ES2681993T3

ES2681993T3 - Método para producir antígenos de Haemophilus influenzae de tipo b

Info

Publication number: ES2681993T3
Application number: ES13744668.8T
Authority: ES
Inventors: Jérome LE HIR; Pascal Loubiere; Fabien BARBIRATO; Nicholas LINDLEY
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2018-09-17
Anticipated expiration: 2033-07-02
Also published as: NZ702471A; BR112014033082A2; MX2014014607A; CA2878053C; MX358953B; PH12014502730A1; KR20150036311A; PL2885397T3; HRP20181206T1; CR20140559A; EP2885397B1; CA2878053A1; US20170211111A1; IL236208A0; HK1208493A1; TR201810678T4; BR112014033082B1; GEP201706788B; EP2885397A1; CY1120465T1

Abstract

Un proceso para producir, a escala industrial, un polisacárido capsular de Haemophilus influenzae de tipo b (PRP) destinado a fines de vacunación, según el cual se cultiva una cepa de Haemophilus influenzae de tipo b (Hib) en un medio de cultivo y el sobrenadante del cultivo se recolecta y se trata con el fin de extraer el polisacárido capsular a partir de él, comprendiendo dicho medio de cultivo al menos: - una fuente de carbono, - protoporfirina, - sales, - aminoácidos, - NAD o NADH, - vitaminas, - un medio para regular el pH, caracterizado por que dicho medio de cultivo está químicamente definido, y comprende al menos zinc, en una cantidad que corresponde a aquella comprendida entre 2,5 y 80 mg/L de ZnSO4, 7 H2O, y por que la relación PRP/LPS (en masa) es superior a aquella obtenida en un mismo medio que no contiene Zinc.

Description

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DESCRIPCIÓN

Método para producir antígenos de Haemophilus influenzae de tipo b

La presente invención se refiere a un proceso para producir, a escala industrial, polisacáridos capsulares de Haemophilus influenzae de tipo b (Hib), según el cual se cultiva una cepa de Hib en un medio de cultivo concreto, 5 cuya composición está químicamente definida y el cual, por lo tanto, no comprende una fuente compleja de nitrógeno ni de carbono.

La técnica anterior, y en particular la solicitud W2009/007641, describe un medio de cultivo mejorado para Haemophilus influenzae de tipo b, que no comprende ningún elemento procedente de una fuente animal, como se recomienda cuando el objetivo del cultivo de Haemophilus influenzae de tipo b es producir un polisacárido capsular

10 que se introducirá posteriormente como un antígeno en la composición de una vacuna. En el medio descrito en esta técnica anterior, la fuente de nitrógeno constituida normalmente por peptonas animales se reemplaza con peptonas vegetales.

Este tipo de medio representa un gran progreso desde el punto de vista de la seguridad de los productos farmacéuticos, en particular respecto a la eliminación del riesgo de transmisión de enfermedades tales como la

15 encefalitis espongiforme bovina; por lo tanto, estos medios hacen posible cumplir las recomendaciones de la autoridad sanitaria.

Sin embargo, la composición de las peptonas puede variar según los lotes proporcionados, lo que puede llevar a variaciones en las cantidades de bacterias producidas y también en los porcentajes de antígenos de interés, que los productores de vacunas tratan de limitar o corregir modificando ciertos parámetros durante la implementación del

20 proceso. Sin embargo, en el contexto de la producción industrial de un producto farmacéutico, es deseable poder disponer de procesos robustos que requieran el menor número de modificaciones posible en cada implementación y cuyos resultados a cada paso sean reproducibles de un lote al otro.

Este tipo de procesos también debe permitir rendimientos que sean compatibles con la rentabilidad industrial, donde el criterio no es, en el caso de la producción de antígenos a partir de bacterias, obtener únicamente la mayor

25 cantidad posible de bacterias, sino también obtener la mejor proporción entre el título de antígenos y la cantidad de bacterias producidas; por lo tanto, es deseable que la bacteria se cultive en condiciones que dirijan su metabolismo hacia la producción de un polisacárido capsular.

Con este objetivo, un objeto de la presente invención es un proceso para producir, a escala industrial, un polisacárido capsular de Haemophilus influenzae de tipo b (PRP) destinado a fines de vacunación, según el cual se

30 cultiva una cepa de Haemophilus influenzae de tipo b (Hib) en un medio de cultivo y el sobrenadante del cultivo se recolecta y se trata con el fin de extraer el polisacárido capsular a partir de él, comprendiendo dicho medio de cultivo al menos:

-una fuente de carbono,

-protoporfirina,

35 -sales, -aminoácidos, -NAD o NADH, -vitaminas, -un medio para regular el pH,

40 caracterizado por que dicho medio de cultivo está químicamente definido, y comprende al menos zinc, en una cantidad que corresponde a aquella comprendida entre 2,5 y 80 mg/L de ZnSO4, 7 H2O, y por que la relación PRP/LPS (en masa) es superior a aquella obtenida en un mismo medio que no contiene Zinc.

Gracias a la invención, es posible tanto disponer de un proceso industrial robusto como incrementar la producción de un polisacárido capsular, sin tener que incrementar en consecuencia la biomasa, lo que por lo tanto hace posible

45 reducir la cantidad de lipopolisacáridos (LPS) producidos respecto a la cantidad de PRP producido.

Además, la ausencia de proteínas en la composición del medio de cultivo reduce los requisitos necesarios desde el punto de vista de un producto antiespuma y simplifica el paso de purificación que hace posible obtener el antígeno constituido por el polisacárido capsular a partir del sobrenadante del cultivo.

Según la invención, el medio de cultivo comprende un medio regulador del pH. Estos medios reguladores del pH

50 pueden estar constituidos por sales tamponadas y/o un medio para medir el pH combinados con un medio para añadir tanto un ácido como una base al medio. Los rendimientos se pueden optimizar mediante la regulación del pH.

Según una realización, el proceso según la invención también consiste en conjugar el PRP producido con una proteína portadora, tal como la proteína del tétanos.

Un proceso para preparar una composición para una vacuna también es un objeto de la invención, según el cual:

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-se prepara un antígeno contra Haemophilus influenzae de tipo b (Hib), constituido por el polisacárido capsular (PRP), según el proceso de PRP de la invención, -el polisacárido capsular se conjuga con una proteína portadora.

Según una realización, el conjugado obtenido también se combina con al menos uno o más antígenos destinados

5 para la vacunación contra una o más de las siguientes infecciones: difteria, tétanos, polio, hepatitis B, varicela, paperas, rubeola, infecciones causadas por Neisseria meningitidis o Streptococcus pneumoniae, infecciones causadas por un rotavirus, con el fin de obtener una vacuna combinada que permita la inmunización simultánea contra varias enfermedades.

Según el proceso de la invención, el medio de cultivo está químicamente definido, es decir, se conoce la estructura

10 química y también la cantidad de cada uno de los componentes. Este tipo de medio está exento de una fuente compleja de nitrógeno o de carbono, tal como peptonas, caseínas, suero o similares y, por lo tanto, si se desea, se puede garantizar que no contiene elementos originados directamente a partir de un animal.

