CN105755061A - 一种用于生产pha的新型发酵培养基及其应用 - Google Patents

一种用于生产pha的新型发酵培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于生产PHA的新型发酵培养基及其应用。采用的技术方案是：将菌株接种入发酵培养基中，添加不同浓度比例的甘油和乙酰丙酸作为碳源，调节pH 7.0?7.2，保持温度30℃，转速200r/min，连续发酵72h，8000rpm离心10min收集菌体，冷冻干燥获得细胞干重。本发明通过以不同浓度甘油和乙酰丙酸作为发酵碳源进行菌体发酵，并通过气相色谱仪检测分析细胞干重和PHA组分及含量的关系，证明了假单胞菌可以在以甘油和乙酰丙酸为发酵碳源的培养基中产生PHB?PHV共聚物，实现高效生产PHA的同时也能解决生物柴油副产物带来的污染和浪费的问题。

Description

一种用于生产PHA的新型发酵培养基及其应用
技术领域
本发明属于微生物和生物材料领域。具体的涉及一种采用不同浓度梯度的甘油和乙酰丙酸作为混合发酵碳源，发酵培养假单胞菌产PHB-PHV共聚物。
背景技术
近年来，能源紧缺的问题日趋严峻，国际油价一路攀升，促使世界各国积极研发可再生能源替代传统能源，生物柴油由于化学性质与石化柴油相似，同时又具有低污染、可再生、安全性好等优点，作为一种极有前景的可再生生物能源，生物柴油受到全世界学术界和产业界的普遍关注。然而在生产生物柴油的过程中，会产生大量的副产物甘油，每生产9kg生物柴油，约产生1kg粗甘油，仅美国2011年就产生3百多万吨副产物。目前，我国生物柴油企业的副产物同样基本都没有进行有效的开发利用。未来几年，包括我国在内的全球生物柴油产业都将迅速发展，副产物问题必将日益严重。副产物问题不解决，必将制约生物柴油产业的长期、稳定、可持续发展。如何解决副产物问题并实现高附加值利用正成为国际生物学、化学、环境科学等领域研究的前沿和热点。
聚羟基饱和脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate,PHA)是一种细胞在碳氮源不平衡条件下产生的能源储藏物，可以被许多种细菌合成。因具有热塑性、弹性及生物可降解性、生物相容性、憎水性、气体阻隔性、压电性、非线性光学活性和由不同官能团所带来的独特性质，而被应用于可降解塑料、缓释材料、组织工程材料(可植入人体的生物材料)、光电材料等。
通常，根据其单体组成不同，PHA分为三类：第一类是短链PHA，其单体由3-5个碳原子组成，例如，PHV和PHB；第二类是中长链PHA，通常由6-14个的碳原子构成，比如，PHBHHx、PHD、PHO、PHDD；第三类由中长链和短链的单体组成的混合PHA，如PHB-HHx。根据单体结构和含量的不同，PHA的性能可以从坚硬到柔软到弹性变化。
微生物合成的P(3HB)的分子质量约是1×104-3×106g/mol，它的分散度大约为2。P(3HB)理化性质，比如：熔点、玻璃化温度，以及其机械性能，与聚丙烯相比较而言，P(3HB)比较脆、硬。PHV与PHB组成的PHB-co-PHV，它的可加工性以及其物理性能与PHB相比，有了很大的提高，这就意味着，这种共聚物的应用前景会更为广泛。
目前，生产PHA主要通过微生物发酵。假单胞菌是生产PHA的优良菌株，当前，生产成本高和产率低的问题一直制约着PHA的广泛应用。而决定微生物合成PHA费用居高不下的主要因素之一是底物，即用于生产PHA的碳源，可占到总成本的28-50％。因此选择较为便宜的碳源作为底物一直是从事PHA研究的科学家们考虑的首要问题之一。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供一种改变假单胞菌产PHA的组分和含量，同时解决生物柴油副产物带来的污染和浪费问题的一种新型发酵培养基。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用于生产PHA的新型发酵培养基，所述的发酵培养基以甘油和/或乙酰丙酸作为碳源。
上述的一种用于生产PHA的新型发酵培养基，所述的发酵培养基由组分I、组分II、组分III和组分IV组成。
所述的组分I组成为：Na2HPO4·12H2O 180g/L，KH2PO4 30g/L，加水至1L。
所述的组分II组成为：(NH4)2SO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.41g/L，按重量百分比含有甘油0-1％，按重量百分比含有乙酰丙酸0-1％，加水至1L。
所述的组分III组成为：Fe(III)-NH4-Citrate 5g/L，CaCl2·2H2O 2g/L，加水至1L。
所述的组分IV组成为：ZnSO4·7H2O 100mg/L，MnCl2·4H2O 30mg/L，H3BO3 300mg/L，CoCl2·6H2O 200mg/L，CuSO4·5H2O 10mg/L，NiCl2·6H2O 20mg/L，NaMoO4·2H2O 30mg/L，加水至1L。
上述的一种用于生产PHA的新型发酵培养基，每100ml发酵培养基，由93.9ml组分II，5ml组分I，1ml组分III和0.1ml组分IV混合，混合均匀后，用NaOH调节pH为7.0-7.2。
上述的新型发酵培养基用于发酵培养假单胞菌生产PHA。方法如下：将假单胞菌，按接种量5％接种入上述的新型发酵培养基中，调节溶液pH为7.0-7.2，保持温度30℃，200r/min持续发酵72h。优选的，所述的假单胞菌为食油假单胞菌14682。
