JPH06503174A

JPH06503174A - 核酸の電気泳動のための改良されたガラクトマンナン−アガロ−ス二成分ゲル

Info

Publication number: JPH06503174A
Application number: JP4505705A
Authority: JP
Inventors: パールマン，　ダニエル
Original assignee: ブランディーズ　ユニバーシティ
Priority date: 1991-01-24
Filing date: 1992-01-24
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2010-09-20
Also published as: EP0569494B1; ATE150664T1; DE69218586D1; US5230832A; DE69218586T2; ES2099249T3; JPH0786503B2; EP0569494A4; DK0569494T3; EP0569494A1; WO1992012789A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称　核酸の電気泳動のための改良されたガラクトマンナンーアガロースニ成分ゲル発明の背景本発明はアガロースとガラクトマンナンを含有する電気泳動ゲルに間する。アガロースは寒天から精製された多糖類てあり、核酸の分画のための水性の′ａ衝化されたｔ気泳動ゲルを形成するために一般に使用されている。

ポリアクリルアミド及びガラクトマンナンを含めた合成又は天然起源の種々の池のヒドロコロイド重合体が核酸及び池の巨大分子のｚ　Ｘ泳動のため己こアガロースと組合されてきた。例えばピーコック（Ｐｅａｃｏｃｋ）等、Ｂ　ｉ　ｏｃｈｅ＋ｏ　１ｓｔｒｙ、　７．　Ｎｏ、２．６６８−６７４　（１９６８）はＲＮＡの分離及び分析のためにアガロースで強化したアクリルアミドゲルを利用している。タック（ｃｏｏｋ）等の米国特許４，２９０．９１１は蛋白質分子間の正味電荷の差がゲル中で分子を分離するのここ使用される等電フォー力ノンングのための透明化イナゴ豆ガム（ｃｌａｒｉｆｉｅｄ　１ｏｃｕｓｔ　ｂｅａｎ　ｇｕｍ＝ｃＬＢＧ）等の透明化ガラクトマンナンガム（ＣＧＭ）を含有しているアガロースゲルを利用し、ている。クールスケ（Ｇｕ＋・Ｓにｅ）の米国特許４．３２１゜１２１は酸ポリサッカライト又；よガラクトマンナンポリサンカライドを７ガロース等のゲル化ポリサッカライドと組合せ、ｉ　％泳動ゲルを形成している。グルスケのゲル組成物：よ、電荷が二となる同種な分子量を有している蛋白質イソ酵素（アイソザイム）の分離を改良するといわれている。

バールマン（Ｐｅｒｌｍａｎ）等は　４ｎａｌ　ｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ。

１６３．２４７−２５４　（＋９８７）に於てイナゴ豆（１ｏｃｕｓｔ　ｂｅａｎ）ガムガラクトマンナンを７ガロース及びトリス−ボレート−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液と絹合せて使用してＤＮＡ断片を分画することをに己載している・発明のまとめ本発明に於て核酸分画のための有用な複合的アガロース−ＣＧＭ−含有Ｎ　％泳動ゲルを形成する方法が発見された。

特定の′ｆｌ耐組成物及びカシマー照射ＣＧＭ又：よＣＬＢＧ　（（（口又はγ ＩＴＬＢＧ）を使用することここよってゲル化方法が示され、ＣＬＢＧ−アガロース混合溶液の粘性及びゴム性の性質が減少される。二のことは透明で泡のない電気泳動ゲルへ注型（キャスティング）するために用いられる以前−二使用されていた慣用のＣＬＢ＋−と比較してより高いａ度のγＣＬＢＧを可能としている。これらのより高い１度のγＣＬＢＧは大きざが異なるＤＮＡ分子の分離及び分割を改良する。

二二二二記載したゲル；！臭１ヒエチジウム染色の前技び後の両方とも向上したそし・て有用な透明度を有することが最近発見された。ゲル（ヒアカロースの光学的な性質の変更から生しる二の讐くへさゲルの透明１ヒは７’ＣＬＢＧ添加；こよ−）で誘導され、そして同しアカロース１度を有するが、ｒｃ１３Ｇを欠いているＩＬ純なアカロースゲルの透明度よりも優れている。

一般に本発明はより優れた透明性と、より大きな核酸負荷量能力と、分子量の間数としての改良された核酸断片の分割（解像力）と、先行技術の同様なアガロース電気泳動ゲルよりもより大きな裂けと破裂に対する抵抗性とを示すゲルを得ろ為の、γＣＧＭを使用してアガロース電気泳動ゲルをつくる方法を特徴としている。複合ゲルはアガロース及びγＣＧＭ植物ガム、例えばその構造を放射線的に変更し、γＣＧＭの生じる水性緩衝化溶液の粘度を予定水準；こ減少させる為にガンマ−線照射されている市販のＣＬ　Ｂ　Ｇ　＃）ら形成される。透明にされたグアー、タラ（ｔａｒａ）又はカシアガム（実験室で濾過透明化されたもの）もこれ−二かわるガラクトマンナン源とし・て利用できる。

