CN113368137A - 一种天然的细菌群体感应抑制剂及其应用 - Google Patents

一种天然的细菌群体感应抑制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种天然的细菌群体感应抑制剂及其应用。本发明所述细菌群体感应抑制剂，即鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物，具有抑制细菌群体感应的活性，其对副溶血弧菌的群体感应系统及其调控的相关表型均具有明显的抑制作用，且不抑制细菌的生长，故可将其作为新型细菌群体感应抑制剂，用于防治由群体感应调控的细菌。此外，本发明所用鼠李糖乳杆菌LGG为食源性乳酸菌，所得群体感应抑制剂绿色、安全、高效，既可以减少抗生素的使用，也为防治由食源性致病菌引起的污染和感染提供了新的途径和方法。

Description

一种天然的细菌群体感应抑制剂及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种天然的细菌群体感应抑制剂及其应用。
背景技术
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐性病原菌，广泛分布于世界河口和海洋环境中，在鱼、贝、虾、蟹等海产品常可发现。副溶血弧菌能导致水产动物或人的细菌性感染疾病甚至是死亡。生物被膜是指细菌聚集黏附于生物或非生物表面后，通过生长繁殖及分泌胞外聚合物，将自身包裹在其中形成的具有复杂空间结构的成膜状聚合体。副溶血弧菌形成的生物被膜为菌体生长提供了天然保护屏障，增强膜内菌抵抗外界不利环境、产生耐药性并导致持续性的污染和感染。副溶血弧菌已成为威胁人类健康的主要食源性致病菌之一。
群体感应(quorum sensing，QS)是指细菌之间借助信号分子进行通讯的过程，使大量的细菌随着种群密度和物种组成的变化而改变生物学行为，包括毒力因子分泌、生物被膜形成、孢子形成、胞外水解酶和胞外多糖的产生等。与通过破坏细菌蛋白质等的合成，干扰微生物重要生命过程而致使微生物死亡，达到治疗感染目的的传统抗菌药物不同，QS抑制剂(QS inhibitors，QSIs)是具有QS淬灭作用的一类物质。不同的QSIs能在不影响细菌正常生长的前提下，通过抑制QS信号分子的生物合成，降解信号分子，与信号分子竞争结合受体位点，或结合以清除信号分子等方式来干扰细菌QS过程，从而降低致病菌的致病性和耐药性。利用QS作为控制感染的靶标筛选高效的QS系统干扰药物有望成为解决耐药细菌感染的有效途径之一。
乳酸菌作为公认安全的食品安全制剂，已被广泛应用于食品、医学、农业等领域。从乳酸菌中挖掘QSIs不失为一种安全和高效的方式，目前乳酸菌源QSIs正引起学者们的关注，研究也取得了一定的进展。例如黄湘湄等公开了海洋源乳酸菌AI-2类群体感应抑制剂对单增李斯特菌抑制效果的研究(黄湘湄,吴雅茜,刘颖,等.海洋源乳酸菌AI-2类群体感应抑制剂对单增李斯特菌抑制效果研究[J].生物技术通报,2019,035(004):36-42.)。其以测定报告菌哈维氏弧菌BB170的发光值作为筛选指标，从16株海洋源乳酸菌的代谢产物中筛选单增李斯特菌AI-2信号分子的群体感应抑制剂，其中发现菌株Pediococcuspentosaceuszy-B-1的乙酸乙酯提取物的抑制率最高。但其针对的是单增李斯特菌，且其所述群体感应抑制剂为海洋来源的乳酸菌的代谢产物，安全性不能保障。
目前还未有针对来自水产品的副溶血弧菌的乳酸菌源QSIs，相关方面的研究也相对匮乏。因此，开发一种绿色、安全、高效的乳酸菌源QSIs，不仅可丰富QSIs，拓宽乳酸菌的应用，也可为防治由副溶血弧菌引起的污染和感染提供新的途径和方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种天然的细菌群体感应抑制剂及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种天然的细菌群体感应抑制剂。
本发明的第二个目的是提供所述抑制剂在制备细菌群体感应抑制剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述抑制剂在抑制细菌AI-2群体感应信号分子活性或在制备抑制细菌AI-2群体感应信号分子活性的制剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述抑制剂在防治AI-2类群体感应系统调控的细菌或在制备防治AI-2类群体感应系统调控的细菌的抗菌剂中的应用。
本发明的第五个目的是提供所述抑制剂在抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的群集和泳动能力或在制备抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的群集和泳动能力的制剂中的应用。
