질 이슈가 발생한 경우 생산된 배치(batch)를 전량 폐기해야 하므로 비용상 손실이 크다는 문제가 있다. 현재까지 Hib의 PRP를 정제하는 공정 단계에서, 최종적으로 생산되는 PRP 제품의 품질을 미리 평가하고 예측할 수 있는 IPC (In Process Control)방법이 개발되어 있지 않다.
미국등록특허 제4,220,717호
본 발명자들은 Hib의 PRP를 제조하는 공정 단계에서, 최종적으로 생산되는 Hib의 PRP 제품의 품질을 미리 평가하고 예측할 수 있는 IPC (In Process Control) 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, Hib의 PRP 정제 공정에서 중간 산물인 조(crude) PRP 분자량 데이터 또는 최종 산물인 원말의 원말 PRP 분자량 데이터와, 최종 산물의 원말 PRP의 분자량 분포 데이터를 이용한 회귀 분석을 통해, 정제되는 PRP의 품질을 미리 평가하고 예측할 수 있음을 증명하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 Hib의 PRP를 정제하여 원말 PRP를 제조하는 공정에서 최종 원말 PRP의 품질을 평가하는 방법을 제공하는 것에 있다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위해,
본 발명의 일 측면은, 다음의 단계를 포함하는 Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법을 제공한다:
(a) 헤모필루스 인플루엔자 타입 b (Haemophilus influenzae type b, Hib)를 배양한 배양액으로부터 폴리리보실 리비톨 포스페이트 (polyribosyl ribitol phosphate, PRP)를 정제하는 공정 중에서 조(crude) PRP를 포함하는 샘플을 채취하는 단계;
(b) 채취한 샘플 내의 조 PRP의 분자량을 측정하는 단계;
(c) PRP를 최종 정제한 원말에서 원말 PRP의 분자량 분포를 측정하는 단계;
(d) 단계 (b)에서 측정한 조 PRP의 분자량 데이터와, 단계 (c)에서 측정한 원말 PRP의 분자량 분포 데이터를 사용하여, 조 PRP 분자량과 원말 PRP 분자량 분포 간의 회귀 분석(regression analysis)을 수행하는 단계; 및
(e) 회귀 분석으로부터 특정 수준 이상의 원말 PRP 분자량 분포를 만족하는 조 PRP 분자량을 산출하는 단계.
본 발명의 다른 측면은, 다음의 단계를 포함하는 Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법을 제공한다:
(a') 헤모필루스 인플루엔자 타입 b (Haemophilus influenzae type b, Hib)를 배양한 배양액으로부터 폴리리보실 리비톨 포스페이트 (polyribosyl ribitol phosphate, PRP)를 정제하여 얻은 최종 정제 원말에서, 원말 PRP의 분자량 및 분자량 분포를 측정하는 단계;
(b') 단계 (a')에서 측정한 원말 PRP의 분자량 데이터와 원말 PRP의 분자량 분포 데이터를 사용하여, 원말 PRP 분자량과 원말 PRP 분자량 분포 간의 회귀 분석(regression analysis)을 수행하는 단계; 및
(c') 회귀 분석으로부터 특정 수준 이상의 원말 PRP 분자량 분포를 만족하는 원말 PRP 분자량을 산출하는 단계.
이하, 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 이때, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명의 일 측면은 다음의 단계를 포함하는 Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법을 제공한다:
(a) 헤모필루스 인플루엔자 타입 b (Haemophilus influenzae type b, Hib)를 배양한 배양액으로부터 폴리리보실 리비톨 포스페이트 (polyribosyl ribitol phosphate, PRP)를 정제하는 공정 중에서 조(crude) PRP를 포함하는 샘플을 채취하는 단계;
(b) 채취한 샘플 내의 조 PRP의 분자량을 측정하는 단계;
(c) PRP를 최종 정제한 원말에서 원말 PRP의 분자량 분포를 측정하는 단계;
(d) 단계 (b)에서 측정한 조 PRP의 분자량 데이터와, 단계 (c)에서 측정한 원말 PRP의 분자량 분포 데이터를 사용하여, 조 PRP 분자량과 원말 PRP 분자량 분포 간의 회귀 분석(regression analysis)을 수행하는 단계; 및
(e) 회귀 분석으로부터 특정 수준 이상의 원말 PRP 분자량 분포를 만족하는 조 PRP 분자량을 산출하는 단계.