これらのガムの各々は室温で透明溶液とし・て安定なままであろく２０〜２５℃ ）。

ＣＧ　Ｍのガンマ−解剖処理；よ、Ｃ０４の構造を化学的二二変更し、そして所望の有用範囲に粘度を減少させるイオン化Ｂ？射にＣＧＭを暴露することを含んでいる。

本発明に於てγＣＬＢＧは初め゛て製造されて核酸の電気泳動ここ利用された。

本発明者はまたホスフェート及びアセテート緩衝化トリス−ＥＤＴＡ溶；αを含んているある種の電気泳動緩衝組成物は、ｒＣＬＢＣコ及びアガロースと組合せたとき；こ非ガム性のゲルを生しることを発見し・た（上記のバールマン等のガム様のゲルと比較し・た場合）。二の非ガム用の稠度はこれらの７力ロースソル組成物が空気の准をとらえる傾向を減少させる。准は、泡のないものでなければならない均賀な電気泳動ゲルの形成をやっかいなものとする９本発明に於てＣＧＭのガンマ−照射は適当な電気泳動緩衝液の使用と組合せると、はとほどの粘度を有するゾルを生じるために広範囲のγＣＧＭｉ１度をアガロースと絹合せることを可能とし、それによって容易にゲルを形成するために、主型する二とかできろ。アガロースゲル中の空気の、ａをとらえる二となし・ここ５％（−ハ）までのＴＣＧＭＩＡ度を使用する二とが可能な二と：ｉ、小さな核酸断片（１０〜２．０００塩基対）の断片の中から分子量の差に基づいてこれらの核酸の断片の改良分画ができるようにすることがさらに発見された。

驚くべきことに（ＣＧＭを７ガロースゲルに添加することはゲル化し、たアガロースの透明化を誘導する二とが発見され、モし、て実際アガロースゲルの分光光度計的に測定し・た光学的濁度（光学密度）を減少する二とが発見された。ｒＣＧＭ添加物がなぜ複合ｉｉ気気泳動ゲル中曇りの量を減少させるかという理由については知られていないが、曇りの減少はゲル化したアガロース構造における変化によって生じ・たちのであり得ろ。二の特徴はＵ〜螢光発生性の臭化エチジウム等の染料での染色後、写真のために持にゲル透明性が重要であるので有益である。

第一の面に於て、本発明；ま分子量の違う核酸、即ちオリゴヌクしオチトの電気泳動による分画及び分割を改良させながら、ゲル化したアガロースの固有の曇りを減少することによってゲルを光学的に透明化する目的のためにγＣＧＭを添加する二とによってアガロースゲルを修飾する方法を特徴としている。修飾されたゲルは同じアガロースの１度を含有しているが、上記のガンマ−照射ガラクトマンナンを欠いているアガロースゲルと比較して、曇りが減少している。アガロースゲル１１飾の方法はいくつかの段階を含んでおり、それらにはまず乾燥固体形のＣＧＭを０暑と４．０メガラツトの間のイオン化ガンマ−照射にかけてγＣＧＭを生じることを含んでいる。この照射処理は２５℃の蒸留水中のγＣＧＭの溶液の単に容量（ｗ／ｖ）当り１重量％につき１０から１，０００センチボイス（ｃｐ）の間の絶対粘度を有し・でいるｒＣＧＭ植物ガムを生しる。第二におよそ０．１％〜５．０％（讐ハ）の二の（ＣＧＭを水性電気泳動緩衝液中でおよそ０．２〜２．０％（−八）の７ガロース（ｔス泳動等級）と−緒にする。典型的に二よ燐酸塩又は酢酸塩陰イオンを含有しているこの緩衝液は、電気泳動の間一定のｐＨと核酸の化学的安定性を維持する。γＣＧＭ、アガロース及び電気泳動緩衝液の混合物を次二二およそ１００℃に加熱し透明なゾルを形成し、最後に注型して冷却し・て透明な電気泳動ゲルを形成する。