本发明的第六个目的是提供所述抑制剂在抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的生物被膜形成或在制备抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的生物被膜形成的制剂中的应用。
本发明的第七个目的是提供所述抑制剂在抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的胞外多糖合成或在制备抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的胞外多糖合成的制剂中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了一种天然的细菌群体感应抑制剂，其为鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物。
本发明还提供了所述抑制剂的制备方法，将鼠李糖乳杆菌LGG接种于MRS培养基培养，离心、过滤取上清液，将上清液与乙酸乙酯混合振荡萃取，收集乳化层，除乙酸乙酯，浓缩干燥成粉末。
优选地，将活化后的鼠李糖乳杆菌LGG接种于MRS培养基，37℃培养24h后离心，用0.45μm的微孔滤膜过滤获得发酵上清液；将上清液与乙酸乙酯等比例加入分液漏斗，振荡萃取，静置过夜；待分层后收集乳化层，真空旋转蒸发除去乙酸乙酯，收集浓缩液，真空冷冻干燥成粉末。
更优选地，在4℃条件下，8000r/min离心10min；于37℃、120r/min真空旋转蒸发除去乙酸乙酯。
优选地，所述抑制剂在使用时，将其溶于TSB或AB培养基，过滤除菌后配制成质量浓度为50mg/mL的工作液。
本发明通过实验表明，鼠李糖乳杆菌LGG经乙酸乙酯萃取真空冻干后的发酵物可以抑制副溶血弧菌群体感应的活性，且能在不影响副溶血弧菌生长的前提下，有效抑制其AI-2信号分子的活性，同时还能抑制其群集和泳动能力，抑制胞外多糖的合成和生物被膜的形成，减弱细菌的致病性和耐药性。因群体感应与细菌被膜的形成、耐药性等生物学功能相关，而副溶血弧菌为AI-2类群体感应系统调控的细菌，且本发明也表明所述抑制剂可抑制AI-2信号分子的活性，因此，本发明申请保护所述细菌群体感应抑制剂的以下应用：
所述抑制剂在制备细菌群体感应抑制剂中的应用，见实施例2。
所述抑制剂在抑制细菌AI-2群体感应信号分子活性或在制备抑制细菌AI-2群体感应信号分子活性的制剂中的应用，见实施例3。
所述抑制剂在抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的群集和泳动能力或在制备抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的群集和泳动能力的制剂中的应用，见实施例4。
所述抑制剂在抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的生物被膜形成或在制备抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的生物被膜形成的制剂中的应用，见实施例5和实施例7～9。
所述抑制剂在抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的胞外多糖合成或在制备抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的胞外多糖合成的制剂中的应用，见实施例6。
所述抑制剂在防治AI-2类群体感应系统调控的细菌或在制备防治AI-2类群体感应系统调控的细菌的抗菌剂中的应用。
优选地，所述细菌为副溶血弧菌。
优选地，所述抑制剂的添加质量浓度为0～1mg/mL。
在此范围内，所述抑制剂既可抑制副溶血弧菌的群体感应，且副溶血弧菌的生长不受影响。
更优选地，所述抑制剂的添加质量浓度为0～0.8mg/mL。
本发明还提供一种抗AI-2类群体感应系统调控的细菌的抗菌剂，其包含本发明所述细菌群体感应抑制剂。
优选地，所述抗菌剂的剂型为粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂、水分散粒剂、悬浮剂、乳油、微乳剂或水剂。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物具有抑制细菌群体感应的活性，其对副溶血弧菌QS系统及其调控的相关表型具有明显的抑制作用，且不抑制细菌的生长。即所述提取物在不干扰副溶血弧菌生长的前提下，能有效抑制细菌的AI-2活性，抑制细菌的群集和泳动能力，抑制细菌胞外多糖的合成和生物被膜的形成，减弱致病菌的致病性和耐药性，其可作为新型细菌群体感应抑制剂，用于防治由群体感应调控的细菌。此外，本发明所用鼠李糖乳杆菌LGG为食源性乳酸菌，所得群体感应抑制剂绿色、安全、高效，既可以减少抗生素的使用，也为防治由食源性致病菌引起的污染和感染提供了新的途径和方法。