La invención se refiere a un proceso para producir, a escala industrial, un polisacárido capsular de Haemophilus influenzae de tipo b. Un proceso de este tipo permite obtener rendimientos de biomasa y de polisacáridos capsulares 15 o PRP que son compatibles con las restricciones industriales. Un proceso de este tipo permite, en particular, obtener, a partir de una cepa de Haemophilus influenzae de tipo b que tiene en su código genético al menos 2 copias del locus cap que codifica las funciones que permiten la síntesis capsular, sin una regulación particular del medio (tal como el pH o pO2), una biomasa correspondiente a una D.O. a 694 nm de al menos 2.4, tras 12 horas de cultivo, y una cantidad asociada de PRP de al menos 240 mg/litro de medio de cultivo. La determinación de la

20 cantidad de PRP producida se mide por medio de una cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con una técnica de detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD, por sus siglas en inglés) (Dionex) o un método que proporciona resultados equivalentes. Ventajosamente, el proceso según la invención permite obtener una cantidad de PRP de al menos 270 mg/litro de medio e, incluso más ventajosamente, una cantidad de al menos 300 mg/litro.

Entre las fuentes posibles de carbono, cabe mencionar todas aquellas que puedan ser metabolizadas por la cepa de

25 Haemophilus influenzae de tipo b y en particular: glucosa, fructosa, galactosa, glicerol, xilosa, ribosa, fucosa, ácido siálico y lactato. También es posible utilizar 2 o más fuentes diferentes, en particular, lactato y glucosa.

Según la invención, la cantidad de glucosa presente en el medio de partida está comprendida entre 5 y 25 g/L, más particularmente entre 10 y 20 g/L y más particularmente entre 12 y 16 g/L.

La cantidad de lactato presente en el medio de partida puede estar comprendida entre 0 y 15 g/L y más 30 particularmente entre 0.5 y 10 g/L.

Según una realización de la invención, la protoporfirina del medio es protoporfirina sintética, por ejemplo, la proporcionada por la compañía Sigma-Aldrich con la referencia 258385 (sal disódica de protoporfirina). Por lo tanto, es posible utilizar un medio del que se pueda garantizar que está totalmente exento de una sustancia de origen animal. Como alternativa, se utiliza protoporfirina IX sintética, cuya fórmula es la siguiente:

H3C imagen3

H3C COOR ROOC

35 donde R designa H, o un contraión, preferentemente un contraión de un metal alcalino, en particular sodio.

Una protoporfirina IX de este tipo, y el método para prepararla, se han descrito en la solicitud de patente FR 2 914

302.

Según la invención, la cantidad de protoporfirina presente en el medio de partida está comprendida ventajosamente 40 entre 0.1 y 10 mg/L y más particularmente entre 0.25 y 2 mg/L.

imagen4

El medio de cultivo según el proceso de la invención comprende sales que proporcionan los minerales necesarios para el crecimiento celular, lo que permite asegurar una presión osmótica favorable para la bacteria y que también ejerce una capacidad tamponante sobre el pH.

Preferentemente, se utiliza una mezcla de cationes monovalentes tales como Na+ y/o K+, de cationes divalentes tales

5 como Ca++, Mg++, Co++, Zn++, Mn++, Fe++ , de aniones fosfato en forma de HPO4--, H2PO4-y/o PO4---y de aniones SO4--y Cl-en forma de soluciones salinas, donde las molaridades de cada una de ellas pueden variar normalmente en un intervalo de concentración comprendido entre 10-4 mM y 1000 mM.

Las sales presentes en el medio de cultivo se escogen en particular entre:

K2HPO4; KH2PO4; MgSO4, 7 H2O; Na2HPO4, 12 H2O; NaH2PO4, 2 H2O; CaCl2, 2 H2O; FeSO4, 7 H2O; ZnSO4, 7 H2O; 10 CoCl2, 6 H2O; MnSO4, H2O.

Las concentraciones salinas se escogen con el fin de tener una osmolaridad comprendida entre 200 y 700 miliosmol/L, en particular entre 300 y 400 miliosmol/L, especialmente 350 miliosmol/L y un pH comprendido en el intervalo de 6.5 a 7.5.

Por esto, el medio de cultivo según el proceso de la invención puede comprender en particular:

15 -MgSO4. 7 H2O con una concentración comprendida entre 150 y 1500 mg/L, -CaCl2. 2 H2O con una concentración comprendida entre 6.5 y 52 mg/L, -FeSO4. 7 H2O con una concentración comprendida entre 1.25 y 10 mg/L, -ZnSO4. 7 H2O con una concentración comprendida entre 2.5 y 80 mg/L, -CoCl2. 6 H2O comprendido entre 0.5 y 2 mg/L,

20 -MnSO4. H2O comprendido entre 2.5 y 10 mg/L, -sodio, en particular en forma de lactato de sodio al 60% en una cantidad comprendida entre 0 y 4 mL/L, -K2HPO4 y KH2PO4 con una concentración para cada uno de ellos comprendida entre 100 y 1200 mg/litro cuando

el efecto tamponante lo proporciona Na2HPO4.12 H2O /NaH2PO4. 2 H2O, -Na2HPO4.12 H2O con una concentración comprendida entre 15 y 120 g/L, 25 -NaH2PO4. 2 H2O con una concentración entre 10 y 30 veces inferior a la de Na2HPO4.12 H2O.

Como alternativa, es posible que el efecto tamponante lo proporcione el par K2HPO4 / KH2PO4; en este caso, la concentración de K2HPO4 está comprendida entre 15 y 120 g/L y la concentración de KH2PO4 es entre 10 y 30 veces inferior que la de K2HPO4; la concentración de Na2HPO4.12 H2O y de NaH2PO4. 2 H2O puede estar entonces entre 100 y 1200 mg/litro.

30 Entre las sales mencionadas, se puede señalar que la presencia de zinc es particularmente ventajosa para la producción de biomasa y de PRP, en particular en una concentración comprendida en el intervalo entre 2.5 y 80 mg/L o, más particularmente, entre 5 y 20 mg/L. Se han obtenido resultados muy buenos con una concentración de 20 mg/L.

En el caso en el que el pH del medio de cultivo se regula durante la fase de cultivo mediante la adición en particular

35 de una base sumamente concentrada tal como NaOH o KOH, es posible reducir la cantidad de sales presente en el medio y, en particular, la cantidad de los pares tamponantes Na2HPO4/NaH2PO4, o K2HPO4/KH2PO4 siempre que, sin embargo, la osmolarid se mantenga en un valor adecuado, es decir, entre 200 y 700 mOsm/L, mediante una adición opcional de NaCl.

Según el proceso de la invención, el medio de cultivo también comprende NAD o una fuente de NAD o de cualquier

40 otra coenzima equivalente. NAD (o dinucleótido de β-nicotinamida y adenina), también denominado coenzima I o factor V, es un factor de crecimiento esencial para el cultivo de Haemophilus influenzae de tipo b. Está ventajosamente presente con una concentración comprendida entre 0.5 y 50 mg/L y, más particularmente, entre 2 y 10 mg/L, en particular 5 mg/L de medio de cultivo. Se puede introducir en el medio como NADH, su forma reducida. Como alternativa al NAD, el medio de cultivo según la invención puede comprender elementos precursores de NAD

45 que las bacterias serán capaces de utilizar, tales como NADP/NADPH (fosfato de dinucleótido de β-nicotinamida y adenina) o NMN (mononucleótido de β-nicotinamida y adenina) o NR (ribósido de nicotinamida), dinucleótido de 3acetilpiridina y adenina (APAD) o mononucleótido de 3-acetilpiridina (APMN).

Según el proceso de la invención, el medio de cultivo contiene aminoácidos que se escogen ventajosamente entre: arginina, alanina, lisina, histidina, triptófano, valina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, cistina (o un

50 equivalente), asparagina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico.