好ましい具体例中で、本発明はガラクトマシナンを欠いている同様のゲルと比較して増加した機械的強度のゲルを生しるために、７カロースが化学的にガラクトマンナンと相互作用をすることができる０、１０よりも大きな、又はおよそ０．１０に等しいｔ％浸透（エレクトロエンドオスモシス）値（−Ｍ、）を有するアガロースを使用することを特徴どしている。別の好ましい具体例中で、本発明は２，０００ヌク１／オチド未溝を含有するオリゴヌクレオチドを分割するのに使用され、そして各々が２００ヌクレオチドを越えない、そしてそれらの差が互に１０ヌクレオチドを越えないものである２つのオリゴヌクレオチドを分画し分割するのに使用できる。

他の好ましい具体例中で、およそ０．５％（讐／ｖ）のｒ　ＣＧｉの１度は、６５０ｎｍの波長で光学密度によって測定された時に、２％（ｗ／ｖ）アガロース含有ゲル中の光学的な曇りを少なくとも２５％だけ減少させる。従ってγＣＧＭをアガロースｔ％泳動ゲルに導入する二とによって、本発明の方法はゲルの改良された写真文書化（フォトドキュメンテーション）、例えば臭（ヒエチジウム染色された核酸含有ゲルを可能とする。

さらに別の好まし、い具体例中で、本発明の方法で使用されるゲル組成物は、好ましくは０．４％〜１．０％（騒・／ｖ）アガロース及び０．２％〜４％（Ｗ／Ｖ）のγＣＧＭを含有している混合物を用いる。そしてそのγＣ（：Ｍは乾燥粉末形の市販のＣＧＭを０．１と４．０メカラツトの間のイオン化ガンマ−照射にかけて２５℃の芸留水中の１％（−／〜）溶液につき、２０〜５００ｃｐの間の粘度を有する放１＆Ｉ分解的４ご変更されたＣＧＭを生しることによって造られたものである。

特に好ましい具体例中では、本発明はおよそｐＨ８，０の燐酸塩、酢酸塩及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液からなる群から選ばれる電気泳動績衝液、例えば燐酸塩及び酢酸塩緩衝七トリスＥＤＴＡ溶液を使用して、ゲル化速度、レオロジー没びゲル形成混合物の粘度を制御することを特徴どしている。

燐酸塩緩衝液は蒸留水中に次の最終濃度に溶解することによって造られる。０．０４Ｍ　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス塩基）　、　０．００４Ｍエチレンジアミン四酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ）　、及びそして十分な燐酸を加えてＩＪＬ終溶液のｐＨを８，０にすることによって造られる。

酢酸緩衝液；よ蒸留水中；こ次のＩ！ｌ終１度、即ち０．０４Ｍ　）リス塩基、０．００２Ｍ　ＥＤＴＡを溶解し、そして十分な氷酢酸を加えてＩｋ終溶液のｐ）ｌを８．０二二することここよって造られる。

本発明中てγＣＧＭを造るための出発物質として使用されるＣＧＭの好ましい給源：、ｔＣＬＢＧである。

本発明の他の特徴及び利点は次の好ましい具オ例の記載及び特許請求の範囲から明らかとなる。

好まし・い具体例の記載透明化ガラクトマンナン「透明化ガラクトマンナン」こよ以前コニタック等の米国特許４．２り０．９１１によ：〕特許文献中に定義されている。本発明の文脈中ではＣＧＭとは外皮断片がなくてゲル化なしに水中にそれ自体で１００℃を含めた１００℃までの温度で可溶であって、実貿的に透明な溶液を形成する精製されたガラクトマンナン植物ガムを意味する０例えば本発明に有用な最終物質を造るのに出発物質として有用な一つの市販されている透明化ＣＧＭ：虚、イナゴ豆ガムから精製され、ＦＭＣ：ｌ−ボレイション（ゲロイト（Ｇｅｔ　１ｏｉｄ）ＬＢ２３０）から得られるｆ：　Ｌ　Ｂ　Ｇである。これは熱水中コニ溶解し、１％（−ハ・）溶液は２５℃で約２．５００ｃｐｓの粘度を有している。

二の物質は好ましく；よ乾燥固体形であり、本発明で使用されるために二よガンマ−照射によって処理されてｒＣＬＯＧを造らなければならない。本発明の出発物質として有用なＭ＊ガムガラクトマンナン類は、幾つかのＤ−マンノピラノシル残基の０〜６に置で単一のα十ガラクトピラノシル基が結合している。　（１ →４）−β−Ｄ−マンナン主鎖ポリマーを含む多糖類である。最も容易ユニ人手される市販の透明（ヒＣＧＭ！、？、セラトニア（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ）シリクア（ｓｉｌｉｑｕａ）の高木さや（ｔｒｅｅ　ｐｏｄ）のイナプ豆穀粒内旺葉から抽出されたイナゴ豆ガムから精製される。カシア（桂皮）ガム及びイナゴ豆ガム（一般にｌ道及びｉ！紙紙製造石使用されている）等の市販のカラクトマンナン二よ透明て：よなく、そのままて；よ外皮断片及び／又；ｉ池の不純物を含有しでいるので本発明の用途には適していない。これらの不純物：ｉ　ｎ＋−独て又：ｉ溶解されたアガロースと一緒；：Ｉ！った溶液を生じるので、遠心分離段Ｕ／又二よ溶液の瀘過又。