본 발명의 상기 단계 (a)의 Hib의 조 PRP를 포함하는 샘플의 채취는 Hib를 배양한 배양물로부터 PRP를 정제하는 정제 공정 중간 단계에서 이루어질 수 있다. 상기 용어 "조 PRP"는 PRP 정제 공정 중의 중간산물로 정제가 완료되지 않은 PRP를 의미한다. 상기 Hib의 PRP를 정제하는 공정은 에탄올(EtOH)를 처리하는 공정, 또는 규조토를 처리하는 공정을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (b)에서 채취한 샘플내의 조 PRP의 분자량의 측정은 조 PRP를 포함하는 샘플에 대해 크로마토그래피(chromatography) 방법을 사용하여 행할 수 있다. 상기 크로마토그래피 방법은 컬럼을 사용하는 액체 크로마토그래피 방법일 수 있으며, 예를 들어 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 본 발명의 단계 (b)에서 채취한 샘플내의 조 PRP의 분자량의 측정은 크로마토그래피 방법에 더해, 자외선 흡광도 검출 방법 또는 광산란 검출 방법을 더 포함하여 행할 수 있으며, 구체적으로 다각도 광 산란(Multi-Angle Light Scattering, MALS) 검출 방법을 더 포함하여 행할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 단계 (b)에서 채취한 샘플내의 조 PRP의 분자량의 측정은 상술한 크로마토그래피 방법에 자외선 흡광도 검출 방법 또는 광산란 검출 방법을 결합하여 행할 수 있고, 구체적으로는 역상 크로마토그래피 방법 및 다각도 광 산란 검출 방법을 결합하여 행할 수 있다.
상기 단계 (c)에서 PRP를 최종 정제한 원말에서 원말 PRP의 분자량 분포를 측정한다. 상기 용어 "원말 PRP"는 최종 정제한 원말에 포함되어 있는 PRP를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "분자량 분포(molecular weight distribution)"는 다양한 분자량을 갖는 고분자의 분자량이 분포된 정도 또는 모양을 의미한다. 상기 분자량 분포는 수 분포곡선, 중량 분포곡선, 또는 누적 분포곡선으로 표현될 수 있으며, 다분산지수(PDI, poly dispersity index)으로도 표현될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 원말 PRP의 분자량 분포 측정은 원말 PRP를 포함하는 샘플에 대한 크로마토그래피 분석 방법을 이용하여 행할 수 있다. 상기 크로마토그래피 분석 방법은 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 또는 겔 침투 크로마토그래피(gel permeation chromatography)일 수 있다. 상기 크로마토그래피 방법을 이용한 원말 PRP의 분자량 분포 측정시에 분자량을 알고 있는 하나 이상의 표준 물질을 사용할 수 있다.
상기 단계 (d)에서는, 상기 단계 (b)에서 측정된 조 PRP의 분자량 데이터와, 상기 단계 (c)에서 측정한 원말 PRP의 분자량 분포 데이터를 사용하여, 상기 조 PRP 분자량과 상기 원말 PRP 분자량 분포 간의 회귀 분석(regression analysis)을 수행한다.
일 구현예에서, 상기 회귀 분석은 단계 (b)에서 측정된 조 PRP의 분자량과, 단계 (c)에서 측정한 원말 PRP의 분자량 분포를 각각의 변수로 정하고, 상기 두개의 변수간의 선형 회귀(linear regression) 분석을 행하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 회귀 분석은 최소제곱법(least square method)를 통해 수행할 수 있다.
상기 회귀 분석을 통해 조 PRP의 분자량과 원말 PRP의 분자량 분포를 각각 변수로 갖는 회귀 방정식이 유도될 수 있다.
상기 단계 (e)에서는 상기 회귀 분석으로부터 특정 수준 이상의 원말 PRP의 분자량 분포를 만족하는 조 PRP 분자량을 산출한다.
단계 (e)에서 상기 원말 PRP의 분자량 분포의 특정 수준 이상의 값은 최종 정제된 PRP의 제품 품질 관리(quality control) 지침에 따라 적절한 값으로 설정될 수 있으며, 어느 특정 값으로 한정되지 않는다.
