CN102239247A - 用食油假单胞菌菌株有效防治病毒性植物病 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)菌株对植物病毒病进行有效防治。本发明的整合了食油假单胞菌菌株的生物剂针对烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)、马铃薯Y病毒(potyvirus)、细病毒(tenuyi virus)、黄瓜花叶病毒(koo-koo mosaic virus)和菜豆金黄花叶病毒(bego mosaic virus)的植物病毒感染提供极佳的防护。

Description

用食油假单胞菌菌株有效防治病毒性植物病
技术领域
本发明涉及具有防治植物病毒病活性的食油假单胞菌(Pseudomonasoleovorans)菌株；和包含它的用于防治植物病毒病的微生物制剂。
背景技术
园林作物的总种植面积逐年增长，然而，大多数园林作物中发生多种植物病毒病，导致严重的经济损失。
损害园林作物的植物病毒包括黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)。为了防治这些病毒，开发了农艺防治方法(例如使用无病种子和培育抗病毒的新品系的那些方法)，但其效果并不显著。
同时，通过向植物中引入基因(如衣壳蛋白基因、复制相关基因、卫星RNA基因和反义基因)开发了抗病毒的转基因植物，但要获得工业上的成功尚需时日(Fitchen，J.H.和Beachy，R.N.，Annu.Rev.Microbiol.，47：739-763，1993)。
最近有很多开发新微生物制剂的研究采用微生物来防治植物病毒。尤其地，微生物制剂是环境友好的手段，其能保持自然生态系统并对哺乳动物无毒，因而对微生物制剂的需求在增加。
发明概述
因此，本发明的一个目的是提供有效防治植物病毒病的微生物；和包含它的微生物制剂。
根据上述目的，本发明提供了具有防治植物病毒病活性的食油假单胞菌KBPF-004(KCTC 10159BP)；其培养物；所述培养物的干粉；和用于防治植物病毒性疾病的微生物制剂，其包含作为活性成分的所述菌株、其培养物或所述培养物干粉。
附图简述
结合附图，本发明的上述的和其它目的和特征会从本发明如下描述中显而易见，附图分别显示：
图1：KBPF-004菌株的系统发生树；
图2：1000倍稀释的KBPF-004的25％可湿性粉剂(WP)对烟草花叶病毒的防治活性；
图3：通过RT-PCR确证的KBPF-004 25％WP对烟草花叶病毒的抑制作用；
图4：通过RT-PCR确证的KBPF-004 25％WP对病毒单一或复合感染的抑制作用(C：Chungyang红辣椒；D：Daemyung辣椒；M：分子大小标准参照物；H：健康植物；N：未处理组；和1，2：KBPF-004处理组)；
图5：KBPF-004 25％WP处理的病毒颗粒电子显微镜照片(TMV：烟草花叶病毒；PVY：马铃薯Y病毒)；
图6：KBPF-004 25％WP对烟草花叶病毒的感染抑制作用；
图7：KBPF-004 25％WP对辣椒斑驳病毒(pepper mottle virus)的防治作用；
图8：KBPF-004 25％WP对水稻条纹病毒的防治作用(A：未处理组；B：500倍稀释的KBPF-004的25％WP处理组)；
图9：KBPF-004 2.5％颗粒剂对烟草花叶病毒的防治作用；和
图10：KBPF-004的70％水悬浮剂(AS)对番茄黄化曲叶病毒的防治作用(A：未处理组(市售杀虫剂处理组)；B：500倍稀释的KBPF-00470％水悬浮剂和市售杀虫剂处理组)。
发明详述
本发明提供具有防治植物病毒性疾病活性的食油假单胞菌KBPF-004(KCTC 10159BP)菌株。
食油假单胞菌KBPF-004(KCTC 10159BP)形成具有梳状条纹轮廓的黄色圆形集落。该菌株为2～3μm长、0.3～0.5μm宽的棒状，并有单条长鞭毛。
本发明菌株具有SEQ ID NO：1所示的1479bp核苷酸序列的16SrDNA，其与食油假单胞菌IAM 1508T的序列有99.05％的序列同源性。通过依据Clustal法(Thompson JD等，Nuc.Acid.Res.25：4876-82，1997)构建系统发生树(图1)来研究本发明菌株的分类地位。
本发明菌株在其特异性的抗病毒活性方面不同于现有的食油假单胞菌。
因此，该菌株被命名为食油假单胞菌KBPF-004，并于2002年1月11日保藏于韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for TypeCultures，KCTC)，登记号为KCTC 10159BP。
本发明还提供了有效防治植物病毒病的食油假单胞菌KBPF-004(KCTC 10159BP)的培养物。
可以通过将食油假单胞菌KBPF-004(KCTC 10159BP)细胞接种于培养基并使其发酵来制备所述培养物。