附图说明
图1为鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物对副溶血弧菌和哈维氏弧菌BB170生长的影响，其中A为副溶血弧菌，B为哈维氏弧菌BB170。
图2为鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物对副溶血弧菌AI-2信号分子活性的影响。
图3为鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物对副溶血弧菌群集和泳动能力的影响，其中A代表群集，B代表泳动，1～4中抑制剂的添加质量浓度依次为0、0.2、0.4、0.8mg/mL。
图4为鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物对副溶血弧菌生物被膜形成的影响。
图5为鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物对副溶血弧菌胞外多糖合成的影响。
图6为鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物对副溶血弧菌生物被膜影响的光学显微镜图，其中A为对照组，B为处理组。
图7为鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物对副溶血弧菌生物被膜影响的场发射扫描电镜图，其中A为对照组，B为处理组。
图8为鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物对副溶血弧菌生物被膜影响的激光共聚焦显微镜图，其中A为对照组，B为处理组，1～3分别为激光共聚焦显微镜观察下生物被膜的明场、平面及其荧光强度图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明所用菌株为Sunlife Probiotics益生菌粉里的鼠李糖乳杆菌LGG，为乳杆菌属鼠李糖亚种，其拉丁名为Lactobacillus rhamnosus。
实施例1鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物的制备
鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物的制备过程如下：
将活化的鼠李糖乳杆菌LGG接种于MRS培养基，37℃培养24h后，于4℃条件下，8000r/min离心10min，用0.45μm的微孔滤膜过滤获得乳酸菌发酵上清液；将上清液与乙酸乙酯等比例加入分液漏斗，振荡萃取，静置过夜；待分层后收集乳化层，于37℃、120r/min进行真空旋转蒸发以除去乙酸乙酯；收集浓缩液，真空冷冻干燥成粉末即得。
所得提取物命名为LGG-QSI。
使用前，将提取物溶于TSB或AB培养基，过滤除菌，配制成质量浓度为50mg/mL工作液，备用。
实施例2 LGG-QSI对副溶血弧菌和哈维氏弧菌生长曲线的影响
报告菌株哈维氏弧菌BB170只感应AI-2类信号分子并发光，发光强弱与AI-2活性正相关，可用于特异性检测外源性的AI-2信号分子。
实验方法：在100微型孔板孔内分别加入200μL含LGG-QSI质量浓度依次为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mg/mL的TSB或AB培养基，以未含LGG-QSI的TSB或AB培养基为对照组。其中，活化的副溶血弧菌接种于TSB培养基孔中，37℃培养24h，另将哈维氏弧菌接种于AB培养基孔内，30℃培养24h，期间每隔2h测定OD600nm值，采用全自动生长曲线仪进行测定。
LGG-QSI对副溶血弧菌生长的影响结果如图1A所示，随着LGG-QSI浓度的增加，其对副溶血弧菌生长的抑制作用逐渐增强，且呈现剂量依赖性。为了排除LGG-QSI使用浓度对AI-2信号分子指示菌的影响，同时测定了LGG-QSI对哈维氏弧菌BB170生长的影响，结果如图1B显示，在本实施例添加的质量浓度范围内，对哈维氏弧菌的生长基本不产生影响。
为证明菌株LGG是通过抑制副溶血弧菌QS而非抑菌发挥作用，后续实验选择0.8mg/mL及以下质量浓度的LGG-QSI进行。
实施例3 LGG-QSI对副溶血弧菌AI-2信号分子活性影响