구체적인 일 구현예에서, 2가지의 표준 물질과 크기배제 크로마토그래피를 이용한 원말 PRP 분자량 분포 분석에서, 상기 2가지 표준 물질의 머무름 시간(retension time), 분배계수 및 원말 PRP의 크기배제 크로마토그래피 크기별 분획 피크 데이터를 이용하여 원말 PRP의 분자량 분포를 분석할 수 있다.
구체적인 일 구현예에서, 상기 원말 PRP의 분자량 분포 값은 50% 이상의 값으로 설정될 수 있다.
상기 특정 수준 이상의 원말 PRP의 분자량 분포를 만족하는 조 PRP의 분자량 값은, 원말 PRP의 분자량 분포와 조 PRP 분자량을 변수로 갖는 상술한 회귀 방정식에 의해 산출될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 (e)이후에, Hib의 PRP의 정제 공정에서 얻어지는 조 PRP의 분자량 값과, 상기 단계 (e)에서 산출된 조 PRP의 분자량 값을 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 특정 수준 이상의 원말 PRP의 분자량 분포를 만족하는, 상기 산출된 조 PRP의 분자량은 다음과 같이 IPC (In Process Control)에 활용될 수 있다: PRP 원말에서 특정 수준 이상의 분자량 분포를 갖는 원말 PRP를 생산하기 위해서는, PRP 정제 공정 중간 단계에서 채취한 샘플 중의 조 PRP의 분자량이, 상기 회귀 분석에 의해 산출된 조 PRP 분자량 값을 가져야 한다. 따라서, PRP 정제 공정 중에서 채취한 샘플 중의 조 PRP의 분자량이 상기 산출된 조 PRP 분자량 값을 갖는지를 모니터링하여 PRP 생산의 IPC(In Process Control)에 활용할 수 있다.
본 출원의 다른 측면은 다음의 단계를 포함하는 Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법을 제공한다:
(a') 헤모필루스 인플루엔자 타입 b (Haemophilus influenzae type b, Hib)를 배양한 배양액으로부터 폴리리보실 리비톨 포스페이트 (polyribosyl ribitol phosphate, PRP)를 정제하여 얻은 최종 정제 원말에서, 원말 PRP의 분자량 및 원말 PRP의 분자량 분포를 측정하는 단계;
(b') 단계 (a')에서 측정한 원말 PRP의 분자량 데이터와 원말 PRP의 분자량 분포 데이터를 사용하여, 원말 PRP 분자량과 원말 PRP 분자량 분포 간의 회귀 분석(regression analysis)을 수행하는 단계; 및
(c') 회귀 분석으로부터 특정 수준 이상의 원말 PRP 분자량 분포를 만족하는 원말 PRP 분자량을 산출하는 단계.
상기 단계 (a')에서 원말 PRP의 분자량을 측정한다.
일 구현예에서, 단계 (a')에서 원말 PRP의 분자량의 측정은 원말 PRP를 포함하는 샘플에 대해 크로마토그래피(chromatography) 방법을 통해 행할 수 있으며, 상기 크로마토그래피 방법은 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 단계 (a')에서 원말 PRP의 분자량의 측정은 상기 크로마토그래피 방법에 더해, 자외선 흡광도 검출 방법 또는 광산란 검출 방법을 더 포함하여 행할 수 있으며, 구체적으로 다각도 광 산란 검출(Multi-Angle Light Scattering, MALS) 방법을 더 포함하여 행할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 단계 (a')에서 원말 PRP의 분자량의 측정은 상술한 크로마토그래피 방법에, 자외선 흡광도 검출 방법 또는 다각도 광 산란 검출 방법을 결합하여 행할 수 있으며, 구체적으로 역상 크로마토그래피 방법 및 다각도 광 산란 검출 방법을 결합하여 행할 수 있다.
상기 단계 (a')에서 원말 PRP의 분자량 분포를 측정한다.