培养基可没有任何限定地包含培养革兰氏阴性菌的培养基的常规成分。优选地，该培养基可在1L水中包含1g至20g葡萄糖、1g至30g酵母提取物、0.1g至1g硫酸镁、0.5g至5g磷酸二氢钾和0.5g至5g磷酸氢二钾。更优选地，该培养基可在1L水中包含7g至14g葡萄糖、15g至25g酵母提取物、0.1至0.2g硫酸镁、1g至2g磷酸二氢钾和1g至2g磷酸氢二钾。
发酵可在20℃至40℃的温度下进行，优选26℃至34℃；通气速率为50l/分钟至200l/分钟，优选100l/分钟至120l/分钟，旋转速度为100rpm至250rpm，优选120rpm至200rpm。为制备本发明的微生物制剂，优选菌株细胞和培养物滤液二者都使用。
而且，本发明提供所述培养物的干粉。
干粉可以通过灭菌、浓缩和粉碎(冷冻干燥和研磨)的步骤来制备。
灭菌步骤可在培养完成后通过加热细胞培养物来进行，加热温度为80℃至120℃，时间为1至20分钟，优选90℃至100℃，5至10分钟。
浓缩步骤可通过在40℃至80℃温度下将灭菌培养物减压浓缩12-48小时来进行，优选在65℃至75℃进行24至36小时。
粉碎步骤可通过采用冷冻干燥或喷雾干燥法对浓缩培养物进行干燥处理，并将其研磨制成粉末培养物而进行，但并不限于该方法。
冷冻干燥过程可通过从-80℃开始将温度顺次升高48至96小时(优选60至80小时)以干燥浓缩培养物来进行。
研磨过程通过使用针磨粉碎机(pin mill grinder)将所得的冻干产物研磨至2mm或更小的粒径来进行。
微生物制剂可通过将所述细胞、所述培养物或培养物的干粉与表面活性剂、营养物和载体联合配制而制备。
此外，本发明提供了用于防治植物病毒病的微生物制剂，其包含作为活性成分的食油假单胞菌KBPF-004(KCTC 10159BP)细胞、其培养物或培养物的干粉。
用于防治植物病毒性疾病的微生物制剂表现出依赖于活性成分浓度的抗病毒活性。
本发明的微生物制剂可包含按重量计2.5至70％的食油假单胞菌KBPF-004(KCTC 10159BP)细胞、其培养物或培养物的干粉；按重量计2-30％的表面活性剂；和剩余量的载体。优选地，本发明的微生物制剂可包含按重量计2.5至70％的食油假单胞菌KBPF-004(KCTC 10159BP)细胞、其培养物或培养物的干粉。
所述表面活性剂可包括阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或其混合物。表面活性剂可选自：磺酸化合物的钠盐或钙盐，如C8～12烷基芳基磺酸盐、C8～12二烷基芳基磺酸盐、C8～12二烷基磺基琥珀酸盐、木质素磺酸盐、萘磺酸盐缩合物、萘磺酸盐福尔马林缩合物、C8～12烷基萘磺酸盐福尔马林缩合物和聚氧乙烯C8～12烷基苯基磺酸盐；硫酸盐化合物的钠盐或钙盐，如C8～12烷基硫酸盐、C8～12烷基芳基硫酸盐、聚氧乙烯C8～12烷基硫酸盐和聚氧乙烯C8～12烷基苯基硫酸盐；琥珀酸化合物的钠盐或钙盐，如聚氧化烯琥珀酸盐；阴离子表面活性剂，如苯甲酸钠和烷基羧酸盐；非离子表面活性剂，如聚氧乙烯C12～18烷基醚、聚氧乙烯C8～12烷基苯基醚、聚氧乙烯C8～12烷基苯基聚合物和环氧乙烷环氧丙烷共聚物；聚羧酸盐；Triton
Figure BPA00001380755700041
100；Tween
Figure BPA00001380755700042
80；和它们的混合物，但不限于此。
载体可选自：膨润土、滑石、粘土、高岭土、碳酸钙、硅石、浮石、硅藻土、酸性瓷土、沸石、珍珠岩、白炭(white carbon)、硫酸铵、尿素、葡萄糖、糊精、水及其混合物，但不限于此。
另外，可用所述表面活性剂和/或载体将本发明的微生物制剂制备成选自以下的形式：可湿性粉剂(wettable powder，WP)、水分散颗粒剂(water dispersible granule，WG)、浓缩悬浮剂(suspension concentrate，SC)、颗粒剂、水悬浮剂(aqueous suspension，AS)、可溶性粉剂(solublepowder，SP)、水溶性颗粒剂(water soluble granule，SG)和胶囊剂。
在本发明中，细胞或培养物可以包含它的用于防治植物病毒病的微生物制剂的形式提供，或长期保存并在使用前与其它成分混合的独立储存形式提供。对于长期存放，细胞或培养物可以在-70℃以下储存在甘油储存液中，或以冻干形式储存。
本发明提供的可湿性粉剂形式的微生物制剂可通过以下方法制备：通过后处理过程获得培养物的干粉；向其中加入表面活性剂、营养物和载体；并将其混合。
本发明提供的颗粒剂形式的微生物制剂可通过以下方法制备：通过后处理过程获得培养物的干粉；向其中加入表面活性剂，载体和崩解剂；并将其混合。用于本发明的崩解剂可选自：膨润土、滑石、dialite、高岭土、碳酸钙及其混合物。