は他の手段で注意深く除去して、本発明で有用な透明生成物を生じなければならない。

上の点における好ましい具体例に於て、ＣＧＭ出発物質はＣＬＢＧ、タラガム、グアーガム及びカシア（桂皮）ガムからなる群から選ばれ、最も好ましくはＣＧ旧ｉ　ＣＬＢＧである。上に記載されたゲロイｌ’ＬＢ２３０のような市販のＣＬＢＧおよそ２　、５００ＣＰである。イオン化ガンマ−照射によるＣＬＢＧの放射線による修飾の間、粘度はｌ０ｃｐとｌ　、０００ｃｐの闇に減少し、好ましくは２５℃で蒸留水中１％（−八）溶液こ：つき２０ｃｐと５００ｃｐの間である。放射線による修飾は好ましくは、市販の乾燥固体ＣＧｉ、例えばＣＬＢＧ粉末の室温ミニおける０、１と４．０メガラツトの間の［！？射を用いろコバルト６０又はＣｓ１３７ガンマー線ｑ？射（又：よその均等物）によって達成されろ。一般に０．２５〜２．０メガラツトのガンマ−照射はＣＧＨの望まれろ修飾の程度を生し・ろのに、そして２５℃に於ける蒸留水中の１％（−八）溶液につき２５０と２５ｃｐの間の範囲の粘度ｍ：減少するの：こ有効である。Ｃｏ（コバルト）６０日＝　ａｔ　：ｔ　ＣＧＭを１．Ｉ７ｍｅｖと１．３３ｍｅｖの間のエネルギーを有するカンマ−線ここ暴露させる一方、Ｃｓ　ｌ　３７　日ｇ射は０．６６ｍｅｖのガンマ−線に暴露することを提供する。いずれかの同位元素からの照射への暴露：ｉ、本発明の目的：こ有効である。およそ１．０メカラント又はそれより大きい水準て暇射処澤が用いられた時は、乾燥固体ＣＧＭ、例えばＣＬＢＧを本質的Ｌ′ｖ滅菌にする追加の利点を有している。滅菌したＣＧＭ粉末によって滅菌されたｔＫ泳動ゲル繍成物は、滅菌緩衝液にＣＧＭを溶解することここよって都合よく処方できる。この水性ゲル胡成物は次とこカビや８Ｍの成育の為に劣化することなしに長期間貯蔵する二とができる。

本発明は多くの望ましい性質を有するアガロースゲルを提供するが、そのようなゲルに通常存在する曇のほとんとがない電気泳動ゲルを提供する（実施例１讐照）。

この曇りはそのようなゲルの肉眼での分析及び写真文書化を邪魔する。例えば本発明でアガロースの曇りを減少させることは、およそ１ナノグラム又はそれ以下のＤＮＡを含有しているＤＮＡバンドを検出すること、及びエチジウムブロマイド染色された接散含有ゲルの写真を撮ることを可能にする。さらに２．０００ヌクレオチド未満を含有し・でいるオリゴヌクレオチドの分割又は分離及び分画化は、ｐ　Ｂ　Ｒ３２２Ｄ　Ｎ　、ＡのＭｓｐ　Ｉ制限酵素開裂及びファージラムダＯＮ　、Ａのヒゴ１１間裂から得られるＤＮＡ断片を分画することによって証明されるように、アガロースのみを含有しているゲルと比較してγＣＧＭ含有ゲルに於て有、を義：こ改良されている。この述べられた改良の証拠は２％（ｗ／ ν・）アガロース（シーケム（Ｓｅａｋｅｍ）ＬＥｔ気泳動等扱アガロースゲル、ＦＭＣ：ｌ−ボしイション）、４％ＮｕＳｉｅｖｅアガロース（これも「ＭＣコーポレイノヨン）又は０．５％アガロース（５ｅａＫｅｌａ　ＬＥアガロース）に２％（−バー）　ｒ　ＣＬＢＧ　（１，０メガラットガンマ−照射ゲロイド１、Ｂ２３０てあって、蒸留水中の１％（ｗ／ｖ）溶液に対し２５℃でおよそ４０ｃｐの粘度を有しているもの）を補充したもののいずれかを含有しているサイドバイサイド電ｌ泳動ゲルを注型することによって得ることができる。全てのゲルをトリス−ホスフェ−）　ＥＤＴＡ！　ｉｉｉ液を使用して演習した（　０．０４Ｍ　）リス塩基、０．００４ＭＥＤＴＡ、燐酸でｐＨ８，０に調節）。ゲル：；上記のＤ”ＦＩＡ断片を装填し、モし・て水平にｃｍ当り７：ｔ′Ｃルトてｉ！電気泳動せた。ゲル：ｉＤＮ’４の分画を評価するため：こ臭化エチジウム（０，５μ８／１）で染色した。２．０００ヌクレオチド未満を含有するＤＮＡ断片の分離改良の他に、γＣＬＢＧ含有ゲルはそれぞれ２００ヌクレオチドを越えないヌクレオチドを含有しており、１０ヌクしオチトを越えない寸法の違いのＤＮＡ断片の対の分離を有！義に改良することを示した。そのような断片はＭｓｐ　＋消（ヒｐＢＲ３２２ＤＮＡのｔ′ｊｃ泳動分離て溶離に検出された。