용어 "분자량 분포"에 대한 내용은 상술한 본 발명의 일 측면에서 설명된 것과 동일하므로, 중복하여 기재하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명의 원말 PRP의 분자량 분포 측정은 원말 PRP를 포함하는 샘플에 대한 크로마토그래피 분석 방법을 이용하여 행할 수 있다. 상기 크로마토그래피 방법은 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 또는 겔 침투 크로마토그래피(gel permeation chromatography)일 수 있다. 상기 크로마토그래피 방법을 이용한 원말 PRP의 분자량 분포 측정시에 분자량을 알고 있는 하나 이상의 표준 물질을 사용할 수 있다.
상기 단계 (b')에서는, 상기 단계 (a')에서 측정된 원말 PRP의 분자량 데이터와, 원말 PRP의 분자량 분포 데이터를 사용하여, 상기 원말 PRP의 분자량과 원말 PRP의 분자량 분포 간의 회귀 분석(regression analysis)을 수행한다.
일 구현예에서, 상기 회귀 분석은 단계 (a')에서 측정된 원말 PRP의 분자량과, 원말 PRP의 분자량 분포를 각각의 변수로 정하고, 상기 두개의 변수간의 선형 회귀(linear regression) 분석을 행하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 회귀 분석은 최소제곱법(least square method)를 통해 수행할 수 있다. 상기 회귀 분석을 통해 원말 PRP의 분자량과 원말 PRP의 분자량 분포를 각각 변수로 갖는 회귀 방정식이 유도될 수 있다.
상기 단계 (c')에서는 상기 회귀 분석으로부터 특정 수준 이상의 원말 PRP의 분자량 분포를 만족하는 원말 PRP의 분자량을 산출한다.
단계 (c')에서 상기 원말 PRP의 분자량 분포의 특정 수준 이상의 값은 최종 정제된 PRP의 제품 품질 관리(quality control) 지침에 따라 적절한 값으로 설정될 수 있으며, 어느 특정 값으로 한정되지 않는다.
구체적인 일 구현예에서, 2가지의 표준 물질과 크기배제 크로마토그래피를 이용한 원말 PRP 분자량 분포 분석에서, 상기 2가지 표준 물질의 머무름 시간(retension time), 분배계수 및 원말 PRP의 크기배제 크로마토그래피 크기별 분획 피크 데이터를 이용하여 원말 PRP의 분자량 분포를 분석할 수 있다.
구체적인 일 구현예에서, 상기 원말 PRP의 분자량 분포 값은 50% 이상의 값으로 설정될 수 있다.
상기 특정 수준 이상의 원말 PRP의 분자량 분포를 만족하는 원말 PRP의 분자량은, 원말 PRP의 분자량과 원말 PRP의 분자량 분포를 변수로 갖는 상술한 회귀 방정식에 의해 산출될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 (c') 이후에, Hib의 PRP의 정제 공정에서 얻어지는 원말 PRP의 분자량 값과, 상기 단계 (c')에서 산출된 원말 PRP의 분자량 값을 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 특정 수준 이상의 원말 PRP의 분자량 분포를 만족하는, 상기 산출된 원말 PRP의 분자량은 다음과 같이 IPC (In Process Control)에 활용될 수 있다: PRP 원말에서 특정 수준 이상의 분자량 분포를 갖는 원말 PRP를 생산하기 위해서는, PRP 정제 최종 산물인 원말에서 원말 PRP의 분자량이, 상기 회귀 분석에 의해 산출된 원말 PRP 분자량 값을 가져야 한다. 따라서, PRP 정제 최종 산물에서 원말 PRP의 분자량이 상기 산출된 원말 PRP 분자량 값을 갖는지를 모니터링하여 PRP 생산의 IPC(In Process Control)에 활용할 수 있다.
상술된 본 발명의 방법에 따라 산출된 조 PRP의 분자량 값 및 원말 PRP의 분자량 값은 각각 단독으로 또는 서로 조합하여 본 발명의 PRP의 품질 평가 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 PRP 품질 평가 방법에 따르면, Hib의 PRP 정제 공정 단계에서 회귀분석을 통해 조 PRP의 분자량 값 또는 원말 PRP의 분자량 값을 측정함으로써, 최종적으로 생산되는 Hib PRP 제품의 품질을 평가하고 미리 예측할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 Hib PRP 원말의 정제 공정 중간 단계에서 IPC (In Process Control) 방법으로 적용할 수 있으며, 실제 공정에서 발생하는 품질 이슈 시점을 확인하는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 배치(batch) 1 내지 배치(batch) 6에서 측정한 PRP 분자량 측정 데이터와 조(crude) PRP 분자량 측정 데이터를 보여준다.