除了微生物细胞和/或发酵产物(微生物的培养物)之外，颗粒剂还可包含选自以下的成分：表面活性剂、无活性载体、防腐剂、润湿剂、供应促进剂(supply-promoting agent)、吸引剂(attracting agent)、包封剂、粘合剂、乳化剂、染料、UV防护剂、缓冲剂或助流剂。
本发明中提供的微生物制剂水悬浮剂可通过以下方法制备：通过后处理过程无菌浓缩培养物；向其中加入选自以下的成分：表面活性剂、防腐剂、润湿剂、供应促进剂、引诱剂(attracting agent)、UV防护剂和缓冲剂；并将其混合。
本发明的微生物制剂可有效地防治大多数由以下病原性病毒组引起的植物病毒病：例如，青葱X病毒属(Allexivirus)、苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)、葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)、大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)、菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)、毛状病毒组(Capillovirus)、香石竹潜病毒组(Carlavirus)、香石竹斑驳病毒组(Carmovirus)、花椰菜花叶病毒组(Caulimovirus)、线形病毒组(Closterovirus)、豇豆花叶病毒组(Comovirus)、南瓜花叶病毒组(Cucumovirus)、长线状病毒属(Crinivirus)、质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)、蚕豆萎蔫病毒组(Fabavirus)、弯曲病病毒科(Flexiviridae)、凹陷病毒属(Foveavirus)、真菌传杆状病毒组(Furovirus)、双粒病毒组(Geminivirus)、大麦病毒组(Hordeivirus)、等轴不稳定环斑病毒组(Ilarvirus)、黄矮病毒组(Luteovirus)、葡萄斑点病毒属(Maculavirus)、线虫传多面体病毒组(Nepovirus)、马铃薯X病毒组(Potexvirus)、马铃薯Y病毒组(Potyvirus)、植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)、马铃薯病毒属(Pomovirus)、温州蜜柑矮缩病毒属(Sadwavirus)、Taastrupvirus、细病毒组(Tenuivirus)、烟草花叶病毒组(Tobamovirus)、烟草脆裂病毒组(Tobravirus)、番茄丛矮病毒组(Tombusvirus)、番茄斑萎病毒属(Tospovirus)、发状病毒属(Trichovirus)及其组合。特别地，本发明的微生物制剂非常有效地防治包含棒状(线状)单链RNA的烟草花叶病毒组、马铃薯Y病毒组和细病毒组，包含环状单链RNA的南瓜花叶病毒组和包含环状单链DNA的菜豆金黄花叶病毒属。
更特别地，本发明的微生物制剂对以下病毒显示出极佳的防治作用：辣椒斑驳病毒(PepMoV)、辣椒轻型斑驳病毒(PMMoV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)、黄瓜绿斑点花叶病毒(CGMMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)、芜菁花叶病毒(TuMV)或水稻条纹病毒(RSV)等。
以下实施例旨在进一步说明本发明而不限制其范围。
实施例1：KBPF-004的分离和鉴定
<1-1>KBPF-004菌株的分离
从忠清北道阴城郡的烟草田中收集含有烟草植物根的土样。用无菌蒸馏水稀释所收集的土样，将稀释液涂布到补充有100ppm环己酰胺的TSA琼脂培养基上(Difco，Detroit，MI)，并在27℃下孵育以分离菌株纯培养物。
<1-2>KBPF-004菌株的鉴定
在30℃下在Mueller Hinton培养基(包含2.0g牛肉浸膏、17.5g酪蛋白、1.5g淀粉和17.5g琼脂)中将实施例<1-1>中分离出的菌株孵育24小时。
分离出的菌株形成具有梳状条纹轮廓的黄色圆形集落。该菌株为2～3μm长、0.3～0.5μm宽的棒状，，并有单条长鞭毛。为鉴定菌株的生物化学特征，进行了脂肪酸组成分析、Biolog GN微孔板分析和API20NE分析，结果分别参加表1-3。
<表1>
  脂肪酸组成   含量(％)
  C10:03-OH   2.19
  C12:0   5.14
  C12:02-OH   2.70
  C12:03-OH   3.79
  C16:1w7c/15:0iso2-OH   18.74
  C16:0   20.45
  C18:1w7c   45.88
<表2>
Figure BPA00001380755700081
Figure BPA00001380755700091
<表3>
Figure BPA00001380755700092
