KR100545385B1

KR100545385B1 - 식물바이러스병 방제 효과를 갖는 슈도모나스 플루오레센스 Ｇｐｆ01[ＫＣＣＭ10642Ｐ]

Info

Publication number: KR100545385B1
Application number: KR1020050011185A
Authority: KR
Inventors: 임춘근; 허장현; 김성수; 박덕환; 구준학; 나게쉬 이퍼; 이상용; 이혜진
Original assignee: 주식회사 파이오니아
Priority date: 2005-02-07
Filing date: 2005-02-07
Publication date: 2006-01-24

Abstract

본 발명은 식물바이러스병 방제 효과를 갖는 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 국내에서만 존재하는 오이 모자이크 바이러스(CMV), 담배 모자이크 바이러스(TMV) 등의 다양한 식물바이러스병을 효율적으로 방제하는 신규 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Gpf01[KCCM10642P] 균주, 이 균주의 배양액, 이 배양액 추출물, 이 추출물의 제조방법 및 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물바이러스병 방제제에 관한 것이다.

식물바이러스병, 방제, 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01, 오이 모자이크 바이러스(CMV), 담배 모자이크 바이러스(TMV)

Description

식물바이러스병 방제 효과를 갖는 슈도모나스 플루오레센스 Ｇｐｆ01[ＫＣＣＭ10642Ｐ]{Control of plant viruses with extracts of endemic strain, Pseudomonas fluorescens Gpf01[KCCM10642P]}

도 1은 본 발명에 따른 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주의 유전학적 특성을 RAPD를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주의 16S rRNA 유전자를 분석하여 계통분류학적 위치를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주의 16S-23S ITS 지역을 분석하여 계통분류학적 위치를 나타낸 것이다.

도 4는 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 배양액 추출물의 항식물바이러스 방제 효과를 규명하기 위하여 균주로부터 배양액 추출물층을 분획하는 과정을 나타낸 것이다.

도 5는 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양액 추출물을 담배에 처리하였을 때, 상위엽에서의 바이러스병 발생을 방제하는 전신유도저항성을 나타낸 것이다[Gpf01 : 담배 하위엽에 배양액 추출물 처리, 증류수 : 담배 하위엽에 증류수 처리(대조구), MH배지 : 담배 하위엽에 MH배지 처리(대조구), 화살표 : 증류수와 MH배지를 처리한 담배엽에서의 오이 모자이크 바이러스(CMV) 병징].

도 6은 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양액 추출물을 담배에 처리하였을 때, 오이 모자이크 바이러스 외피단백질(coat protein) 유전자의 생성이 억제되는 결과를 RT-PCR 기법으로 분석한 것이다[Lanes 1 : 건전주, 2-5 : 이병주, 6-9 : 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 추출물을 처리한 이병주, M : 100bp ladder].

도 7은 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양액 추출물을 담배 엽에 처리하였을 때, 오이 모자이크 바이러스 외피단백질(coat protein)의 생성이 억제되는 결과를 웨스턴 블랏팅 기법으로 분석한 것이다[Lanes 1 : 순수분리한 오이 모자이크 바이러스(CMV), 2 : 건전주, 3-6 : 이병주, 7-10 : 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 추출물을 처리한 이병주].

도 8은 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주로부터 추출한 항식물바이러스 물질이 수용성인지 아니면 지용성인지를 판단하기 위한 분획과정을 설명한 모식도이다.

도 9는 한외여과(ultra filtration)를 이용하여 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주로부터 추출한 항식물바이러스 물질의 분자량을 검정하기 위한 방법을 나타낸 것이다.

도 10은 도 9에서 검정된 분자량 3,000 ~ 10,000의 항식물바이러스 추출물을 분획한 후, 오이 모자이크 바이러스에 대한 항식물바이러스 효과를 검정한 결과를 나타낸 것이다.

국내 원예작물의 국내 총 재배면적은 76,453 ha로 매년 증가하는 추세인데 (98년도 농림통계 연보, 고령지농업시험장 자료; 감자 - 23,252 ha, 봄 재배 배추 - 22,824 ha, 고령지 재배 무 - 3,426 ha), 감자, 고추, 오이, 토마토 등의 과채류, 무, 배추, 당근 등의 엽채류, 상추, 결구상추, 치커리 등의 양채류, 고사리, 고추냉이, 더덕 등의 산채류 그리고 국화, 카네이션, 호접란 등의 화훼류를 포함하는 대부분의 원예작물에서 바이러스 병이 발생하고 있으며, 이로 인한 경제적 피해가 매우 심각한 수준에 이르고 있다[2000 농업과학기술원 주요연구 성과 "종자전염 바이러스의 발생생태 및 방제에 관한 연구; 2004 원예연구소 주요연구 성과 "원예작물 품질향상을 위한 바이러스 진단 및 안전방제기술 개발].