도 2는 조 PRP 분자량과 원말 PRP 분자량 분포간의 회귀 분석을 행하여 얻은 적합선 및 회귀 방정식을 보여준다. 또한, 원말 PRP 분자량과 원말 PRP 분자량 분포간의 회귀 분석을 행하여 얻은 적합선 및 회귀 방정식을 보여준다.
도 3은 본 발명의 Hib의 PRP 생산 공정에서 IPC (In Process Control)을 행하는 개념을 보여주는 모식도이다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기의 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
실시예
실험예 1: 조 PRP 분자량 및 원말 PRP 분자량 분포를 이용한 품질 평가 방법
실험예 1-1: 조 PRP의 분자량 측정
헤모필루스 인플루엔자 타입 b (Haemophilus influenzae type b, Hib)를 배양한 배양액으로부터 PRP를 정제하여 최종 정제된 PRP 원말을 제조하는 공정 동안에, 정제 공정 중간 산물로, 정제가 완료되지 않은 조 PRP를 포함하는 샘플을 채취하고, 채취된 샘플내의 조 PRP의 분자량을 측정하였다. PRP는 높은 극성을 갖는 물질이므로 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography)의 컬럼을 통과하지만, PRP 이외의 다른 불순물은 역상 크로마토그래피 컬럼에 결합되므로, 역상 크로마토그래피를 이용하면 샘플내에서 PRP만을 순수하게 분리할 수 있다. 조 PRP를 포함하는 채취한 샘플을 역상 크로마토그래피 컬럼에 투입하여, 컬럼에 결합하지 않고 통과되어 나온 조 PRP에 대해, MALS (Multi-Angle Light Scattering, MALS) 검출기를 사용하여 조 PRP의 분자량을 측정하였다.
실험예 1-2: 원말 PRP의 분자량 분포 측정
헤모필루스 인플루엔자 타입 b (Haemophilus influenzae type b, Hib)를 배양한 배양액으로부터 PRP를 정제하여 최종 정제된 PRP 원말에서, 원말 PRP의 분자량 분포를 측정하였다. 원말 PRP의 분자량 분포는 다음 과정을 통해 측정하였다. 블루덱스트란(Blue Dextran)과 염화나트륨(Sodium Chloride, NaCl)를 분자량 표준 물질로 사용하여 크기 배제 크로마토 그래피(Size Exclusion Chromatography, SEC)를 통과시켜, 표준 물질의 머무름 시간(RT, retension time)를 확인하였다. 컬럼으로부터 첫번째로 나오는 블루덱스트란의 RT를 V0로 하고, 두번째로 나오는 염화나트륨의 RT를 Vt로 하여, 분배계수(Kd, Partition or Distribution Constant)가 0.3을 만족하는 기준값 Vp를 계산하였다[Ex: Vp = 0.3 X (Vt - V0) + V0)]. 이어서, 원말 PRP를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통과시켜 입자 크기 별로 분획하여 Main Peak의 전체 면적중에서 Vp 값을 기준으로 하여 앞에 나온 면적의 상대 면적(%)을 구하여 이를 분자량 분포로 표시하였다. 즉, 원말 PRP의 분자량 분포는 다음식으로 구하였다: 분자량 분포(%) = Vp 앞 부분의 면적/전체 면적 X 100.