Figure BPA00001380755700101
另外，根据16S rDNA核苷酸测序来鉴定本发明菌株。分离的菌株具有1479bp核苷酸序列的16S rDNA(SEQ ID NO：1)，其与食油假单胞菌IAM 1508T菌株有99.05％的序列同源性。通过依据Clustal法(ThompsonJD等，Nuc.Acid.Res.25：4876-82，1997)构建系统发生树(图1)来确定本发明菌株的分类地位。
该菌株被定名为食油假单胞菌KBPF-004，并于2002年1月11日保藏于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，登记号为KCTC 10159BP。
<1-3>具有抗病毒活性的KBPF-004菌株的特异性
将KBPF-004菌株和食油假单胞菌ATCC 8062(作为其模式株)在30℃下在Mueller Hinton培养基中振摇培养24小时。将所得培养物稀释20倍并依据烟草半叶法(tobacco half-leaf method)(Kim等，Plant Pathol.J.20(4)：293-296，2004)检测其抗病毒活性。
烟草半叶法是利用了如下现象的方法，即珊西烟草(Nicotianatabacum cv.Xanthi nc)作为局部损伤的宿主植物通过烟草花叶病毒抗性基因在烟草花叶病毒感染区域周围因细胞坏死而形成黑点。具体地，在局部损伤宿主植物的7叶阶段，向上方第3和第4片叶子的半叶喷洒待检测抗病毒活性的受试物质。然后，向第3和第4片叶子上均匀地施加金刚砂(磨料)，并向其施加稀释的烟草花叶病毒以检测受试物质的抗病毒活性。施加的金刚砂在烟草叶上产生划痕，烟草花叶病毒通过这些划痕进入宿主植物。接种3-4天之后，在受感染叶片上生成黑点。
受试物质的防治值通过下式计算，结果参见表4。
防治值(％)＝[1-(经菌株处理的半叶上的黑点数/未处理的半叶上的黑点数)]×100
<表4>
  菌株   抗病毒活性
  模式菌株   食油假单胞菌ATCC 8062   19.7％
  KBPF-004菌株   食油假单胞菌KCTC 10159BP   96.0％
如表4所示，KBPF-004菌株有特别高的抗病毒活性，这证明，与现有的食油假单胞菌菌株相比，KBPF-004菌株是具有不同抗病毒活性的特异菌株。
<1-5>KBPF-004的抗病毒活性物质的特异性
已知食油假单胞菌物种产生可生物降解聚合物聚羟基烷酸酯(PHA)。为了鉴定KBPF-004菌株的特异性抗病毒作用是否是由PHA诱导，依照烟草半叶法测定了PHA(sigma)和KBPF-004菌株培养物各自的抗病毒活性，结果参见表5。
<表5>
  抗病毒活性
  PHA   0.0％
  KBPF-004菌株培养物   97.0％
如表5所示，PHA未表现出抗病毒活性，而KBPF-004菌株培养物则表现出高度抗病毒活性。这些结果证明KBPF-004菌株所产生的抗病毒活性物质不同于PHA。
此外，为了鉴别KBPF-004菌株所产生的抗病毒活性物质是否也表现出抗菌作用，采用七种植物病原性真菌和四种对抗生素高度敏感的菌株进行了纸碟分析(paper disk analysis)以查看抑菌圈的形成。结果参见表6。
<表6>
Figure BPA00001380755700121
如表6所示，植物病原真菌和抗生素高敏感菌株的生长都不受KBPF-004菌株培养物的抑制。这证明KBPF-004菌株所产生的抗病毒活性物质不同于现有的抗菌物质。
实施例2：用于生产抗病毒活性物质的优化培养基的制备
为了确定优于Mueller Hinton培养基的生产抗病毒活性物质的培养基条件，采用了多种碳源和氮源制备优化培养基。
具体地，30℃下振摇培养菌株24小时，其使用糊精、葡萄糖、甘油、蔗糖或水溶性淀粉为碳源，使用蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白、麦麸提取物、磷酸二氢铵或硫酸铵为氮源。在600nm测定所获得培养物的光密度(O.D)，采用烟草半叶法测定抗病毒活性。结果参见表7。
<表7>
  培养基   抗病毒活性(1/40稀释)   光密度(660nm)
  Mueller Hinton培养基   57％   9.2
  优化培养基   92％   23.2
如表7所示，与Mueller Hinton培养基相比，补充了作为碳源的按重量计1-5％的葡萄糖和作为氮源的按重量计1-5％的酵母提取物的优化培养基显示了显著改善的菌株生长和抗病毒活性。
实施例3：KBPF-004菌株的培养物和干粉的制备
<3-1>KBPF-004菌株培养物的制备
为了大规模制备KBPF-004菌株的培养物，使用了1L水中补充10g葡萄糖、20g酵母提取物、0.2g硫酸镁、2g磷酸二氢钾和2g磷酸氢二钾的培养基。