通常のアガロース含有ゲルと比較して２％（！／ν）γＣＬＢＧ含有アガロースゲルの光学的透明性の改良は可視光線及び紫外線の両方のもとて明らかである。

実施例１！こ示されるように、アガロースの一定濃度一二対し加えられたｆ　ＣＬＢＧのＪ度が増加すると、光学窓度（曇り）は減少する。この透明１ヒ効果の技術的な説明はいまだ確立されていないが本発明の責重な要素で：）る。？・ＣＬＢＧ含有ゲルの透明性はｐＢＲ３２２Ｄｌの電気泳動したＭｓｐｌ消化物中の臭（ヒエチジウム染色２６及び３４塩基対ＤＮＡ断片のナノグラム及Ｕナノグラム以下の量を、容易に検出し分割し・写真にとらせる能力に於て特に明らかである。２．０％（−／ν）アガロースゲルに対し０．１０％（シバ）の少ないｒＣＬＯＧを添加することは、６５０ｎｍ波長でＪす定する２成分形ケルに於ける曇りをおよそ１３％だけ減少させる一方、このガムの０．５０％（−・ハ）の添加は曇りを約３０％減少させる。

アカロース電気泳動ゲルを透明化することのはか、本発明に（にうγＣＧＭの添加；よアガロースゲルの強度及び弾性＝の増加を提供する。ゲル強度はケルの破壊を生し５るのに必要とするピストン上の単位面積当りの力をＪす定する二と；こよって決めらｎろ。１．０％（−八）アガロースゲルに対しわずか０．１〜０．３％（−ハ）ｒｃＬＢＧをン奈カロすることは有Ｖ義により強いゲルを提供する（ガラクトマンナシを欠いている２０％（−八）アカロースケルと匹敵する強度を有し・でいる）。例えばこれらのγｆ’：ＧＭＪ度範圃の添加ここよって達成されろゲル強度の増加：よおよそ２５０から５００ｇ／ｃｍ２である。

γＣＧＭ成分（例えば７（１ＢＧ）を造る為のコストが現在電気泳動等級アカロースの価格の１０％未満だとしで、２成分ゲル中ここ於てアカロースの代りにγ ＣＧＭを補充する二と及び部分的にｒＣＱ！ｌて置き換える二とによって実質的なコスト削減も達成される。

本発明で使用されるアガロースはおよそ０．ＩＯ又はそれ以上の−Ｍ、＋１１を有するへきである。そのようなアガロースは−”ｒｉｌ！！＜０．１を有するアガロースを使用して形成されるアガロースゲルと比較して増加した機械的強度を有するゲルを提供する。

核酸分画のための単純なアガロースゲルよりも利点を提供する本発明のｒＣＬＢＧアガロース２成分ゲルの追加的な特徴は、以下のよう二こまとめられうる。

（ｉ）　ｒｃＬＢＧアガロース２成分ゲルはそれらの大きざコニ基づく核酸の分離に対しより効率的な構造的網の目を提供する。例えば、１％（−八）ｒｃＬＢＧ＋、、か含有していない０．５％（−八）アガロースゲルでも２．５％（讐ハ）アガロースを含有しているゲルよりも大きな程度５０塩基対のＤＮ２断片の電気泳動の移動を遅らせる。同時にビヒクルとしてγＣＬＢＧ含有ゲルは、ＯＮ　、Ａバントが尾を引いたり汚れたりすることなしにアガロースケルよりもより大きな量のＤＮＡを運ぶ二とができる。１４　Ｋ泳動的に豫■間裂ｐＢＲ３２２ＤＮＡを運ぶ能力を比較すると２％（−・ハ）？’ＣＬＢＧ含有ゲルは、オーバーローディングなして４％（−八）　ＮｕＳｉｅシｅアガロース含有ケルのおよそ２培の［）ＮＡを侃持てきる。