Una formulación del medio de cultivo comprende únicamente arginina, alanina, histidina, triptófano, tirosina, fenilalanina, cistina, ácido aspártico y ácido glutámico. Como alternativa, todos los aminoácidos mencionados están presentes en el medio de cultivo.

Según un modo particular de la invención, la cistina se reemplaza con glutatión o cisteína.

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Según una realización preferida, el proceso según la invención utiliza un medio de cultivo exento de los siguientes aminoácidos: L-metionina, L-glicina, L-prolina, L-serina y L-treonina. Esto se debe a que la presencia de estos aminoácidos da como resultado un incremento en la biomasa, pero no el incremento correspondiente en la producción de PRP.

5 Sigma suministra los aminoácidos suministrados en forma de polvos muy puros. De manera particularmente ventajosa, estos aminoácidos tienen un origen sintético o se han obtenido gracias a procesos que garantizan el hecho de que no contienen ningún elemento originado directamente a partir de un animal, con el fin de excluir cualquier riesgo de contaminación por infecciones transmisibles y, en particular, por BSE (siglas en inglés de la encefalitis espongiforme bovina).

10 Las cantidades de cada aminoácido se escogen con el fin de optimizar el crecimiento celular y la producción de PRP. Las cantidades de ácido aspártico, de asparagina y de glutamina se escogen de modo que causen una deficiencia durante el cultivo celular, para permitir de esta manera dirigir el metabolismo de la célula hacia la producción del polisacárido capsular, mientras que las cantidades de los otros aminoácidos se escogen de modo que no haya deficiencia durante la fase de cultivo.

15 Según el proceso de la invención, el medio de cultivo también contiene vitaminas que se escogen entre: tiamina, pantotenato, uracilo, hipoxantina, biotina, riboflavina y piridoxina. A efectos de la invención, el término "vitaminas" también engloba uracilo e hipoxantina, que son bases nitrogenadas.

De manera particularmente ventajosa, las vitaminas presentes en el medio de cultivo tienen un origen no animal, en particular, un origen sintético, para permitir de esta manera excluir cualquier riesgo de contaminación por infecciones

20 transmisibles y, en particular, por BSE (encefalitis espongiforme bovina). Se utilizan, en particular, vitaminas suministradas por Sigma, cuyo grado de pureza se conoce con exactitud, lo que permite de este modo una dosificación muy exacta durante la preparación del medio de cultivo.

Las cantidades de vitaminas presentes en el medio se escogen con el fin de optimizar la producción de biomasa y de PRP.

25 Según un modo particular de la invención, el medio de cultivo comprende citrulina que se puede sustituir por arginina y por uracilo.

En este caso, la cantidad de citrulina incluida en el medio de cultivo está comprendida ventajosamente entre 150 y 500 mg/L.

Gracias al medio de cultivo según el proceso de la invención, ha sido posible producir fosfato de polirribosil-ribitol en

30 una cantidad mayor que cuando se utiliza un medio según la técnica anterior, a la vez que no se consumen más carbohidratos, y no se producen más contaminantes, en particular LPS.

Según una realización de la invención, la cepa de Haemophilus influenzae de tipo b cultivada es una cepa encapsulada que tiene al menos 2 copias del locus cap en su código genético. Este locus cap, con un tamaño comprendido entre 17 y 18 kb, agrupa genes cuya expresión está ligada a la síntesis y exportación de la cápsula.

35 La expresión de la cápsula proporciona a la bacteria un color blanco cuando se cultiva en un agar específico; las colonias de bacterias que tienen este locus cap se denominan en consecuencia "colonias blancas", mientras que las bacterias que no exportan el polisacárido capsular a la superficie de la cápsula se denominan "colonias grises". La expresión de la cápsula está sometida a una inestabilidad genética potencial, que puede conducir a la aparición de mutantes deficientes en la cápsula, lo que conllevaría, en consecuencia, a un descenso en la producción de PRP.

40 Los estudios han permitido demostrar que el medio definido químicamente utilizado en el proceso según la invención permite asegurar una buena estabilidad genética de la cepa utilizada durante aproximadamente veinte generaciones celulares.

Según la invención, es posible realizar el cultivo de la bacteria de Haemophilus influenzae de tipo b en varios pasos sucesivos de modo que se incremente gradualmente la biomasa.

45 En este caso, las bacterias que se originan a partir de una muestra liofilizada o congelada se inoculan en volumen de medio que generalmente no excede 1 litro. Después de cultivar toda la noche o cuando la densidad óptica del medio es suficiente, este primer cultivo se transfiere a un segundo medio de cultivo idéntico al primero, pero cuyo volumen puede ser hasta 10-20 superior. La cantidad de bacterias inoculadas en el segundo medio se ajusta de modo que la densidad óptica (D.O.) inicial del segundo medio de cultivo a 694 nm esté comprendida entre 0.2 y 0.4,

50 de modo que se favorezca un rápido crecimiento de la población bacteriana. Este segundo cultivo se realiza normalmente en un fermentador, pero se pueden utilizar otros tipos de recipientes (matraces, recipientes de agitación, etc). Cuando el cultivo se realiza en un fermentador, normalmente se utilizan una temperatura de 37 ºC +/1 ºC, agitación constante, una presión de 0.1 bar, una pO2 de un 30% y un caudal de aire de 0.25 volúmenes de gas por volumen de medio por minuto durante la duración del cultivo. Está dentro de la competencia de los expertos en

55 la técnica la elección de otros parámetros para este tipo de cultivo. Al final de la fase de crecimiento bacteriano exponencial, la biomasa se puede amplificar adicionalmente transfiriéndola a otro fermentador de mayor capacidad utilizando el mismo procedimiento y así sucesivamente. Los volúmenes de cultivo obtenidos pueden alcanzar, o incluso exceder, los 1000 litros. El cultivo o cultivos se realizan generalmente según el modo "discontinuo".

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Finalmente, se toma el sobrenadante del cultivo final tras la inactivación de las bacterias. La inactivación se lleva a cabo habitualmente utilizando una solución de formol con una concentración final de un 0.35%-0.37% (v/v). El

5 sobrenadante se separa habitualmente de la bacteria por medio de un paso de centrifugación. El PRP contenido en el sobrenadante resultante se extrae a continuación y se purifica según procesos habituales muy conocidos por los expertos en la técnica.

El PRP recolectado y purificado se conjuga ventajosamente a continuación a una proteína portadora tal como la proteína del tétanos, con el fin de convertirlo en dependiente de los linfocitos T y de hacer posible, en particular, la

10 inmunización de niños pequeños. El antígeno PRP-T obtenido de esta manera se puede utilizar a continuación solo en una vacuna monovalente o combinado con otros antígenos con el fin de hacer posible la vacunación simultánea contra varias enfermedades.

De manera particularmente ventajosa, la presente invención proporciona un proceso para preparar una composición para una vacuna, según la cual el conjugado obtenido se combina con al menos uno o más antígenos presentes

15 normalmente en vacunas pediátricas y, en particular, antígenos contra la difteria, tétanos, poliomielitis, hepatitis B, infecciones causadas por Neisseria meningitidis o por Streptococcus pneumoniae, varicela, paperas, rubeola, infecciones causadas por un rotavirus, etc.

Según una realización, el conjugado PRP-T está presente en forma de polvo, mientras que otros antígenos están en forma líquida, mezclándose todos los antígenos de manera improvisada antes de la administración; según una

20 realización alternativa, la composición para la vacuna es enteramente líquida.