实验方法：在副溶血弧菌的菌悬液中分别加入含LGG-QSI质量浓度为0、0.2、0.4、0.8mg/mL的TSB培养基，使得副溶血弧菌的终浓度为107CFU/mL并混匀，37℃、150r/min培养12h后，离心、过滤收集上清液。将活化后的哈维氏弧菌BB170接种于AB培养基，30℃、90r/min培养12h，调节菌液OD595nm为0.8左右，再用无菌的新鲜AB培养基按1∶5000稀释该菌液，混匀备用。按体积比1∶50的比例将收集的上清液与哈维氏弧菌BB170稀释菌悬液混合。30℃、100r/min摇瓶培养3h，避光条件下吸取200μL于黑色不透明酶标板中，以多功能酶标仪检测哈维氏弧菌BB170发光情况，以LGG-QSI未处理的副溶血弧菌为对照组。并按以下公式计算乳酸菌QSIs对副溶血弧菌AI-2活性的抑制率：
Figure BDA0003052896510000061
实验结果如图2所示，LGG-QSI对副溶血弧菌AI-2活性呈现浓度依赖性的抑制作用；当用质量浓度为0.8mg/mL的LGG-QSI处理时，对副溶血弧菌AI-2活性的抑制率为65.27％(小写字母相同表示差异不显著，不相同表示差异显著，P<0.05)。
实施例4 LGG-QSI对副溶血弧菌群集和泳动的抑制
实验方法：依次取2μL含LGG-QSI质量浓度为0、0.2、0.4、0.8mg/mL的副溶血弧菌的菌悬液，分别接于群集平板(1％蛋白胨、3％NaCl、0.5％琼脂和0.5％葡萄糖，pH7.2)和泳动平板(1％胰蛋白胨、3％NaCl和0.3％琼脂，pH7.2)中央，以未加LGG-QSI的副溶血弧菌的菌悬液作为空白对照组。于37℃正置培养24h，观察两种培养基上副溶血弧菌迁移直径的变化并计算抑制率。
Figure BDA0003052896510000071
式中：dControl为空白对照组副溶血弧菌群集或泳动的迁移直径/mm；dQSIs为LGG-QSI处理组副溶血弧菌群集或泳动的迁移直径/mm。
实验结果如图3所示，其中A代表群集，B代表泳动，1～4中LGG-QSI的添加质量浓度依次为0、0.2、0.4、0.8mg/mL。由图可知，添加LGG-QSI后的副溶血弧菌运动范围明显缩小，且呈现浓度依赖性的抑制作用。在群集平板中，对照组的群集直径为(14.11±1.75)mm，添加0.8mg/mL的LGG-QSI使细菌群集范围缩小至(6.68±0.34)mm，抑制率达52.67％。在泳动平板中，对照组的迁移范围靠近皿底边缘，迁移直径达(89.59±0.15)mm，表明副溶血弧菌的泳动能力强；添加0.8mg/mL的LGG-QSI后可使迁移直径降低至(43.49±1.13)mm，抑制率达51.45％。
实施例5 LGG-QSI对生物被膜形成量的影响
实验方法：采用结晶紫染色法测定生物被膜的形成量。在96板孔内加入200μL含LGG-QSI质量浓度为0、0.2、0.4、0.8mg/mL的TSB培养基，将副溶血弧菌的菌悬液接种于孔内，使菌的终浓度为107CFU/mL，37℃培养24h；移除孔内浮游菌，用PBS缓冲液轻缓清洗2～3次，60℃干燥固定30min；加入0.1％结晶紫染色5min，用PBS缓冲液轻缓清洗3次，干燥；加入33％冰乙酸脱色10min，测定OD595nm。并按以下公式计算乳酸菌QSIs对副溶血弧菌生物被膜形成的抑制率：
Figure BDA0003052896510000072
实验结果如图4所示，0.2mg/mL的LGG-QSI对副溶血弧菌成膜能力的抑制作用小，抑制率仅为6.07％，当浓度提高到0.4mg/mL时，抑制率达80％以上(小写字母相同表示差异不显著，不相同表示差异显著，P<0.05)。
实施例6 LGG-QSI对副溶血弧菌对胞外多糖合成的影响
实验方法：在48孔板孔内加入1Ml，LGG-QSI质量浓度为0、0.2、0.4、0.8mg/mL的TSB培养基，将副溶血弧菌的菌悬液接种于孔内，使菌的终浓度为107CFU/mL，每孔放入无菌盖玻片，37℃温育24h。将培养后的盖玻片放入含0.5mL生理盐水试管中，充分震荡洗脱30s后，加入0.5mL 5％苯酚，立即振匀并加入2.5mL浓H2SO4，振荡后测定OD490nm。按公式计算抑制率。
Figure BDA0003052896510000081
式中：ODControl指空白对照组测得的EPS的OD490nm；ODQSIs指LGG-QSI处理后测得的胞外多糖的OD490nm。
胞外多糖是维持生物被膜复杂空间结构的主要成分，能抵抗外界环境抗菌物质的扩散，诱导并促进生物被膜的耐药性。实验结果如图5所示，LGG-QSI质量浓度的增大，对副溶血弧菌EPS合成的抑制率也逐渐增大，呈现浓度依赖性的抑制作用；当添加质量浓度为0.8mg/mL时LGG-QSI的抑制率达64.58％，说明其能有效抑制副溶血弧菌生物被膜中EPS的合成(小写字母相同表示差异不显著，不相同表示差异显著，P<0.05)。
实施例7光学显微镜观察LGG-QSI对副溶血弧菌生物被膜的影响