采用中试发酵罐进行大规模生产的发酵过程。将30L的菌株培养物在50L的发酵罐中发酵，培养终止后将所得培养物转入500L发酵罐。沿相同途径，将3000L的培养物在5000L的发酵罐中进行发酵。在30℃下进行发酵过程，通气速率为1VVM(每分钟加入到液体体积中的空气体积)，转速为200rpm(50L发酵罐)、150rpm(500L发酵罐)或80rpm(5000L发酵罐)，发酵1天以制备KBPF-004菌株培养物。
<3-2>KBPF-004菌株培养物干粉的制备
为了制备KBPF-004菌株培养物的干粉，进行了后处理过程，其包括菌株灭活、浓缩、冷冻干燥和研磨。
通过在培养之后80℃下加热发酵罐20分钟以杀死细胞来进行菌株灭活过程。通过在65℃下减压浓缩所得培养物32小时来进行浓缩过程。通过从-80℃逐渐升温以加热浓缩培养物52小时来进行冷冻干燥过程。研磨过程通过使用针磨粉碎机研磨冻干产物进行，以制备具有小于2mm粒径的干燥粉末。
实施例4：用KBPF-004菌株培养物制备微生物制剂
使用KBPF-004菌株培养物的干粉制备KBPF-004菌株的微生物制剂，例如可湿性粉剂(WP)、水分散颗粒剂(WG)、悬浮浓缩剂(SC)和颗粒剂，而水悬浮剂(AS)是采用含水的KBPF-004菌株培养物来制备的。
<4-1>使用KBPF-004菌株培养物的干粉制备可湿性粉剂
为用KBPF-004菌株培养物的干粉来配制可湿性粉剂，将按重量计25％的<3-2>中获取的KBPF-004菌株培养物干粉与按重量计3％的聚氧乙烯辛基苯基硫酸盐、按重量计3％的木质素磺酸钠、按重量计2％的月桂基硫酸钠、按重量计5％的白炭和剩余量的高岭土混合，用干燥型研磨机研磨混合物。研磨混合物的平均粒径为6.47μm。对这样获取的可湿性粉剂进行物理化学分析和生物学分析，结果参见下文的<4-6>。
<4-2>使用KBPF-004菌株培养物干粉制备水分散颗粒剂
为了用KBPF-004菌株培养物的干粉配制水分散颗粒剂，将按重量计25％的<3-2>中获取的KBPF-004菌株培养物干粉与按重量计6％的萘磺酸钠福尔马林凝集物、按重量计2％的月桂基硫酸钠、按重量计2％的木质素磺酸钠、按重量计5％的硅藻土和剩余量的碳酸钙混合，用干燥型研磨机研磨混合物。研磨混合物的平均粒径为6.08μm。然后，向混合物中加入占混合物重量10％的水，用制粒机对所得的混合物进行搓捏和成型，在流化床干燥器中干燥30分钟，获得水分散颗粒剂。对这样获取的水分散颗粒剂进行物理化学分析和生物学分析，结果参见下文的<4-6>。
<4-3>使用KBPF-004菌株培养物的干粉来制备悬浮浓缩剂
为了用KBPF-004菌株培养物的干粉调制悬浮浓缩剂，将按重量计25％的<3-2>中获取的KBPF-004菌株培养物干粉与按重量计3％的聚氧乙烯辛基苯基醚、按重量计2％的环氧乙烷环氧丙烷共聚物、按重量计2％的二辛基磺基琥珀酸酯、按重量计10％的丙二醇和按重量计55.5％的蒸馏水混合，用湿型研磨机研磨所得混合物。研磨混合物的平均粒径为2.45μm。然后，向混合物中加入按重量计2.5％的通过搅拌和混合步骤制备的2％黄原胶水溶液，用搅拌器搅拌和混合所得混合物，获得水悬浮剂形式的悬浮浓缩剂。对这样获取的悬浮浓缩剂进行物理化学分析和生物学分析，结果参见下文的<4-6>。
<4-4>使用KBPF-004菌株培养物的干粉制备颗粒剂
为了检测施加于土壤时KBPF-004菌株的防治作用，将按重量计2.5％的<3-2>中获取的KBPF-004菌株培养物干粉与按重量计0.5％的木质素磺酸钙和按重量计1.5％的高岭土混合，用干燥型研磨机研磨混合物，制备平均颗粒大小为6.25μm的研磨混合物。将按重量计1％的聚乙烯醇和按重量计0.5％的糊精溶于按重量计1.5％的水中制备粘合液。将粘合液施用于按重量计94％的沙子，将以上制备的混合物包被其上。在流化床干燥器中干燥所得颗粒剂30分钟。对这样获取的颗粒剂进行物理化学分析和生物学分析，结果参见下文的<4-6>。
<4-5>使用KBPF-004菌株培养物制备水悬浮剂
为了用含水KBPF-004菌株培养物配制水悬浮剂，对<3-1>中获取的含水KBPF-004菌株培养物进行后处理过程(包括菌株杀灭和浓缩)，将按重量计70％的如此获得的菌株培养物与按重量计5％的聚氧乙烯辛基苯基醚、按重量计5％的二辛基磺基琥珀酸酯、按重量计10％的丙二醇和按重量计10％的乙醇混合。搅拌和混合所得混合物获得水悬浮液。对这样获取的水悬浮液进行物理化学分析和生物学分析，结果参见下文的<4-6>。
<4-6>制剂特性和对烟草花叶病毒的抗病毒作用的检测
检测了<4-1>到<4-5>中获取的制剂的特性(剂型、外观、可湿度、细度和存储稳定性)并依据烟草半叶法检测其防治值，结果参见表8(韩国农村振兴厅(Rural development administration)通告的农业化学物检测法)。
<表8>
Figure BPA00001380755700161