El proceso de preparación según la invención permite de esta manera preparar una combinación para una vacuna cuadrivalente que comprende, además del conjugado PRP-T, antígenos de la difteria, tétanos y hepatitis B. Como alternativa, permite preparar una combinación para una vacuna cuadrivalente que comprende, además del conjugado PRP-T, el toxoide diftérico, toxoide tetánico y 2 antígenos acelulares de Bordetella pertussis (toxoide y

25 hemaglutinina filamentosa) o 3 antígenos acelulares de Bordetella pertussis (los dos anteriores + pertactina) o además 5 antígenos acelulares de Bordetella pertussis (los tres anteriores + los aglutinógenos).

También permite preparar una combinación para una vacuna pentavalente que comprende, además del conjugado PRP-T, el toxoide diftérico, el toxoide tetánico, 2, 3 o 5 antígenos acelulares de Bordetella pertussis y también poliovirus inactivados de tipo 1, 2 y 3.

30 También permite preparar una combinación para una vacuna hexavalente que comprende, además del conjugado PRP-T, el toxoide diftérico, el toxoide tetánico, 2, 3 o 5 antígenos acelulares de Bordetella pertussis, hepatitis B y también poliovirus inactivados de tipo 1, 2 y 3. Una combinación hexavalente de este tipo puede, en particular, ser líquida y puede comprender, por 0.5 mL de dosis:

-el toxoide diftérico en una cantidad de 20 IU,

35 -el toxoide tetánico en una cantidad de 40 IU, -el antígeno superficial de la hepatitis B en una proporción de 10 µg, -el toxoide de pertussis en una proporción de 25 µg, -la hemaglutinina filamentosa de pertussis en una proporción de 25 µg, -PRP-T en una proporción de 12 µg de PRP,

40 -poliovirus inactivados de tipo 1, 2 y 3 en una cantidad respectiva de 40, 8 y 32 DU -hidróxido de aluminio en una proporción de 0.6 mg de Al3+ .

Como alternativa, permite preparar combinaciones para vacunas en las que los antígenos de la tosferina están constituidos por la bacteria Bordetella pertussis íntegra.

Gracias al proceso del cultivo según la invención, es posible incrementar la producción de fosfato de polirribosil

45 ribitol, sin incrementar la cantidad de biomasa, para permitir de esta manera reducir la cantidad de LPS contaminantes; esta ventaja del proceso según la invención es muy importante para la industria de las vacunas, donde estos productos se introducen en composiciones para vacunas como antígenos y donde las cantidades de LPS se deben reducir al mínimo. El disponer de un proceso que permite no incrementar la cantidad de LPS producida por una cantidad mayor de PRP ofrece la posibilidad de simplificar el proceso de purificación posterior.

50 Ejemplo 1: Preparación de un medio de cultivo según el proceso de la invención

Se preparó un medio de cultivo según el proceso de la invención a partir de medio básico al cual se añadieron de manera improvisada soluciones de enriquecimiento.

La composición del medio básico se indica en la tabla I a continuación:

Tabla I: Para preparar 1 litro de medio, se añadieron diversos compuestos, en el orden descrito en la tabla anterior, a aproximadamente 100 mL de agua desmineralizada, con agitación utilizando una barra magnética. Antes de la adición, todos los polvos se habían disuelto previamente en un pequeño volumen de agua desmineralizada, en ciertos casos, con la adición de ácido o base.

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Compuestos: Cantidades en mg para 1 L proveedor ref. del producto

lactato de sodio al 60%: 1.5 mL Prolabo 27925.292

K2HPO4: 300 VWR Prolabo 26931.263

KH2PO4: 300 VWR Prolabo 26923.298

MgSO4.7H2O: 368 VWR Prolabo 25165.260

Na2HPO4. 12H2O: 28620 VWR Prolabo 28028.298

NaH2PO4. 2H2O: 1870 VWR Prolabo 28015.294

L-Arginina: 87 Sigma A5006 o A8094

L-Alanina: 134 Sigma A7627 o A7469 o A4349

L-Asparagina: 198 Sigma A0884 o A7094

L-Lisina: 140 Sigma L5626 o L8662 o L7039

L-Glutamina: 220 Sigma G3126 o G8540 o G5792

L-Histidina: 78 Sigma H8000 o H6034 o H3911

L-Triptófano: 200 Sigma T0254 o T8941 o T4196

L-Valina: 115 Sigma V0500 o V0513 o V4638

L-Isoleucina: 130 Sigma I2752 o I7403 o I5281

L-Leucina: 130 Sigma L8000 o L6914 o L8912

L-Tirosina: 180 Sigma T3754 o T8566 o T4321

L-Fenilalanina: 165 Sigma P5482

L-Cistina: 61 Sigma C8755 o C7602 o C5735

Ácido L-aspártico: 1065 Sigma A9256 o A5474

Ácido L-glutámico: 1471 Sigma G1251 o G8415

Piridoxina·HCl: 4 Sigma P5669

Riboflavina: 0.2 Sigma R4500

Tiamina·HCl: 4 Sigma T4625

Biotina: 4 Sigma B4501

Ca pantotenato: 4.5 Sigma P5710

Uracilo: 70 Sigma U0750

Hipoxantina: 20 Sigma H9377

FeSO4.7H2O: 2.5 Aldrich 450278

ZnSO4.7H2O: 5 Sigma Z4750

CoCl2 . 6H2O: 1 Fluka 60818

MnSO4. H2O: 5 Sigma M7634

CaCl2 . 2H2O: 13 Panreac 131232.1211

5 Por lo tanto, para la valina, isoleucina y leucina, fue necesario añadir, a las cantidades indicadas en la tabla, 140 µL de KOH 10 N; a la tirosina, fue necesario añadir 280 µL de KOH 10 N; a la fenialanina, fue necesario añadir 210 µL de HCl al 37% y a la cistina fue necesario añadir 70 µL de HCl al 37%.

Finalmente, se ajustó el pH a 7.2 ± 0.1 con KOH 10 N (en caso de que el pH hubiera sido demasiado elevado, se habría utilizado HCl al 37%), a continuación se utilizó agua desmineralizada para alcanzar el volumen deseado.

10 A continuación se esterilizó el medio mediante una filtración sobre un filtro que tenía un valor de corte de 0.22 µm.

De este modo fue posible almacenar el medio durante 72 horas a 5 ºC.

Antes de la inoculación del medio, se añadió lo siguiente:

-27.3 mL de glucosa con 512.8 g/L preparada a partir de D(+)-glucosa anhidra suministrada por la compañía VWR con la referencia 24379.294,

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-5 mL de una solución de NAD con 1 g/L, suministrada por la compañía Sigma con el nombre dinucleótido de βnicotinamida y adenina hidratado (ref. 43410), -4 mL de una solución madre que comprendía protoporfirina con una concentración de 0.25 g/L e hidróxido de amonio con una concentración de 5 mL/L; donde la compañía Sigma Aldrich suministró la protoporfirina con el nombre de sal disódica de protoporfirina IX (ref. 258385) y la compañía VWR el hidróxido de amonio con el nombre de solución de amoniaco al 28% (ref. 21190.292),

con el fin de obtener 1 litro de medio listo para ser inoculado y que comprendía, además de los elementos descritos en la tabla I anterior, los siguientes elementos adicionales con las concentraciones indicadas en la siguiente tabla II:

Tabla II:

Compuestos: Concentración antes de la inoculación en el medio

Protoporfirina: 1 mg/L

Amoniaco acuoso: 17.7 mg/L

Glucosa anhidra: 14 g/L

NAD: 5 mg/L

10 Ejemplo 2: Preparación de un medio de cultivo según la técnica anterior

Se preparó un medio de cultivo según la técnica anterior añadiendo soluciones de enriquecimiento específicas a un medio básico. La composición del medio básico se indica en la tabla III a continuación: Tabla III:

Compuestos: Concentración en el medio básico

Peptona de guisante: 7.42 g/L

Lactato de sodio al 60%: 1.5 mL/L

Na2HPO4.12H2O: 31.14 g/L

NaH2PO4. 2H2O: 2.03 g/L

Cistina (L): 0.07 g/L

HCl (10 N): 0.07 mL/L

Triptófano (L): 0.02 g/L

(NH4)2SO4: 1 g/L

MgSO4. 7H2O: 0.4 g/L

CaCl2 . 2H2O: 0.02 g/L

15 Para preparar este medio básico, se añadió cada uno de los elementos, en el orden en el que se indican en la tabla, a 100 mL de agua desmineralizada agitada de manera continua utilizando una barra magnética. Cada uno de los elementos, suministrado en forma de polvo, se había disuelto previamente en un volumen pequeño de agua desmineralizada.

La peptona de guisante procede de la compañía Kerry y se comercializa con la referencia Hy-pea 7404. El

20 (NH4)2SO4 lo suministra la compañía VWR con la referencia 21333.296. Los otros elementos proceden de los mismos proveedores y se suministran con las mismas referencias que aquellas descritas en el ejemplo 1 para la preparación del medio según el proceso de la invención.

El pH final se ajustó a 7.2 ± 0.1 con KOH 10 N (en caso de que el pH hubiera sido demasiado elevado, se habría utilizado HCl al 37%).

25 A continuación se añadió agua desmineralizada con el fin de obtener el volumen deseado y a continuación se esterilizó por autoclavado, según un ciclo de 30 minutos a 120 ºC.

Una vez esterilizado, el medio se pudo almacenar durante 15 días a 4 ºC.

Las soluciones de enriquecimiento A, B, C y D se añadieron a este medio básico.

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La solución A es una solución que comprende glucosa anhidra con la concentración de 512.8 g/L, suministrada por la compañía VWR con el nombre de D(+)-glucosa anhidra (ref. 24379.294).

La solución B es una solución madre que comprende NAD con la concentración de 1 g/L, suministrada por la compañía Sigma con el nombre de dinucleótido de β-nicotinamida y adenina hidratado (ref. 43410).

5 La solución C es una solución madre que comprende protoporfirina con la concentración de 0.25 g/L e hidróxido de amonio con la concentración de 5 mL/L; donde la compañía Sigma Aldrich suministró la protoporfirina con el nombre de sal disódica de protoporfirina IX (ref. 258385) y la compañía VWR el hidróxido de amonio con el nombre de solución de amoniaco al 28% (ref. 21190.292).

La solución D es una solución concentrada que comprende un ultrafiltrado de un extracto de levadura autolítico

10 (Ufel) con 125 g/L; lo suministra la compañía Biospringer con el nombre Ultrafiltrat d’extrait autolytique de levure (Ufel) [Ultrafiltrado de extracto de levadura autolítico] (Ref. de springer 0701).

Cada una de estas soluciones se esterilizó por filtración en un filtro cuyo valor de corte fue de 0.22 µm.

Se añadió lo siguiente a 1 litro de medio básico:

-35.1 mL de solución A

15 -5 mL de solución B

-4 mL de solución C

-40 mL de solución D.

La adición de cada una de estas soluciones al medio básico se llevó a cabo en una campana de flujo laminar y dio como resultado un medio de cultivo que tenía, antes de la inoculación, además de los elementos mencionados en la

20 tabla III anterior, los siguientes elementos adicionales en la concentración indicada en la siguiente tabla IV:

Tabla IV:

Compuestos: Concentración antes de la inoculación en el medio

Ultrafiltrado de extracto de levadura autolítico (Ufel): 4.9 g/L

Protoporfirina: 1 mg/L

Amoniaco acuoso: 17.7 µg/L

Glucosa anhidra: 18 g/L

NAD: 5 mg/L

Ejemplo 3: Comparación de la producción de PRP con un medio según el proceso de la invención como el descrito en el ejemplo 1 y un medio de la técnica anterior como el descrito en el ejemplo 2

Estos experimentos comparativos se llevaron a cabo según un protocolo de cultivo de 2 pasos:

25 -un paso de precultivo en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1 litro sin deflectores, a 36 ºC con agitación a 130 rpm (revoluciones por minuto), durante un periodo de 8 horas, al final del cual la cepa está al final de la fase de crecimiento lineal; este precultivo se inicia inoculando 280 mL de medio de cultivo con un inóculo de bacterias de Haemophilus influenzae de tipo b que contiene al menos 2 copias del locus cap, con una concentración de un 0.5% (volumen/volumen);

30 -a continuación una transferencia de 90 mL del precultivo permitió inocular un fermentador Biostat B plus de 2 litros que contenía 1.8 litros de medio de cultivo. Este fermentador se mantuvo a 37 ºC, con una agitación de 400 rpm, con una aireación de 0.45 lpm (litros por minuto) durante 12 horas.

Tras 12 horas de cultivo, se midió la D.O. a 694 nm, lo que permitió determinar la biomasa. Esto es debido a que, durante ensayos previos, fue posible determinar que una unidad de densidad óptica medida a 694 nm correspondía

35 a 0.64 g de biomasa (masa seca)/litro.

La cantidad de PRP total en el sobrenadante del cultivo se determinó mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con una detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD), según un método muy similar al descrito en la publicación de Sturgess et al. (Vaccine 17 (1999) 1169-1178). Se filtró el sobrenadante del cultivo haciéndolo pasar a través de un filtro de 0.22 µm y a continuación se ultrafiltraron 500 µL del sobrenadante mediante

40 la utilización de ultracolumnas Amicon con un valor de corte de 10 kDa (ref. de Millipore UFC5010BK) y a continuación se sometieron a un paso de hidrólisis básica añadiendo NaOH.

La hidrólisis se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 4 horas como mínimo.

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Se controló la validez del ensayo utilizando un patrón interno, glucosamina-1-fosfato (GlcN1P), presente en la solución de hidrólisis, y haciendo pasar regularmente un control interno que tenía una concentración de PRP conocida. Con relación a las indicaciones de Sturgess et al., la fase móvil estuvo compuesta de NaOH 35 mM y CH3COONa 114 mM y la fase de regeneración se llevó a cabo durante 10 minutos con NaOH 100 mM y CH3COONa 400 mM.

Los resultados obtenidos se indican en la siguiente tabla V:

Tabla V:

Medio según la invención (4 ensayos): Medio de la técnica anterior (1 ensayo)

D.O. a 694 nm: 2.52 ± 0.14 3.9

Biomasa en g de masa seca/litro de medio de cultivo: 1.74 ± 0.09 2.6

Concentración de PRP en mg/litro de medio de cultivo: 349 ± 22 169

Producción específica en mg de PRP/g de biomasa: 199 ± 3 66

Los resultados muestran la ventaja del proceso según la invención para la productividad de PRP: en efecto se señala que, para el mismo volumen del medio de cultivo, aunque la biomasa obtenida fue mayor con un medio de

10 cultivo según la técnica anterior, la cantidad de PRP fue, por otra parte, menor.