원예작물에 피해를 주고 있는 바이러스로는 CMV, TMV, PVX, PVS, PVM, PVA, PVY, PLRV, PSTVd, TuMV 등 매우 다양하며, 집단재배 방식이 일반화되고 있는 현실을 감안해 볼 때 이들 바이러스에 의한 피해는 증가할 것으로 예상된다. 이러한 식물바이러스를 방제하기 위해서 무병종자를 이용하여 작물을 재배하는 경종적 방법, 바이러스 저항성 품종 육성 등의 방법이 있으나 그 효과는 미비하다.

한편, 바이러스 외피 단백질 유전자(coat protein gene), 복제관련 유전자 (replicase-associated gene), 위성 RNA 유전자(satelite RNA gene), 바이러스 이동 단백질 유전자(movement gene), 안티센스 유전자(antisense gene), 라이보좀 불활성화 단백질 유전자(ribosome inactivating protein gene) 등의 유전자를 식물체내로 도입하여 바이러스에 저항성을 나타내는 형질전환 식물체를 개발하고 있으나, 산업적으로 성공하기 위해서는 많은 시간이 필요하다[Fitchen, J. H. and Beachy, R. N. 1993. Genetically engineered protection against viruses in transgenic plants. Annu. Rev. Microbiol. 47:739-763].

따라서, 최근에는 미생물을 이용하여 식물바이러스를 방제하고자 하는 생물학적 방제법 개발에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 특히, 생물학적 방제법은 자연 생태계를 보존하고 인축에 독성이 없는 환경친화적 방제법으로 그 수요가 증가하고 있다.

국외의 경우, 미생물을 식물체에 직접 처리하여 바이러스병을 방제하고자 하는 연구가 진행되고 있으나, 미생물 추출물을 이용하여 바이러스병을 방제하고자 하는 연구는 매우 미약한 수준이다. 국내의 경우, 미생물을 직접 식물체에 처리 하여 바이러스병을 방제하고자 하는 연구가 최근 시도되고 있으나, 본 발명처럼 국내 토착 슈도모나스(Pseudomonas) 균의 배양액 추출물을 이용하여 바이러스병을 방제하고자하는 연구는 전무한 실정이다.

특히, 기존 대한민국 특허 등록 제 317666호에 기재된 슈도모나스 플루오레센스 균주는 세균병인 감자더뎅이병 방지용 분의제를 개발하기 위한 것이며, 대한민국 특허 등록 제 347721호의 슈도모나스 플루오레센스 균주는 진균인 고추 역병균에 대한 방제효과의 특성을 기술한 것이다. 따라서, 상기 두 균주는 각각 세균 및 진균에 대한 방제효과를 기술한 것으로, 세균과 진균과는 전혀 다른 생물학적 분류를 갖는 바이러스에 대한 항균 활성을 가진 신균주 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01 균주를 분리한 점에 큰 의의를 갖는다. 특히, 본 발명에 따른 슈오모나스 플루오레센스 Gpf01 균주 이의 배양액 및 이 추출물은 식물바이러스에 대한 매우 우수한 방제효과를 지니고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 기존의 슈도모나스 플루오레센스와는 다른 식물병인 식물바이러스병 방제 효과가 우수한 새로운 미생물을 선발하고자 연구 노력한 결과, 강원도 홍천 인삼재배지에서 새로운 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P]를 분리하였고, 이 균주가 항식물바이러스 활성 물질을 가장 효과적으로 생산할 수 있는 배양조건을 최적화시켰으며, 이 균주로부터 항식물바이러스 물질을 대량으로 추출할 수 있는 기술을 개발하였다.

또한, 국내 토착 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양액의 추출물을 작물에 처리하였을 때 식물바이러스를 매우 효과적으로 방제할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 식물바이러스병 방제 효과를 갖는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Gpf01[KCCM10642P], 이로부터 얻은 배양액 추출물, 이의 제조방법 및 식물바이러스병 방제제로서의 용도를 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명은 식물바이러스병 방제 효과를 갖는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Gpf01[KCCM10642P]를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 얻은 배양액 추출물 및 이의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물바이러스병 방제제를 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 국내에서만 존재하는 오이 모자이크 바이러스(CMV), 담배 모자이크 바이러스(TMV) 등의 다양한 식물바이러스병을 효율적으로 방제하는 신규 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Gpf01[KCCM10642P] 균주, 이 균주의 배양액, 이 배양액 추출물, 이 추출물의 제조방법 및 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물바이러스병 방제제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 신규 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01은 강원도 홍천 인삼재배지에서 항식물바이러스 효과를 가장 우수하게 나타내는 미생물을 선발하여 분리·동정한 결과, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)로 동정되어졌다. 특히, 기존의 슈도모나스 플루오레센스는 식물병원균 중 세균병인 감자더뎅이병과 진균병인 고추역병을 방제하는 특성인 반면, 신규 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01균주는 식물바이러스에 대한 매우 우수한 방제효과를 나타내는 국내 토착 균주인 점에 차이점이 있다. 상기 신규 균주를 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01로 명명하고, 한국미생물보존센터에 2005년 1월 19일자로 기탁하였으며, 수탁번호는 KCCM 10642P이다. 또한, 신규 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주가 항식물바이러스 활성 물질을 가장 효과적으로 생산할 수 있는 배양배지 및 온도조건을 규명하였으며, 본 균주로부터 항식물바이러스 물질을 대량으로 추출할 수 있다.