假单胞菌是生产PHA的优良菌株，其产PHA的能力、单体组成又跟碳源成分、发酵条件有关。因此，优化菌种的发酵碳源是工业生产中关键的一步。为了获得一种既能够高效产PHA，又能产生新组分的发酵碳源，就需要对发酵碳源进行优化。
本发明，通过设置一系列不同浓度梯度的甘油和乙酰丙酸做为产PHA菌株的生长碳源，发现假单胞菌可以利用该混合碳源产生PHB-PHV共聚物。共聚物PHB-PHV的百分比跟甘油和乙酰丙酸的比例有一定关系。在以甘油为唯一碳源时，只产生PHB(3-羟基丁酸酯)。在以乙酰丙酸为唯一碳源时，只产生PHV(3-羟基戊酸酯)。为利用假单胞菌工业化生产PHA奠定了良好的理论基础。
本发明的有益效果是：本发明通过设置不同浓度梯度的甘油和乙酰丙酸作为发酵培养基的碳源，假单胞菌可以在以甘油和乙酰丙酸为碳源的培养基上生长，且在只有甘油为碳源的培养基上细胞生长较好，细胞干重达到2.21g/L。当甘油与乙酰丙酸比例为0.2％:0.8％时，PHA的含量占细胞干重的33.92％。在只有甘油为碳源的培养基中，只产生PHB，在只有乙酰丙酸为碳源的培养基中，只产生PHV。当以甘油和乙酰丙酸用作混合碳源时，细胞生长和PHA的积累与二者比例相关，随着乙酰丙酸含量的增加，产PHV的含量也随之增加。
本发明，从根本上降低了PHA的生产成本，对解决甘油污染严重的问题有重要的现实意义，同时为下一步改造假单胞菌的甘油-乙酰丙酸耐受分子机制提供理论基础。同时解决了困扰PHA生产的“瓶颈”问题，用廉价原料合成PHA；也解决了甘油过度积累给环境等带来的问题。
附图说明
图1是不同甘油和乙酰丙酸百分比下所得产物中PHB-PHV含量百分比。
具体实施方式
实施例 用于生产PHA的新型发酵培养基及其应用
(一)菌种：食油假单胞菌14682(美国农业部东区研究中心惠赠)
(二)培养基：
1、种子LB培养基：
酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L。
2、用于生产PHA的新型发酵培养基：
表1发酵培养基组分表
灭菌方法：组分II加入甘油和乙酰丙酸为混合碳源，按表1的比例，分别制成6种不同含量的组分II，分别分装。组分I、组分III和组分IV分别以母液灭菌，121℃灭菌20min后，4℃冰箱保存，其中组分III需避光。
接种前，按每100ml发酵培养基组成为：分别取93.9ml组分II，5ml组分I，1ml组分III和0.1ml组分IV，混合均匀后，用NaOH调节pH为7.0-7.2后接种。
(三)培养方法：
1)一级种子的培养：从平板上挑取单菌落接入LB培养基(10ml培养基/50ml摇瓶)。30℃培养12h，摇床转速200r/min。
2)二级种子的培养：采用摇瓶种子培养基(100ml培养基/500ml摇瓶)，接种量：5％(v/v)。30℃培养72h，摇床转速200r/min。
3)配制用于生产PHA的新型发酵培养基：以配置100ml发酵培养基为例，在灭菌后组分II(93.9ml)中添加组分I(5ml)、组分III(1ml)和组分IV(0.1ml)，混合均匀，作为发酵培养基。将菌种接种入发酵培养基中，接种量为5％(v/v)，1N氢氧化钠来调节pH为7.0-7.2，保持温度30℃，200r/min持续发酵72h。
4)培养结束后，把经72h发酵后的发酵液至于离心管，8000rpm离心10min收集菌体，然后用蒸馏水水洗菌体沉淀一次，以去掉菌体沉淀中残留的培养基。8000rpm，离心10min收集菌体，再用95％的乙醇洗涤菌体一次，重复上述离心一次。最后将得到的湿细胞在-20℃冰箱中冷冻过夜，再用真空冷冻干燥箱冰冻干燥到恒重，称量细胞干重。
(四)检测方法：
1)标准品制备：准确称取10mg PHA标准品，分别加入2ml氯仿和2ml酯化液(酯化液的配制：取1g癸酸，用30ml的浓硫酸和970ml的甲醇溶解)，盖紧盖子。在密闭的状态下于100℃的烘箱中酯化4h。待反应液冷却至室温后，加入1ml无菌水，强烈振荡混匀有机相和水相，静置过夜，待水相与有机相完全分层后，取有机相于另外的管中保存，以用于下一步进行气相色谱分析。
2)样品制备：准确称量50mg的干细胞放入酯化管中，分别加入2ml氯仿和2ml酯化液(酯化液的配制：取1g癸酸，用30ml的浓硫酸和970ml的甲醇溶解)，盖紧盖子。在密闭的状态下于100℃的烘箱中酯化4h。待反应液冷却至室温后，加入1ml无菌水，强烈振荡混匀有机相和水相，静置过夜，待水相与有机相完全分层后，取有机相于另外的管中保存，以用于下一步进行气相色谱分析。
3)气相色谱检测分析：按照Hewlett Packard 6890气相色谱仪的说明书操作。使用HP-5毛细柱，设定柱头温度120℃，程序升温8℃/min，升温到175℃，并保持4min，设进样器温度250℃，检测器温度280℃，柱头压力6.60Psi，H2流量50ml/min，空气流量400ml/min，自动进样1μl。
4)细胞干重和PHA各组分含量如表2
表2 食油假单胞菌14682细胞干重及PHA占细胞干重百分比
结果：由图1和表2可见，食油假单胞菌14682可以在以甘油和乙酰丙酸为碳源的培养基上生长，且在只有甘油为碳源的培养基上细胞生长较好，细胞干重达到2.21g/L。当甘油与乙酰丙酸比例为0.2％:0.8％时，PHA的含量占细胞干重的33.92％。在只有甘油为碳源的培养基中，只产生PHB，在只有乙酰丙酸为碳源的培养基中，只产生PHV。总之，该研究表明了P.oleovorans 14682能够利用甘油和乙酰丙酸用作混合碳源，可产生共聚物PHB-PHV。这对于从根本上降低PHA的生产成本，在高效廉价生产PHA的同时也能解决生物柴油副产物带来的污染和浪费问题。同时为下一步改造P.oleovorans 14682的甘油-乙酰丙酸耐受分子机制提供理论基础。