Ejemplo 4: Comparación de la cantidad de PRP y de LPS presente en un sobrenadante del cultivo según el proceso de la invención y en un sobrenadante de cultivo según un proceso de la técnica anterior

El cultivo de Haemophilus influenzae de tipo b se llevó a cabo de manera comparativa con un medio según el proceso de la invención y con un medio según la técnica anterior, en el modo descrito en el ejemplo 3 con la

15 diferencia, sin embargo, de que el medio básico del proceso según la técnica anterior comprendió 10 g/L de un hidrolizado ácido de caseína suministrado por la compañía Solabia (ref. A1434) en lugar de la peptona de guisante presente en el medio según el ejemplo 3.

El tiempo de precultivo es, como en el ejemplo 3, de 8 horas y el tiempo de cultivo es de 12 horas.

Tanto la realización del ensayo de PRP como la realización del ensayo de LPS se llevaron a cabo por HPAEC-PAD;

20 pero la realización del ensayo de LPS se llevó a cabo por la cuantificación de un monosacárido particular, heptosa, utilizando un intervalo patrón de LPS purificado que se había sometido al mismo protocolo y donde el control interno para este ensayo fue rhamnosa.

Los resultados obtenidos se indican en la siguiente tabla VI:

Tabla VI:

Medio según la invención (4 ensayos): Medio según la técnica anterior (3 ensayos)

DO a 694 nm: 2.5 ± 0.1 3.9 ± 0.3

Biomasa en g de masa seca/litro de medio: 1.7 ± 0.1 2.5 ± 0.2

Concentración de LPS en mg/L de medio: 5 ± 1 4.6 ± 1

Concentración de PRP en mg/L de medio: 349 ± 22 17 ± 5

Relación PRP/LPS: 74 ± 15 38 ± 6

25 Los resultados obtenidos muestran la ventaja del proceso según la invención, lo que permite reducir la cantidad de

LPS producida respecto a la cantidad de PRP. Esto representa una ventaja significativa del proceso según la invención, ya que simplifica en gran medida las operaciones de purificación, a la vez que mantiene al mismo tiempo un nivel apropiado de seguridad.

Ejemplo 5: Ensayo para evaluar la importancia del zinc

30 Se estudió la importancia de la presencia de zinc en el medio de cultivo. A este efecto, se compararon 3 medios: -un medio tal como el descrito en el ejemplo 1, denominado MS,

-un medio que tiene una composición idéntica a la del ejemplo 1, pero sin ZnSO4, denominado MS Zn-,

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-un medio tal como el descrito en el ejemplo 1, pero con una concentración de ZnSO4 que es 4 veces superior, es decir, de 20 mg/L, denominándose dicho medio Ms Zn++.

A continuación se esterilizaron los medios mediante una filtración sobre un filtro que tenía un valor de corte de 0.22 µm.

5 En primer lugar, se llevó a cabo un paso de precultivo en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1 litro sin deflectores durante 16 horas a 36 ºC agitando a 130 rpm, inoculando 280 mL de un medio como el descrito en el ejemplo 4 con una muestra congelada de una bacteria de Haemophilus influenzae de tipo b que tenía en el código genético al menos 2 copias del locus cap.

A continuación se lavaron 9.5 mL del precultivo en cada uno de los medios de cultivo que se iban a someter a

10 ensayo, antes de la inoculación para el cultivo que se realizó cada vez en un matraz Erlenmeyer de policarbonato de 500 mL con deflectores que contenía 170 mL de medio de cultivo que se iba a someter a ensayo; el cultivo se realizó durante 12 horas a 37 ºC y la agitación se realizó a 150 rpm.

Para cada medio se determinaron la biomasa, la concentración de PRP y también la cantidad de LPS al final del cultivo, del mismo modo descrito en los ejemplos 3 y 4 y se calcularon las relaciones PRP/biomasa y también

15 LPS/biomasa y PRP/LPS.

Los resultados obtenidos se indican en la siguiente tabla VII:

Tabla VII:

MS: MS Zn- MS Zn++

Biomasa en g de masa seca/litro de medio de cultivo: 1.98 1.23 2.22

Concentración de PRP en mg/litro de medio de cultivo: 319 203 372

Producción específica en mg de PRP/g de biomasa: 160 165 167

Concentración de LPS en mg/litro de medio de cultivo: 11.5 8.8 12.1

Relación LPS/biomasa en mg/g de biomasa: 6.1 7.2 5.5

Relación PRP/LPS en mg/mg: 30 23 31

Estos resultados mostraron que la presencia de zinc en el medio de cultivo permite incrementar significativamente la producción de biomasa y también la producción de PRP pero sin incrementar proporcionalmente la cantidad de LPS.

20 Ejemplo 6: Ensayos en un fermentador de 5 litros

El cultivo de Haemophilus influenzae de tipo b se llevó a cabo en el medio de cultivo descrito según la invención en el ejemplo 1, utilizando únicamente productos que los proveedores garantizaban que estaban exentos de componentes animales y utilizando protoporfirina sintética como se describe en la solicitud de patente FR 2 914 302 y suministrada por la compañía Solvias AG con el nombre: Sal disódica de protoporfirina IX (ref. SOL20402). Los

25 ensayos se llevaron a cabo en el modo descrito en el ejemplo 3, con la excepción de que los fermentadores utilizados fueron fermentadores de 5 litros regulados a 37 ºC, con agitación a 550 rpm y aireación a 0.5 lpm. El volumen de inóculo fue entonces de 280 mL, es decir, el precultivo íntegro del matraz Erlenmeyer.

La concentración de PRP y LPS se determinó según los protocolos descritos en los ejemplos 3 y 4.

Los resultados obtenidos se indican en la siguiente tabla VIII:

30 Tabla VIII:

Medio exento de componentes animales según la invención

D.O. a 694 nm: 3.58

Biomasa en g de masa seca/litro de medio: 2.29

Concentración de PRP en mg/L de medio: 567

Producción específica en mg de PRP/g de biomasa: 247

Estos resultados confirman los resultados anteriores y muestran la ventaja del proceso según la invención para obtener una gran cantidad de PRP.

Ejemplo 7: Comparación de la producción de biomasa y de PRP con un medido según la invención como el descrito en el ejemplo 1 y con un medio químicamente definido como el descrito en la técnica anterior

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El cultivo de Haemophilus influenzae de tipo b se llevó a cabo en el medio de cultivo descrito según la invención en el ejemplo 1 y también en 8 medios descritos en publicaciones relacionadas con el cultivo de Haemophilus influenzae y presentadas como químicamente definidas.

Estos 8 medios se prepararon según las recomendaciones de los autores. Son, en orden cronológico, los medios de:

5 -Talmadge y Herriott: Biochemical and Biophysical Research Communications, (marzo de 1960), vol.2 N.°3, págs. 203-206), -Butler: J. gen. Microbiol. (1962), 27, 51-60, -Wolin: J. Bacteriol. vol.85, (1963) notas, págs. 253-254, -Herriott et al. : Journal of Bacteriology, (febrero de 1970), vol. 101, N.°2, 513-516, 10 -Klein y Luginbuhl: Journal of General Microbiology (1979), 113, 409-411, -Coleman et al. : Journal of Clinical Microbiology, (septiembre de 2003), vol.41, N.°9 págs. 4408-4410.