实验方法：在24孔板中分别加入1.5mL含LGG-QSI质量浓度为0.8mg/mL的TSB培养基，将副溶血弧菌的菌悬液接种于培养基中，使副溶血弧菌的终浓度为107CFU/mL，每孔中放置无菌盖玻片，37℃培养24h，以未加入LGG-QSI处理的作为空白对照组。用超纯水轻缓润洗玻片，去除浮游状态菌；用结晶紫染色5min，弃染色液，用PBS缓冲液缓慢清洗玻片，室温下晾干；用光学显微镜的油镜观察。
结果如图6所示，对照组的副溶血弧菌在盖玻片上形成片状、厚且紧密的生物被膜(图6A)；0.8mg/mL质量浓度的LGG-QSI处理后，视野中仅能见到散落分布的细菌(图6B)，说明LGG-QSI有效抑制副溶血弧菌生物被膜的形成。
实施例8场发射扫描电镜观察LGG-QSI对副溶血弧菌生物被膜的影响
实验方法：将实施例6中获得的生物被膜标本片，用PBS缓冲液轻缓润洗3次，加入2.5％的戊二醛溶液，4℃固定24h；用PBS缓冲液轻缓清洗3次，加入1％的锇酸固定0.5h；用PBS缓冲液轻缓清洗3次，依次用体积分数为30％、50％、70％、80％和90％的乙醇各脱水10min，最后再用100％的乙醇脱水2次，每次10min；盖玻片真空干燥后喷金，扫描电镜下观察生物被膜。
实验结果如图7所示，经过相同系列的固定、洗涤等预处理后，仍能观察到对照组中副溶血弧菌的菌体之间相互聚集成团，并分泌胞外多聚物将自身包裹于其中，形成具有明显空间特征的生物被膜结构(图7A)；0.8mg/mL的LGG-QSI处理后，副溶血弧菌形成生物被膜的能力几乎受到了完全抑制，视野中的细菌处于分散状态(图7B)。
实施例9激光共聚焦显微镜观察LGG-QSI对副溶血弧菌生物被膜的影响
实验方法：将实施例6中获得的生物被膜标本片，用PBS缓冲液轻缓洗去玻片上的浮游菌，加入5μL的FITC Con-A染色液，4℃低温染色30min；加入5μL的PI染料，低温染色15min。上述染色和制片操作均在避光条件下进行。使用CLSM观察，激发波长为488nm，发射波长为510nm。
荧光染料结合激光共聚焦显微镜技术可以观察生物被膜的厚度和结构情况。结果如图8所示，对照组中的副溶血弧菌的菌体连接致密，并分泌大量的胞外多糖(EPS)将自身包裹其中，生物被膜结构完整，具有一定厚度(图8A)；在相同的培养时间内，处理组视野中的细菌疏散，覆盖菌体表面的EPS荧光强度明显减弱，表明细菌分泌的EPS显著减少，生物被膜较空白对照组稀薄(图8B)。激光共聚焦显微镜的结果与上述EPS和生物被膜的定量、显微观察(光学显微镜及扫描显微镜)的实验结果相符合，表明LGG-QSI确能有效的抑制副溶血弧菌生物被膜的形成及其胞外多糖的合成。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种天然的细菌群体感应抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为鼠李糖乳杆菌LGG的乙酸乙酯提取物。
2.权利要求1所述抑制剂在制备细菌群体感应抑制剂中的应用。
3.权利要求1所述抑制剂在抑制细菌AI-2群体感应信号分子活性或在制备抑制细菌AI-2群体感应信号分子活性的制剂中的应用。
4.权利要求1所述抑制剂在防治AI-2类群体感应系统调控的细菌或在制备防治AI-2类群体感应系统调控的细菌的抗菌剂中的应用。
5.权利要求1所述抑制剂在抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的群集和泳动能力或在制备抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的群集和泳动能力的制剂中的应用。
6.权利要求1所述抑制剂在抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的生物被膜形成或在制备抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的生物被膜形成的制剂中的应用。
7.权利要求1所述抑制剂在抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的胞外多糖合成或在制备抑制AI-2类群体感应系统调控的细菌的胞外多糖合成的制剂中的应用。
8.根据权利要求2～7所述应用，其特征在于，所述细菌为副溶血弧菌。
9.根据权利要求2～7所述应用，其特征在于，所述抑制剂的添加质量浓度为0～1mg/mL。
10.一种抗AI-2类群体感应系统调控的细菌的抗菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述抑制剂。
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