驚くべきことにｒ＋：１３Ｇゲルは小さなりＮＡ断片（〜２００ヌクレオチド又：ｉそれ以下）を分画するのに４％（−ハ）ＮｕＳ１ｅνｅアガロースゲルとちょうど同じくらい効果的である。

（ｉｉ）　ｒＣＬＢＧアガロース２成分ゲル：よ１匹敵するアガロースゲルよりも、小さなオリゴヌクレオチドのよりタイトな、即ちより狭いミス泳動バンドを示す（特に２５〜２．０００塩基対を含有している小さなりＮＡ断片について）。

本発明者はゲル化したアガロースに水素結合するくそしてゲル中の水相の粘度に対し有ｔＩＩに富与する）γＣＬ　ＢＧがゲル水相中のＤＮＡのランダムな拡散の速度を減少さすると信じている。そのような拡散は恐らくはアガロースゲル中のオリゴヌクレオチドの電気泳動の過程の間−こバントが広くなってしまうことの原因である。

上記のｒｃＬ８Ｇ含有アガロースゲルの利点は、改良された透明性、機械的な強度及びｔ才料の減少コストを含めた前に記載の事項コニ加わる利点である。

実施例１ｒＣＬＢＧを７ガロース；こ添加することによって改良されたｉｉ寛泳動ゲル透明度が達成されろ。一連の７ガロースｚ　Ｋ泳動ケルを造ったが、これらは増加する濃度の１．０メガラントガンマ−日３１ＣＬ　Ｂ　Ｇを含有するように造った（オリジナルの出発を才料にＬ　Ｂ　Ｇ　：よＦ’ｌＣコーボレインヨンケロイ）１Ｂ２３０から得られた）。これらのゲルの光学密度（＋’ｌＤ）をゲル濁度を測定するため；こ６５０ｎｍの及び４７５０ｍでモニターし・た。そのような測定は形成されたゲル中の曇：つのｌｉを反映している。アカロース粉末の試料（０，１００シーケム（ＳｅａＫｅｍ）　ＬＥ　７カロース、Ｆ’ｌｔ”、： −ボレイション）を増加する橿ブのｔ（、’：＋、・（：ｌ−８＋？粉末と一渚；こし、そして５．０１容量のトリスホスフェ−）　ＥＤＴＡｉｉ気泳動緩衝液（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、モしキュラークローニングーＡラボラトリ−マニュアル（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ８−Ａ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ））中に１２１”ｃて１５分閏オートクレイプにかけることによって溶解した。γＣＧＭを含有している生しる２％（Ｉ７／ν）アガロース溶液は、分光光度計による測定のために使い捨てのポリスチレン光学用キベッゲル組成及び光学密度を表１に示す。ＯＤの減少％をγＣＧ−を欠いているアガロースゲルのＯＤに対し計算した。

これらのデータはγＣＧＭ添加がアガロースゲル透明度を向上させることを示し・てしる。

０．００　０．２７４　−−−　０．７３４０．０２　０．２６４　３．６　０．７０８　３．５０．０５　０−２５３　７．７　０．６８６　６．５０．１０　０．２３８　１３．１　０．６５１　１１．３０．２０　０．２１６　２＋、１　０．５９７　＋８．７０．３０　０．＋９９　２７．３　０．５６０　２３．７０．５０　０．＋８２　３３．６　０．５１７　２９．６實１ｉｌｉ！例２本発明コニ従うｒＣＧＭアガロース電ス泳動ゲルの処方及び注型を以下ここ記載する。アガロースとγＣＧＭポリサンカライドは互に一緒にさせられそして電気泳動ｗｉ衝液と−Ｕにざｔられるが、これはこのポリサッカライドを、′８解した前又は漫のいずれかにてきる。例えばアガロースとγＣＧ　Ｍ粉末を卿量し、次に適当容量の電電泳動緩衝液を添加した時にその分散（固まりにならないように）を確かなものとするため；こエタノールで湿らせることが都合がよい６高度に粘性のゴム状のアガロース・ガラクトマンナン溶液を生じ、ゲル注型の工程をやっかいなものとさせろ一般的に用いられているボレート含有を気泳動１ｉｉ　市、＋１上りも、アセテート又はホスフェート含有トリス−ｕｒ［ｉｔｉ　ａが好ましい、適当なｔ気泳動緩衝液の例は、氷酢駿（トリスアセテート緩衝液を形成するため）又は燐該（トリス燐酸塩緩１打液を形成するため）でそれぞれ滴定された０、０４’ｌ）リス塩基及び０．００２’ｌ　ＥＤＴＡを含有するアセテート及びホスフェート緩衝液が含まれろ。