Las referencias de los productos utilizados para preparar estos 8 medios se reproducen en la siguiente tabla IX:

Tabla IX:

Productos: Proveed ores ref. del producto

Uridina: Sigma U3003

Inosina: Sigma I4125

Adenosina: Sigma A4036

Guanina: Sigma G6779

Guanosina: Sigma G6264

Vitamina B12: Sigma V2876

Citrulina: Sigma C7629

Cloruro de colina: Fluka 26978

Timidina: Sigma T9250

Inositol: Sigma I5125

Dihidroclorhidrato de putrescina: Sigma P5780

Nicotinamida: Sigma N0636

Hematina porcina: Sigma H3281

Hemina: Fluka 51280

Oleato de sodio: Sigma O7501

Acetato de sodio: Fluka 71185

Ácido fólico: Sigma F7876

Alcohol polivinílico: Sigma 341584

Trietanolamina: Sigma 90278

Tampón de glicilglicina: Libios B-GLYGLY250

Tween 40: Sigma P1504

Tween 80: Sigma P1754

Tampón Tris: VWR 33621.260

etilendiaminotetraacetato: VWR 20302.180

HEPES: Sigma H3375

Glutatión: Sigma G6013

Adenina: Sigma A8626

Prolina: Sigma P0380

Treonina: Sigma T8625

Glicina: Sigma G7126

Metionina: Sigma M9625

Serina: Sigma S4500

Glicerol: VWR 24387.292

K2SO4: VWR 26994.293

KCl: VWR 26764.298

MgCl2. 6H2O: Panreac 131396.1211

NaCl: VWR 27810.295

NaHCO3: VWR 27778.260

NH4Cl: VWR 21236.291

RMPI 1640 con L-glutamina y HEPES 25 mM: Invitrogen ref. anterior citada en la publicación de Coleman (2003) ref. 61870036 => nueva ref. 52400025

Piruvato de sodio MEM 100 mM: Invitrogen ref. anterior citada en la publicación de Coleman (2003) ref. 11360070 => nueva ref. 11360039

En primer lugar, se llevó a cabo un paso de precultivo en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1 litro sin deflectores durante 16 horas a 36 ºC agitando a 130 rpm, inoculando 280 mL de un medio como el descrito en el ejemplo 4 con 5 una muestra congelada de una bacteria de Haemophilus influenzae de tipo b que tenía en el código genético al menos 2 copias del locus cap.

A continuación se lavaron 9.5 mL del precultivo en cada uno de los medios de cultivo que se iban a someter a ensayo, antes de la inoculación para el cultivo que se realizó cada vez en un matraz Erlenmeyer de policarbonato de 500 mL con deflectores que contenía 170 mL de medio de cultivo que se iba a someter a ensayo; el cultivo se realizó

10 durante 12 horas a 37 ºC y se agitó a 150 rpm.

Cada ensayo se llevó a cabo al menos 3 veces.

Para cada medio, se midió cada hora la D.O. a 694 nm y se determinó la concentración de PRP al final del cultivo, del mismo modo descrito en el ejemplo 3.

Los resultados de la D.O. se reproducen en la figura 1.

15 Los resultados de las determinaciones de PRP se indican en la siguiente tabla X:

Tabla X:

a las 12 h: D.O. a 694 nm PRP (mg/L)

Medio según la invención: 2.86 ± 0.12 320 ± 15

Talmadge: 0.28 ± 0.10 20 ± 1

Butler: 0.04 ± 0.00 2 ± 0

Wolin: 0.04 ± 0.00 6 ± 0

Herriot Mic-cit: 1.26 ± 0.15 138 ± 7

Herriot Mic: 0.98 ± 0.13 101 ± 5

Klein MMA (cit): 0.38 ± 0.01 40 ± 2

Klein MMB: 0.20 ± 0.03 27 ± 1

Coleman: 1.43 ± 0.04 204 ± 10

Ejemplo 8: Producción de PRP a escala industrial (1000 litros)

Se preparó un medio de cultivo según la invención que tenía la composición del ejemplo 1, excepto para el zinc, donde la concentración es de 20 mg/L en lugar de 5 mg/L. Esto se debe a que el ejemplo 5 mostró que esta 20 concentración permitía producir más PRP sin incrementar la cantidad de LPS.

El medio fue idéntico para los precultivos y el cultivo final, excepto para el pH (pH inicial de 7.2 ± 0.1, a continuación pH libre para los precultivos y pH regulado a 6.7 ± 0.1 para el cultivo de producción).

Se preparó el medio como en el ejemplo 1. Después de haber mezclado los compuestos disueltos previamente en un volumen pequeño de agua purificada con, en ciertos casos, la adición de ácido o de base (compare con el 25 ejemplo 1) y antes de añadir la cantidad suficiente de agua purificada, se ajustó el pH a 7.2 ± 0.1 para los precultivos y a 6.7 ± 0.1 para el cultivo final (con hidróxido de potasio o hidróxido de sodio 10 N o HCl al 37%).

A continuación se esterilizó el medio mediante una filtración sobre un filtro que tenía un valor de corte de 0.22 µm.

De este modo fue posible almacenar el medio durante 72 horas a 5 ºC.

Antes de la inoculación del medio, se añadió lo siguiente:

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-glucosa con 512.8 g/L preparada a partir de D(+) glucosa anhidra suministrada por la compañía VWR con la referencia 24379.294, -una solución de NAD con 1 g/L, suministrada por la compañía Sigma con el nombre dinucleótido de βnicotinamida y adenina hidratado (ref. 43410),

5 -una solución madre que comprendía protoporfirina con una concentración de 0.25 g/L e hidróxido de amonio con una concentración de 5 mL/L; donde la compañía Solvias AG suministró la protoporfirina con el nombre de sal disódica de protoporfirina IX (ref. SOL20402) y la compañía VWR el hidróxido de amonio con el nombre de solución de amoniaco al 28% (ref. 21190.292),

con el fin de obtener un medio listo para ser inoculado, y que comprendía, además de los elementos descritos en la

10 tabla I del ejemplo 1, los elementos adicionales con las concentraciones indicadas en la tabla II del ejemplo 1 (excepto la glucosa con una concentración final de 14.87 g/L en lugar de 14 g/L).

El proceso a escala de 1000 litros comprendió una serie de 3 precultivos:

-los primeros precultivos se realizaron en un matraz Erlenmeyer de 1 litro sin deflectores que contenía 290 mL de medio de cultivo completo, a 37 ºC agitando a 130 rpm (revoluciones por minuto), durante un periodo de 17-18

15 horas. Estos precultivos se iniciaron inoculando el medio de cultivo con un inóculo de una bacteria de Haemophilus influenzae de tipo b que contenía al menos 2 copias del locus cap, con un nivel de inoculación que correspondía a una DO694 nm inicial objetivo de 0.014; -la segunda serie de precultivo se realizó en un fermentador de 6.8 litros. Dos fermentadores que contenían 5.2 litros de medio de cultivo completo se inocularon, cada uno de ellos, con 260 mL de un precultivo de la serie 1.

20 Estos fermentadores se mantuvieron durante 4 horas a 37 °C ± 1, con un pH inicial de 7.2 ± 0.2, una pO2 mantenida al 30% con una cascada que conllevaba un incremento en la agitación (de 500 a 800 rpm), a continuación un incremento en la aireación (de 0.5 a 2.5 lpm) y a continuación un caudal de O2 puro comprendido entre 0 y 6 lpm; -la tercera serie de precultivos se realizó en un fermentador de 120 litros que contenía 57 litros de medio

25 completo que se inoculó con 5.8 litros del precultivo originado en la serie 2. Este fermentador se mantuvo durante 3 horas 10 a 37 °C ± 1, con un pH inicial de 7.2 ± 0.2, una pO2 mantenida al 30% con una cascada que conllevaba un incremento en la agitación (de 300 a 425 rpm), a continuación un incremento en la aireación (de 6 a 28 lpm) y a continuación un caudal de O2 puro comprendido entre 0 y 50 lpm.