실험예 1-3: 회귀분석
상술한 실험예 1-1 및 실험예 1-2에 의한 측정을, Hib PRP 정제 공정의 배치 2 내지 배치 5의 총 4개의 배치에 대해 수행하고, 측정된 데이터를 토대로 회귀분석을 수행하였다. 구체적으로, 실험예 1-1에서 측정한 조 PRP의 분자량 데이터와, 실험예 1-2에서 측정한 원말 PRP의 분자량 분포 데이터를 각각 변수로 정하고, 선형 회귀 분석에 의해 회귀 방정식을 산출하였다(표 1 및 도 2). 산출된 회귀 방정식은 "y = 0.0042x + 0.3377"이었다. 상기 회귀 방정식에서 x는 조 PRP의 분자량를 나타내고, y는 원말 PRP의 분자량 분포를 나타내며, 회귀 방정식의 신뢰도(설명력)을 나타내는 R제곱값(R2)은 0.7346이었다. R제곱값(R2)이 0.7346을 나타내어 높은 상관관계를 보임을 확인하였다. 상기 회귀 방정식을 통해 원말 PRP 분자량 분포 50% 이상인 원말 PRP를 생산하기 위해서는 조 PRP의 분자량은 38.5 kDa 이상을 만족해야 함을 알 수 있다. 상기와 같은 분석을 토대로, PRP의 정제 공정중에서 조 PRP의 분자량을 38.5 kDa 이상이 되도록 관리하면, 품질 관리(quality control)기준이 되는, 원말 PRP의 분자량 분포가 50% 이상인, 최종 정제된 PRP 원말을 얻을 수 있다.
Batch 2 Batch 3 Batch 4 Batch 5 회귀분석 산출값
조 PRP 분자량 128.6 56.9 53.3 38.9 38.5
원말PRP 분자량 분포 85% 66% 64% 37% 50%
분자량 단위: kDa
실험예 2: 원말 PRP의 분자량 및 분자량 분포를 이용한 품질 평가 방법
실험예 2-1: 원말 PRP 분자량의 측정
헤모필루스 인플루엔자 타입 b (Haemophilus influenzae type b, Hib)를 배양한 배양액으로부터 PRP를 정제하여 최종 정제된 PRP 원말을 제조하였다. 최종 정제된 PRP 원말에서 원말 PRP의 분자량을 측정하였다. 원말 PRP의 분자량 측정은 실험예 1-1의 조 PRP 분자량 측정과 동일한 방법으로 수행하였다. 원말 PRP를 포함하는 샘플을 역상 크로마토그래피 컬럼에 투입하여, 컬럼에 결합하지 않고 통과되어 나온 원말 PRP에 대해, MALS (Multi-Angle Light Scattering, MALS) 검출기를 사용하여 원말 PRP의 분자량을 측정하였다.
실험예 2-2. PRP 원말의 분자량 분포 측정
헤모필루스 인플루엔자 타입 b (Haemophilus influenzae type b, Hib)를 배양한 배양액으로부터 PRP를 정제하여 최종 정제된 PRP 원말에서, 원말 PRP의 분자량 분포를 측정하였다. 원말 PRP의 분자량 분포는 상기 실험예 1-2에서 설명된 방법과 동일한 방법으로 측정하였다.
실험예 2-3. 회귀분석
상술한 실험예 2-1 및 실험예 2-2에 의한 측정을 Hib PRP 정제 공정의 배치 1 내지 배치 6의 총 6개의 배치에 대해 수행하고, 측정된 데이터를 토대로 회귀분석을 수행하였다. 구체적으로, 실험예 2-1에서 측정한 원말 PRP의 분자량 데이터와, 실험예 2-2에서 측정한 원말 PRP의 분자량 분포 데이터를 각각 변수로 정하고, 선형 회귀 분석에 의해 회귀 방정식을 산출하였다(표 2 및 도 2). 산출된 회귀 방정식은 "y = 0.0131x - 0.4035"이었다. 상기 회귀 방정식에서 x는 원말 PRP의 분자량을 나타내고, y는 원말 PRP의 분자량 분포를 나타내며, 회귀 방정식의 신뢰도(설명력)을 나타내는 R제곱값(R2)은 0.9222이었다. R제곱값(R2)이 0.9222을 나타내어 높은 상관관계를 보임을 확인하였다. 상기 회귀 방정식을 통해 원말 PRP의 분자량 분포 50% 이상인 원말 PRP를 생산하기 위해서는 원말 PRP의 분자량은 69.1 kDa 이상을 만족해야 함을 알 수 있다. 상기와 같은 분석을 토대로, PRP의 정제 공정중에서 원말 PRP의 분자량을 69.1 kDa 이상이 되도록 관리하면, 품질관리(quality control)기준이 되는, 원말 PRP의 분자량 분포가 50% 이상인, 최종 정제된 PRP 원말을 얻을 수 있다.