结果，根据韩国农药管理法实施细则农业化学物审查标准(standardof review of agricultural chemicals by enforcement regulations of theKorean agrochemical management law)，这五种剂型表现出适宜的物理特性和抗病毒作用。在这些制剂中，<4-1>中获得的25％可湿性粉剂表现出最优的抗病毒作用，因此，在下述检测中采用了KBPF-004的25％可湿性粉剂、2.5％颗粒剂和70％AS。
<4-7>针对25％可湿性粉剂的老化稳定性的测试
为测试<4-1>中获得的25％可湿性粉剂的老化稳定性，采用烟草半叶法每周检测54℃下存储的可湿性粉剂抗病毒活性的损失程度，至少存储六周，结果参见图2。如图2所示，本发明的可湿性粉剂在54℃下存储至少6周后表现出对烟草花叶病毒的抗病毒活性。因此，依据韩国农村振兴厅通告的农业化学物登记检测准则和方法，为本发明的可湿性粉剂设定三年的有效期。
实施例5：针对KBPF-004的25％可湿性粉剂对植物病毒的抑制作用的测试
<5-1>对烟草花叶病毒感染的浓度依赖性抑制作用
为了测试KBPF-004的25％可湿性粉剂依其浓度对烟草花叶病毒的抑制作用，使用识别病毒基因组RNA(蛋白衣壳区域)特定核苷酸序列的引物对烟草叶片进行了RT-PCR(逆转录酶-聚合酶链式反应)检测(Choi等，Plant Pathol.J.，14：7-12，1998；Yoon，Doctoral Thesis，Seoul Women′sUniv.，Seoul，166，2003)，结果参见图3。
如图3所示，当烟草叶片经0.005g/ml至0.02g/ml量的KBPF-00425％可湿性粉剂处理后，未检测到烟草花叶病毒。该结果证明KBPF-004菌株有效地抑制烟草花叶病毒感染。
<5-2>对植物病毒感染的防治作用
为检测KBPF-004 25％可湿性粉剂对植物病毒单一和复合感染的防治作用，用喷雾器将<4-1>中获得的KBPF-004 25％可湿性粉剂的1000倍稀释液喷洒到Chungyang红辣椒上。然后，分别或联合于其上接种辣椒斑驳病毒(PepMoV)、辣椒轻型斑驳病毒(PMMoV)和黄瓜花叶病毒(CMV)，采用RT-PCR法鉴别是否可检测到RT-PCR产物。结果参见图4。
如图4所示，无论物种为何，仅接种PepMoV的Chungyang红辣椒长达30-40天未出现病毒，而接种了辣椒斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的Chungyang红辣椒长达30天未出现病毒。
还采用ELISA(酶联免疫吸附测定)(Clark，等，J.Gen.Virol.34：475-483，1977)分析已通过RT-PCR分析证实对其具有抗病毒活性的辣椒斑驳病毒、辣椒斑驳病毒+辣椒轻型斑驳病毒和辣椒斑驳病毒+黄瓜花叶病毒样本，结果参见表9。
<表9>
Figure BPA00001380755700181
如表9所示，本发明的KBPF-004菌株在分子和抗血清水平显示了显著的防治作用。
<5-3>对病毒基因组RNA的感染抑制作用
为了检测KBPF-004的25％可湿性粉剂对辣椒轻型斑驳病毒(PMMoV)基因组RNA的感染抑制作用，将<4-1>中获得的KBPF-00425％可湿性粉剂的1000倍稀释液喷洒到烟草(粘毛烟草，Nicotianaglutinosa)植物上。然后，将辣椒轻型斑驳病毒的基因组RNA接种到植物上，检测了感染抑制作用，结果参见表10。
<表10>
Figure BPA00001380755700191
如表10所示，KBPF-004 25％可湿性粉剂处理组未出现病毒感染，而未处理组出现了PMMoV感染，这提示KBPF-004菌株直接影响病毒基因组RNA。
<5-4>抗性诱导作用
为了检测KBPF-004的25％可湿性粉剂的抗性诱导作用，将KBPF-004 25％可湿性粉剂的1000倍稀释液喷洒到两个烟草种(珊西烟草和粘毛烟草)的下部叶片上。10天后，在其上接种辣椒轻型斑驳病毒。计算防治值，结果参见表11。
<表11>
Figure BPA00001380755700192
如表11所示，KBPF-004的25％可湿性粉剂处理组，在第1和第2上部叶片以及经处理叶片(下部叶片)中都出现了对辣椒轻型斑驳病毒的防治作用。因此，证明KBPF-004的25％可湿性粉剂具有抗性诱导作用和对病毒感染与复制的直接抑制作用。
<5-5>通过电子显微镜证实的病毒抑制作用
为了证实本发明微生物制剂的直接病毒抑制作用，通过电子显微镜分析了KBPF-004菌株对病毒颗粒或病毒衣壳蛋白的作用。
分别将烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯Y病毒(PVY)接种到宿主植物(本塞姆氏烟草，Nicotiana benthamiana)进行复制。两周后，分别收集50g系统感染的叶片并纯化病毒颗粒。之后，将纯化的病毒颗粒与1/100稀释的KBPF-004 25％可湿性粉剂(1000ppm)以1∶1比率(v/v)混合，采用电子显微镜检测法分析所得到的混合物。结果参加图5。