또한, 국내 토착 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양액의 추출물을 작물에 처리하였을 때 식물바이러스를 매우 효과적으로 방제할 수 있음을 확인하였다. 이는 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 및 균주 배양액의 추출물이 식물체에 처리되면, 식물세포가 식물바이러스에 전신유도저항성(SAR)을 유도하여 식물바이러스를 방제하는 것임을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 식물바이러스병 방제 효과를 갖는 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 배양 추출물을 포함한다.

상기 추출물의 제조과정을 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P]를 MH(Muller Hinton) 배지에서 25 ~ 30 ℃에서 12 ~ 48 시간 배양하여 배양여액 및 균체 추출물을 얻는다. 이때, 상기 배양온도 범위를 벗어날 경우에는 균의 생장이 저조할 뿐만 아니라 이로부터 분획한 추출물의 항바이러스 방제효과가 급격히 감소하는 문제점이 있고, 또한 배양시간이 12시간 미만일 경우에도 추출물의 항바이러스 방제효과가 급감하는 문제가 있고, 48 시간을 초과하면 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01 균주의 자가용출에 의한 항바이러스 물질의 분해 문제가 있어 바람직하지 못하다.

상기에서 얻은 배양여액을 95 ~ 100 ℃에서 10 ~ 30 분간 열처리하고 항식물바이러스 활성 물질을 크로마토그래피로 분획하여 배양액 추출물을 수득한다. 상기 열처리 온도가 95 ℃ 미만의 경우에는 오염원의 제거가 완벽히 이루어지지 않는 문제점이 있고, 100 ℃를 초과하면 항식물바이러스 방제 효과가 감소하는 문제점이 있다. 또한, 10분 미만으로 열처리하면 오염원의 제거가 완벽히 이루어지지 않는 문제가 있고, 30분을 초과하면 항식물바이러스 방제 효과가 감소하는 문제가 있어 바람직하지 못하다. 즉, 본 발명의 항식물바이러스 활성 물질은 열처리과정을 거치면서 식물바이러스에 전신유도저항성(SAR)을 유도하여 식물바이러스병을 방제할 수 있는 것이다.

이렇게 추출된 항식물바이러스 활성 물질은 분자량이 3,000 ~ 10,000인 것으로, 다른 분획물에 비해 우수한 식물바이러스 방제 효과를 나타내었다.

또한, 본 발명은 상기 추출 단계별에서 얻어진 각각의 수득물(균체, 배양여 액, 추출물)을 유효성분으로 함유하는 식물바이러스병 방제제 등의 생물농약을 포함한다.

이러한 생물농약은 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 외에 농약제제로 사용가능한 담체를 함께 사용하여 제조될 수 있다. 담체로는 통상적으로 사용되는 농약제형으로 허용가능한 담체면 모두 사용할 수 있으나, 특히 동결방지제 글리세린(glycerin), PG와 전착제 SOF70, 계면활성제 TD20A, AS65D 등을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 유효성분은 전체 미생물제제 조성물에 대하여 0.001 ~ 90%를 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기로는 본 발명에 따른 균주 배양액 추출물을 100 ~ 1,000배 희석하여 액제로 제제화시킨다. 이렇게 제조된 미생물제제를 오이 모자이크 바이러스(CMV), 담배 모자이크 바이러스(TMV), 감자 바이러스 Y(PVY) 등에 감염된 식물에 분무하여 정식 후 10일부터 또는 발병직전 시기에 식물체 지상부에 경엽 처리 방법으로 처리하는 것이 바람직하다.