Batch 1 Batch 2 Batch 3 Batch 4 Batch 5 Batch 6 회귀분석산출값
원말 PRP
분자량		 72.1 99.8 76.5 75.5 64.5 55 69.1
원말 PRP
분자량 분포		 57% 85% 66% 64% 37% 29% 50%
분자량 단위: kDa
상기에서는 본 출원의 대표적인 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 출원의 범위는 상기와 같은 특정 실시예만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims (12)

  1. 다음의 단계를 포함하는 Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법:
    (a) 헤모필루스 인플루엔자 타입 b (Haemophilus influenzae type b, Hib)를 배양한 배양액으로부터 폴리리보실 리비톨 포스페이트 (polyribosyl ribitol phosphate, PRP)를 정제하는 공정 중에서 조(crude) PRP를 포함하는 샘플을 채취하는 단계;
    (b) 채취한 샘플 내의 조 PRP의 분자량을 측정하는 단계;
    (c) PRP를 최종 정제한 원말에서 원말 PRP의 분자량 분포를 측정하는 단계;
    (d) 단계 (b)에서 측정한 조 PRP의 분자량 데이터와, 단계 (c)에서 측정한 원말 PRP의 분자량 분포 데이터를 사용하여, 조 PRP 분자량과 원말 PRP 분자량 분포 간의 회귀 분석(regression analysis)을 수행하는 단계; 및
    (e) 회귀 분석으로부터 특정 수준 이상의 원말 PRP 분자량 분포를 만족하는 조 PRP 분자량을 산출하는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 (b)에서 조 PRP의 분자량의 측정은 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 통해 행하는 것인, Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 단계 (b)에서 조 PRP의 분자량의 측정은 자외선 흡광도 검출 방법 또는 광산란 검출 방법을 더 포함하여 행하는 것인, Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 (c)에서 원말 PRP의 분자량 분포의 측정은 크로마토그래피 분석 방법을 이용하여 행하는 것인, Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 (d)에서 회귀 분석은 선형 회귀 분석인 것인, Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 (e) 이후에, Hib의 PRP의 정제 공정에서 얻어지는 조 PRP의 분자량 값과, 상기 단계 (e)에서 산출된 조 PRP의 분자량 값을 비교하는 단계를 더 포함하는, Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법.
  7. 다음의 단계를 포함하는 Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법:
    (a') 헤모필루스 인플루엔자 타입 b (Haemophilus influenzae type b, Hib)를 배양한 배양액으로부터 폴리리보실 리비톨 포스페이트 (polyribosyl ribitol phosphate, PRP)를 정제하여 얻은 최종 정제 원말에서, 원말 PRP의 분자량 및 원말 PRP의 분자량 분포를 측정하는 단계;
    (b') 단계 (a')에서 측정한 원말 PRP의 분자량 데이터와 원말 PRP의 분자량 분포 데이터를 사용하여, 원말 PRP 분자량과 원말 PRP 분자량 분포 간의 회귀 분석(regression analysis)을 수행하는 단계; 및
    (c') 회귀 분석으로부터 특정 수준 이상의 원말 PRP 분자량 분포를 만족하는 원말 PRP 분자량을 산출하는 단계.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 단계 (a')에서 원말 PRP의 분자량 측정은 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법을 통해 행하는 것인, Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 단계 (a')에서 원말 PRP의 분자량 측정은 자외선 흡광도 검출 방법 또는 광산란 검출 방법을 더 포함하여 행하는 것인, Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 단계 (a')에서 원말 PRP의 분자량 분포의 측정은 크로마토그래피 분석 방법을 이용하여 행하는 것인, Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법.
  11. 청구항 7에 있어서,
    상기 단계 (b')에서 회귀 분석은 선형 회귀 분석인 것인, Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법.
  12. 청구항 7에 있어서,
    상기 단계 (c') 이후에, Hib의 PRP의 정제 공정에서 얻어지는 원말 PRP의 분자량 값과, 상기 단계 (c')에서 산출된 원말 PRP의 분자량 값을 비교하는 단계를 더 포함하는, Hib의 PRP의 정제 공정에서의 PRP의 품질 평가 방법.
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