如图5所示，KBPF-004 25％可湿性粉剂处理组中病毒颗粒的长度较短，这表明TMV或PVY颗粒被KBPF-004菌株分割。
此外，采用烟草半叶法检测以上获得的被分割的病毒颗粒样品是否保留病毒活性，结果参见图6。结果，被分割的病毒颗粒的数目随菌株处理时间而增加，而宿主植物感染损伤数迅速地降低。
实施例6：KBPF-004菌株对主要植物病毒病的效力
<6-1>效力筛选
为了评价KBPF-004菌株的微生物制剂对主要植物病毒的效力，对多种温室盆栽植物进行效力筛选。
依照筛选植物病毒病的一般方法，筛选在幼苗(幼小植物)和成体植物(如果有必要)中进行。
对于效力筛选，采用烟草花叶病毒组(例如烟草花叶病毒、黄瓜绿斑点花叶病毒和辣椒轻型斑驳病毒)；马铃薯Y病毒组(例如辣椒斑驳病毒、小西葫芦黄花叶病毒、马铃薯Y病毒和西瓜花叶病毒)；南瓜花叶病毒组(例如黄瓜花叶病毒)作为植物病毒，采用烟草、辣椒、小西葫芦、黄瓜、西瓜、南瓜、卷心菜和甜瓜作为宿主植物。
具体地，将<4-1>中获得的KBPF-00425％可湿性粉剂的250-、500-、和1000-倍稀释液分别喷洒到宿主植物中，使用量为20L/1000m2，并对其接种对应植物病毒的1000-倍稀释液。对烟草花叶病毒通过烟草半叶法的结果来评价微生物制剂的效力，对于其它病毒则依据下式通过采用病株率(％)计算防治值来评价微生物制剂的效力(◎：优秀；○：良好；△；不足；和X：差)。结果参见表12。
病株率(％)＝(发病植物数/受试植物数)×100
防治值(％)＝[1-(经处理植物的病株率/未处理植物的病株率]×100)
<表12>
Figure BPA00001380755700211
<6-2>评价对烟草花叶病毒的田间效力
在<6-1对辣椒斑驳病毒防治效力的检测中，计算了在接种烟草花叶病毒4周后KBPF-00425％可湿性粉剂的防治值，结果参见表13。结果，500倍和1000倍稀释液的防治值分别为90.8％和76.8％，高于脱脂乳粉对照组的防治值。因此，KBPF-004菌株的抗病毒活性物质表现出浓度依赖式的防治作用。
<表13>
Figure BPA00001380755700221
<6-3>评价对辣椒斑驳病毒的田间效力
在<6-1>对辣椒斑驳病毒防治效力的检测中，计算了KBPF-004的25％可湿性粉剂的防治值，结果参见表14和图7。500倍和1000倍稀释液对辣椒斑驳病毒的感染抑制率均为100％。此外，在未处理组中，辣椒斑驳病毒的感染率在处理前为5.4％，并在处理后增加至11.8％。然而，在KBPF-004的25％可湿性粉剂处理组，辣椒斑驳病毒的感染率在处理后降低，且病毒不再传播。
<表14>
<6-4>评价KBPF-004菌株对温室中的水稻条纹病毒的效力
在<6-1>对水稻条纹病毒的防治效力的检测中，在接种带病毒的昆虫(灰飞虱，Laodelphax striatllus F)前一天，分别向水稻幼苗喷洒KBPF-00425％可湿性粉剂的500倍和1000倍稀释液。接种带病毒的昆虫14天后，计算防治值。如表15和图8结果所示，与未处理组相比，500倍稀释液表现出了极佳的防治效力。
<表15>
Figure BPA00001380755700231
此外，直接喷洒500倍稀释的KBPF-004 25％可湿性粉剂到带病毒的昆虫(灰飞虱)上，在此一天后，将所述昆虫接种到水稻幼苗上。如前述计算抑制值。如表16所示，水稻条纹病毒的传播率显著降低。
<表16>
Figure BPA00001380755700232
<6-5>评价KBPF-004颗粒剂对烟草花叶病毒的效力
为了检测实施例<4-1>中获得的KBPF-0042.5％颗粒剂处理土壤时的防治效力，将感染了烟草花叶病毒的烟草植物冷冻干燥并研磨以制备感染源。将1g这样获得的感染源与100g床土混合制备带病土壤。然后，将1g KBPF-0042.5％颗粒剂与100g带病土壤均匀混合，将局部损伤的三叶阶段的宿主植物烟草(珊西烟草)移植至该土壤中并在温室中培育3周。
如表17和图9所示，未处理组中的烟草幼苗枯萎。但在KBPF-0042.5％颗粒剂处理组中烟草幼苗如健康植物一般生长良好。
<表17>
Figure BPA00001380755700241
<6-6>评价对番茄黄化曲叶病毒的田间效力
将实施例<4-5>中获得的KBPF-004 70％AS的500倍稀释液与常规杀虫剂(如呋虫胺可湿性粉剂(Dinotefuran
Figure BPA00001380755700242
WP)、呋虫胺水分散颗粒剂(DinotefuranWG)、螺甲螨酯悬浮浓缩剂(Spiromesifen
Figure BPA00001380755700244