El cultivo industrial se realizó en un fermentador de 1000 litros que contenía 778 litros de medio completo que se 30 inoculó con 39 litros de un precultivo de la serie 3. Este fermentador se mantuvo a 32 ºC ± 1, con un pH regulado a

6.7 ± 0.2 (con una solución de hidróxido de sodio 2.5 N), una pO2 mantenida al 70% gracias a una cascada que conllevaba un incremento en la agitación (de 100 a 230 rpm), a continuación un incremento en la aireación (de 70 a 150 lpm) y a continuación un caudal de O2 puro comprendido entre 0 y 500 lpm. Además, se añadió antiespumante (Biospumex a un 4%) según se necesitara dependiendo del nivel de espuma.

35 Tras 12 horas de cultivo, se midió la D.O. a 694 nm, lo que permitió determinar la biomasa (según la correspondencia por la que una unidad de DO corresponde a 0.64 g de biomasa seca). La concentración de PRP y LPS se determinó según los protocolos descritos en los ejemplos 3 y 4.

Los resultados obtenidos se indican en la siguiente tabla XI:

Tabla XI:

Medio según la invención (1 ensayo)

D.O. a 694 nm: 3.45

Biomasa en g de masa seca/litro de medio de cultivo: 2.21

Concentración de PRP en mg/litro de medio de cultivo: 865

Producción específica en mg de PRP/g de biomasa: 392

Concentración de LPS en mg/litro de medio de cultivo: 35.6

Relación LPS/biomasa en mg/g de biomasa: 16.1

Relación PRP/LPS en mg/mg: 24.3

40 Estos resultados mostraron la ventaja del proceso según la invención para la productividad de PRP y la relación PRP/LPS, habiéndose demostrado dichos resultados a escala industrial.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un proceso para producir, a escala industrial, un polisacárido capsular de Haemophilus influenzae de tipo b (PRP) destinado a fines de vacunación, según el cual se cultiva una cepa de Haemophilus influenzae de tipo b (Hib) en un medio de cultivo y el sobrenadante del cultivo se recolecta y se trata con el fin de extraer el polisacárido capsular a

5 partir de él, comprendiendo dicho medio de cultivo al menos:

-una fuente de carbono, -protoporfirina, -sales, -aminoácidos,

10 -NAD o NADH, -vitaminas, -un medio para regular el pH,

caracterizado por que dicho medio de cultivo está químicamente definido, y comprende al menos zinc, en una cantidad que corresponde a aquella comprendida entre 2,5 y 80 mg/L de ZnSO4, 7 H2O, y por que la relación 15 PRP/LPS (en masa) es superior a aquella obtenida en un mismo medio que no contiene Zinc.
2.

El proceso tal y como se reivindica en la reivindicación anterior, caracterizado por que dichos medios reguladores del pH consisten en sales de tampón.
3.

El proceso tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicha fuente

de carbono puede ser múltiple y se escoge entre: glucosa, fructosa, galactosa, glicerol, xilosa, ribosa, fucosa, ácido 20 siálico y lactato.
4.

El proceso tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicha protoporfirina es protoporfirina IX sintética.
5.

El proceso tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dichas sales se escogen entre sales de potasio, magnesio, sodio, calcio, hierro, zinc, cobalto y manganeso.

25 6. El proceso tal y como se reivindica en la reivindicación anterior, caracterizado por que dichas sales se escogen entre: K2HPO4; KH2PO4; MgSO4, 7 H2O; Na2HPO4, 12 H2O; NaH2PO4, 2 H2O; CaCl2, 2 H2O; FeSO4, 7 H2O; ZnSO4, 7 H2O; CoCl2, 6 H2O; MnSO4, H2O.
7. El proceso tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dichos aminoácidos se escogen entre:

30 ● arginina,

●

alanina,

●

al menos uno entre: asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico,

●

lisina,

●

histidina, 35 ● triptófano,

●

valina,

●

isoleucina,

●

leucina,

●

tirosina, 40 ● fenilalanina,

● cistina o un equivalente.
8. El proceso tal y como se reivindica en la reivindicación anterior, caracterizado por que dicho medio de cultivo comprende al menos arginina, alanina, histidina, triptófano, tirosina, fenilalanina, cistina, ácido aspártico y ácido glutámico.

45 9. El proceso tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la cistina se reemplaza con glutatión o cisteína.
10. El proceso tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dichas vitaminas se escogen entre: tiamina, pantotenato, uracilo, hipoxantina, biotina, riboflavina y piridoxina.
11. El proceso tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la arginina y 50 el uracilo se reemplazan con citrulina.
12. Un proceso para preparar una composición para una vacuna según el cual:

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imagen2

-a) se prepara un antígeno contra Haemophilus influenzae de tipo b (Hib), constituido por el polisacárido capsular (PRP), a escala industrial, según el proceso de la reivindicación 1,

-b) el polisacárido capsular obtenido en el paso a) se conjuga con una proteína portadora.
13. El proceso tal y como se reivindica en la reivindicación anterior, caracterizado por que la proteína portadora es el 5 toxoide tetánico.
14. El proceso tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que se combina el conjugado obtenido en la etapa b) con al menos uno o varios antígenos presentes habitualmente en las vacunas pediátricas.

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15. El proceso de preparación de una composición para vacuna tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que se combina el conjugado obtenido en la etapa b) con unos antígenos de la difteria, tetanos y hepatitis B.

15 16. El proceso de preparación de una composición para vacuna tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que se combina el conjugado obtenido en la etapa b) con toxoide diftérico, toxoide tetánico, 2 antígenos acelulares de Bordetella pertussis que son el toxoide y la hemaglutinina filamentosa.

20 17. El proceso de preparación de una composición para vacuna tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que se combina el conjugado obtenido en la etapa b) con toxoide diftérico, toxoide tetánico, 3 antígenos acelulares de Bordetella pertussis que son el toxoide, la pertactina y la hemaglutinina filamentosa.

25 18. El proceso de preparación de una composición para vacuna tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que se combina el conjugado obtenido en la etapa b) con toxoide diftérico, toxoide tetánico, 5 antígenos acelulares de Bordetella pertussis que son el toxoide, la pertactina, los aglutinógenos y la hemaglutinina filamentosa.

30 19. El proceso de preparación de una composición para vacuna tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que se combina el conjugado obtenido en la etapa b) con toxoide diftérico, toxoide tetánico, 2, 3 o 5 antígenos acelulares de Bordetella pertussis, así como los virus inactivados de la polio de tipo 1, 2 y 3.

35 20. El proceso de preparación de una composición para vacuna tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que se combina el conjugado obtenido en la etapa b) con toxoide diftérico, toxoide tetánico, antígenos de la hepatitis B, 2, 3 o 5 antígenos acelulares de Bordetella pertussis, así como los virus inactivados de la polio de tipo 1, 2 y 3.

40 21. El proceso de preparación de una composición para vacuna tal y como se reivindica en una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que se combina el conjugado obtenido en la etapa b) con la bacteria entera de Bordetella pertussis.
22. El proceso de preparación de una composición para vacuna tal y como se reivindica en una de las

45 reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que se combina el conjugado obtenido en la etapa b) con uno al menos de los antígenos contra la difteria, el tetanos, la poliomiletia, la hepatitis B, las infecciones generadas por Neisseria meningitidis o por Streptococcus pneumoniae.

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