＋００ｍ１ケル容量に対するアガロース及びｒ’、ＬＢｔ；を含有し、でいる典型的な２成分’Ｉ″ｊｃｉｌ）ｉ動ゲルを形成するのに使用ずろ段階；よ次の通りである。

（ｉ）　０．５ｇのアガロース粉末（Ｆ’ＩＣコーポレイションからのＳｅａＫｅｍ　ｌ、εアカロース）を郷量し・、そして乾燥フラスコ中に入れる。

（ｉｉ）　ｔｌＢＧのｔｌＥ造を敢４１線ａ、Ｈ射的；こ変え粘度を２５℃でおよそ２０〜４０ｃｐに減少させろ為に、Ｉ”、　ｏ　６０照射て予めガンマ−照り１された屹１１ｔ（粉末）杉のおよそ１．０〜２　’　ＯＪのｒＣＬＢＧ　（ＦＭＣｂ）らのゲロイドＬ　Ｂ　２３０　（Ｌ３　ｔ；が出発物質）をＰ量し、上記アガロース粉末に加える。

（ｉｉｉ）　十分な容量のエタノールを加えて粉末混合物を湿らせる。

（ｉｖ）　およそ９８〜９９ｍ　ｌのトリスホスフェート緩衝液（上記のもの）を混合物に加え、生しろ懸；ｉｉ液を沸１まて加熱しく沸騰してふきこぼれを防止するためユニ渦巻き攪拌又は攪拌をしながら）、そして全ての粒状物質が溶解するまで９０°Ｃ以上；こ維持する。

（（・）透明なゾルをおよそ６０℃に冷却し・、注型してゲルを形成する。ゲル形成前に試料装填ウェルを形成するために、ｍをゾル中に挿入する。

（Ｖｌ）ゲル形成後、櫛を除去し２、ゲルをｔ寛泳動室内の同し緩衝液（ゲルを形成したのに匣用したもの）中に漫、責させろ。咳駿試０を次；こ試料ウェルに添加し電気泳動を開始する。適当なｒＣＬＢＧとアガロースを含有しているこれらのゲル−二対する適当な電（江差勾配；よＣｍ当り５〜１０ボルトである。上記の２成分ゲル中の接散装填緩衝液中に入れたブロモフェノールブルー追跡（トラッキング）染料はおよそ４０〜６０ヌクレオチドを含有している二本鎖ＤＮＪ断片と共二ニー緒に移動する。

実施例３市販の白；１の制御された（ヒ学的変更、及びその粘度の減少をカンマ−［ｌ！？り１て１テなう。ＣＬ　Ｂ　Ｇ乾燥粉末（Ｆ’ＩＣコ−ボしイショノから得られたゲロイドＬＢ２３０）　’ｅ　２Ｓ℃で増加する曙々の期間の閘、Ｃｏ６０にＩＮすることによってガンマ−照射し、０．Ｉｂ）ら４．０メガラツドの範囲の暴露照射線量を生じた。その後、エチしングリコールで粘度補正されていたサイズ４００ギヤノンーフエンケビスコメーター　（ＡＳＴＭ　１）２５１５及びＤ１４５桔度方法〉を開用して、照射（１６Ｇズ科の１％（ｂ／ν）溶液の運動学的な粘度を試験した。

絶対粘度をガニマー照射線量の幾つつ）についで表２に以下の通り与えろ。

池の具体１り！１は次の特許請求の範囲内シこある。

手続補正音１　事件の表示　ＰＣＴ／ＬＩＳ　９２１００５９８３　補正をする者事件との関係　特許出願入江　所　アメリカ合衆国　０２２５４−９１１０　マサチュー七ツッ州つォルザム　サウス　ストリート（Ｓ地なし）氏名（名称）　プランディーズ　ユニバーシティ４代理人注　所　東京都新宿区新宿２丁目８＠１号新宿セブンビル５０３号６　補正により増加する発明の数　増加せず７　補正の対象　特許請求の範囲の項８　補正の内容　別紙の通り特許請求の範囲を以下に訂正する。

１、乾燥固体形の透明１ヒガラクトマンナン（ＣＧＭ）を０．１メガラツドと４．０メガラツドの間のイオン化ガンマ−線照射にかけてγＣＧＭをつくり、水性を寛泳動瑳衝液中で０．２％〜２％（緩衝液容量当りの重量、即ち一へ）のアガロース及び０．１％〜５．０％（ｗ／ｖ）の該ｌ・ＣＧ′Ｉを一緒にし、アガロース、γＣＧバ及び緩衝液の該混合物を加熱して透明なゾルを形成させ、そして該ゾルを注型して冷却し、透明化電気泳動ゲルを形成させろ段階からなる、アガロース電気泳動ゲルを形成する方法。