SC)、敌敌畏乳油剂(DichlorvosEC)和阿米曲拉+噻嗪酮乳油剂(Amitraz+buprofezin EC))混合并将混合物喷洒到番茄植物上。所产生的防治值为99.9％。相比之下，当多杀菌素水分散颗粒剂(Spinosad WG)、啶虫脒可湿性粉剂(Acetamiprid WP)、呋虫胺水分散颗粒剂(DinotefuranWG)、螺甲螨酯悬浮浓缩剂(Spiromesifen SC)和甲氨基埃玛菌素乳油剂(Emamectin benzoate EC)以7天为间隔替换地喷洒到植物上时，计算所得的病株率为80.2％。
<表18>
Figure BPA00001380755700246
尽管针对以上具体实施方案对本发明进行了描述，但应该理解，如所附权利要求中所定义的，本领域技术人员对本发明进行各种修改和改变也在本发明范围内。
          国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
                            国际表格
                     收到原始保藏材料的证明
                       根据第7条第1款颁发
给：LEE，Byung Man
    137-070Seoul特别市瑞草区瑞草洞#1337-4
    大韩民国
Figure BPA00001380755700251
Figure IPA00001380755100011

Claims (10)

1.具有针对植物病毒病的防治活性的食油假单胞菌(Pseudomonasoleovorans)菌株KBPF-004(KCTC 10159BP)。
2.权利要求1所述食油假单胞菌菌株的培养物。
3.权利要求2所述培养物的干粉。
4.权利要求3的干粉，其中所述干粉通过冷冻干燥或喷雾干燥制备。
5.用于防治植物病毒病的微生物制剂，其包含作为活性成分的食油假单胞菌菌株KBPF-004(KCTC 10159BP)、其培养物或所述培养物的干粉。
6.权利要求5的微生物制剂，其包含按重量计2.5至70％的食油假单胞菌菌株、其培养物或所述培养物的干粉；按重量计2至30％的表面活性剂；和剩余量的载体。
7.权利要求6的微生物制剂，其中所述表面活性剂为阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或其混合物。
8.权利要求6的微生物制剂，其中所述载体选自膨润土、滑石、粘土、高岭土、碳酸钙、硅石、浮石、硅藻土、酸性瓷土、沸石、珍珠岩、白炭、硫酸铵、尿素、葡萄糖、糊精、水及其混合物。
9.权利要求5的微生物制剂，其形式选自可湿性粉剂(WP)、水分散颗粒剂(WG)、浓缩悬浮剂(SC)、颗粒剂、水悬浮剂(AS)、可溶性粉剂(SP)、水溶性颗粒剂(SG)和胶囊剂。
10.权利要求5的微生物制剂，其中所述植物病毒病由选自以下的植物病毒组引起：青葱X病毒属(Allexivirus)、苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)、葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)、大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)、菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)、毛状病毒组(Capillovirus)、香石竹潜病毒组(Carlavirus)、香石竹斑驳病毒组(Carmovirus)、花椰菜花叶病毒组(Caulimovirus)、线形病毒组(Closterovirus)、豇豆花叶病毒组(Comovirus)、南瓜花叶病毒组(Cucumovirus)、长线状病毒属(Crinivirus)、质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)、蚕豆萎蔫病毒组(Fabavirus)、弯曲病病毒科(Flexiviridae)、凹陷病毒属(Foveavirus)、真菌传杆状病毒组(Furovirus)、双粒病毒组(Geminivirus)、大麦病毒组(Hordeivirus)、等轴不稳定环斑病毒组(Ilarvirus)、黄矮病毒组(Luteovirus)、葡萄斑点病毒属(Maculavirus)、线虫传多面体病毒组(Nepovirus)、马铃薯X病毒组(Potexvirus)、马铃薯Y病毒组(Potyvirus)、植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)、马铃薯病毒属(Pomovirus)、温州蜜柑矮缩病毒属(Sadwavirus)、Taastrupvirus、细病毒组(Tenuivirus)、烟草花叶病毒组(Tobamovirus)、烟草脆裂病毒组(Tobravirus)、番茄丛矮病毒组(Tombusvirus)、番茄斑萎病毒属(Tospovirus)、发状病毒属(Trichovirus)及其组合。
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