Claims (6)

1.一种用于生产PHA的新型发酵培养基，其特征在于：所述的发酵培养基以甘油和/或乙酰丙酸作为碳源。
2.根据权利要求1所述的一种用于生产PHA的新型发酵培养基，其特征在于：所述的发酵培养基由组分I、组分II、组分III和组分IV组成；
所述的组分I组成为：Na2HPO4·12H2O 180g/L，KH2PO4 30g/L，加水至1L；
所述的组分II组成为：(NH4)2SO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.41g/L，按重量百分比含有甘油0-1％，按重量百分比含有乙酰丙酸0-1％，加水至1L；
所述的组分III组成为：Fe(III)-NH4-Citrate 5g/L，CaCl2·2H2O 2g/L，加水至1L；
所述的组分IV组成为：ZnSO4·7H2O 100mg/L，MnCl2·4H2O 30mg/L，H3BO3 300mg/L，CoCl2·6H2O 200mg/L，CuSO4·5H2O 10mg/L，NiCl2·6H2O 20mg/L，NaMoO4·2H2O30mg/L，加水至1L。
3.根据权利要求2所述的一种用于生产PHA的新型发酵培养基，其特征在于：每100ml发酵培养基，由93.9ml组分II，5ml组分I，1ml组分III和0.1ml组分IV混合，混合均匀后，用NaOH调节pH为7.0-7.2。
4.权利要求1-3任一所述的新型发酵培养基在发酵培养假单胞菌生产PHA中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于方法如下：将假单胞菌，按接种量5％接种入权利要求1-3任一所述的新型发酵培养基中，调节溶液pH为7.0-7.2，保持温度30℃，200r/min持续发酵72h。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的假单胞菌为食油假单胞菌14682。
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