２、該電気泳動緩１訂液が燐酸塩、酢酸塩及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝化溶液からなる群から進択されろ請求項１に記載の方法。

３　、０．２％〜２％（緩衝液の容量当り重量、−八）のアカロース、０．１％〜５．０％（−・／ヤ）のガンマ−線照射（い、及び水性電気泳動緩衝液を含むアガロース電気泳動ゲル組成物。

４、該ｍ重液が燐酸塩、酢酸塩及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンからなる群から選ばれる請求項３に記載の組成物。

国際調査報告１１１．６．。””　１０．＋１＋、＊１．、ＰＣＴ／ＵＳ９２１ＬＸＩ５９Ｂフロントページの続き（５１）　ｒｎｔ、　ｃｔ、　５　識別記号　庁内整理番号Ｃ０８Ｊ　３／２８　ＣＥＰ　９２６８−４Ｆ／／Ｃ０８Ｌ　３：００Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．乾燥固体形の透明化ガラクトマンナン（ＣＧＭ）を０．１メガラッドと４．０メガラッドの間のイオン化ガンマー線照射にかけてｒＣＧＭをつくり、水性電気泳動緩衝液中で０．２％〜２％（緩衝液容量当りの重量、即ちｗ／ｖ）のアガロース及び０．１％〜５．０％（ｗ／ｖ）の該ｒＣＧＭを一緒にし、アガロース、ｒＣＧＭ及び緩衝液の該混合物を加熱して透明なゾルを形成させ、そして該ゾルを注型して冷却し、透明化電気泳動ゲルを形成させる段階からなる、アガロース電気泳動ゲルを形成する方法。
２．該アガロースが０．１０よりも大きいか又は０．１０に等しい電気浸透（ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｄｏｓｍｏｓｉｓ）（−Ｍｒ）を有している請求項１に記載の方法。
３．該ｒＣＧＭの０．５％（ｗ／ｖ）が２％（ｗ／ｖ）アガロースを含有しているゲル中の曇りを少なくとも２５％だけ減少させる（６５０ｎｍの波長で光学密度を測定することによる）請求項１に記載の方法。
４．０．４％〜１％（ｗ／ｖ）のアガロース及び０．２５メガラッドと２．０メガラッドの間のイオン化ガ）マ−線照射にかけられたｒＣＣＭ０．２％〜４％（ｗ／ｖ）を該混合物が含んでいる請求項１に記載の方法。
５．該電気泳動緩衝液が隣酸塩、酢酸塩及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝化溶液からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
６．該ＣＧＭが透明化イナゴ豆ガム（ＣＬＢＧ）、タラガム、グアーガム、及びカシアガムからなる群から選ばれる請求項１、３又は４に記載の方法。
７．該ＣＧＭがＣＬＢＧである請求項６に記載の方法。
８．乾燥固体形のＣＧＭそ０．１メガラッドと４．０メガラッドの間のイオン化ガンマー線照射にかける段階を含む、ＣＧＭの構造を放射線分解的に変更させ２５℃で蒸留水中１％（ｗ／ｖ）溶液につき１０〜１０００ｃｐの間の粘度にＣＧＭの粘度を減少させる方法。
９．０．１から４．０メガラッドのイオン化ガンマー照射に暴露することによってＣＧＨからｒＣＧＭが形成される、ゲル電気泳動に使用するための乾燥固体τ ＣＧＭ組成物。
１０．該ｒＣＧＭがγＣＬＢＧである請求項９に記載の組成物。
１１．ホスフェート、アセテート及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンからなる群から選ばれる水性電気泳動揺衝液中で、０．２％〜２．０％（緩衝液容量当りの重量、ｗ／ｖ）のアガロース、及び０．１％〜５．０（ｗ／ｖ）のＣＧＭを一緒にし、アガロース、ＣＧＭ及び緩衝液の該混合物を加熱して透明なゾルを形成し、そして該ゾルを注型し、冷却して透明化された電気泳動ゲルを形成ずる段階を含むアカロース電気泳動ゲルを形成する方法。
１２．０．２％〜２％（緩衝液の容量当り電量、ｗ／ｖ）のアガロース、０．１％〜５．０％（ｗ／ｖ）のガンマー線照射ＣＧＭ、及び水性電気泳動緩衝液を含むアガロース電気泳動ゲル組成物。
１３．該揺衡液が燐酸塩、酢酸塩及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンからなる群から選ばれる請求項１２に記載の組成物。