이러한 미생물제제는 식물바이러스병 방제제, 종자코팅제, 미생물영양제, 토양개량제 등의 전반적인 농약제로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 국내 토착 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 분리 및 동정

1) 생리 · 생화학 동정

강원도 홍천 인삼 재배지에서 미생물들을 다수 분리한 후, 항식물바이러스 효과를 가장 우수하게 나타내는 본 균주를 선발하여 Schaad의 지침서[Schaad, N. W. 1988. Initial identification of common genera. In: Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria, ed. by N. W. Schaad. American Phytopathological Society., Minnesot. pp. 60-80] 및 Bergey's manual[Lelliott, R. A. and Dickey, R. S. 1984. Genus Pseudomonas. In: Bergey's Manual of Systemic Bacteriology. vol. 1, pp. 141-199, Williams and Willkins Co., Baltimore/London]에 준하여 슈도모나스 속의 생리 · 생화학 실험들을 수행하였으며, 그 결과는 다음 표 1과 같다.

즉, 상기 분리 Gpf01 균주는 슈도모나스 속에서의 종을 분류하는데 있어서 주요 특성이 되는 레반(levan), 옥시다아제(oxidase), 아르기닌 분해(arginine dihydrolase), 펙테이트 분해(pectolytic activity) 및 과민반응(tobacco HR test)등의 특성을 나타내어 Gpf01 균주는 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens)로 동정되었다.

Gpf01 균주의 생리 · 생화학 동정

Characterastic	Gpf01	P. fluorescensATCC31125	P. putida	P. cichorii	P. viriflava
Diffusable fluroescent pigment	+	+	+	+	+
Non-diffusable pigment	ND	ND	-	-	v
Levan	+	+	-	-	-
Oxidase	+	+	+	+	-
Arginine dihydrolase	+	+	+	-	-
Pectolytic activity	-	-	-	-	+
Tobacco HR	-	-	-	+	+
Growth at 37℃	-	-	-	-	-
Growth at 41℃	-	-	-
Growth at 4℃	-	-	+	ND	ND
Nitrate to N	+	+	-	-	-
PHB	-	-	-	-	-
Gelatin hydrolysis	-	+	-	-	+
Ice nucleation	-	-		-	-
IAA production	-	-		-	-
Utilization of:
2-ketogluconate	+	+	+	+	+
Mannitol	+	+	ND	+	+
Geraniol	-	-	-	-	-
Benzoate	ND	ND	+	-	-

(계속)

Characterastic	Gpf01	P. fluorescens(ATCC31125)	P. putida	P. cichorii	P. viriflava
Cellobiose	-	-	-	-	-
Sorbitol	-	-	v	-	+
Trehalose	-	+	-	-	-
Sucrose	-	-	ND	-	-
Meso-tartrate	+	-	-	+	+
D(-)-tartrate	-	+	ND	-	+
D-arabinose	+	+	+	-	-
L-rhamnose	-	-	-	-	-
D-aspartate	-	-		+	-
Growth on:
Nicotinate	-	-	+	ND	ND
D-galactose	+	+	v		ND
Butyrate	+	+	+	ND	ND
Valerate	ND	ND	+	ND	ND
Azalate	ND	ND	-	ND	ND
Meso-inositol	-	-	-	ND	ND
Adonitol	-	-	-	ND	ND
Propylene glycol	-	-	+	ND	ND
Ethanol	-	-	v	ND	ND
Lecithinase	+	+	-	ND	ND
Phenyl acetate	-	-	+	ND	ND
Butylamine	-	-	+	ND	ND
Trigonelline	+	+	+	ND	ND
+, 80% or more positive. -, 80% or more strains negative. ND, not determined; V, variable.

2) RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA) 분석에 의한 특성

상기 Gpf01 균주의 유전학적 특성을 알아보기 위해, RAPD를 실시하였다. 랜덤 프라이머(Random primer)로는 OPERON 10mer kit를 이용하였으며, 분리균주 DNA는 50 ng의 게놈 DNA를 사용하였고, PCR 반응은 10 mM tris-HCL(pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl_2,0.01% 젤라틴, 200 μM dNTP, 200 ng 프라이머 및 2.5U의 Taq 중합효소를 첨가하여 전체 반응액은 25 ㎕가 되게 하여 94 ℃ 1 min, 38 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min으로 45cycle 반응시켰다. 증폭된 PCR 산물은 5% 폴리아크릴아마이드 겔로 전기영동한 후, 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)용액에 염색하여 관찰하였다.

랜덤 프라이머 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 나타낸 B-05, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 15 및 16의 총 9개의 프라이머로부터 다형화 밴드양상을 얻을 수 있었으며, 이를 바탕으로 NTSYS 프로그램[Rolf, F. J. 1992. NTSYS. Numerical taxonomy and multivariate analysis system. version 1.70. Exeter, Setauket, New York]을 이용하여 계통도를 작성하였다[도 1].

그 결과, 상기 Gpf01 균주는 Pseudomonas fluorescens로 판명되었다.

3) 16S rRNA 유전자 분석에 의한 특성

상기 Gpf01 균주의 계통분류학적 위치를 알아보기 위해, 생명현상에 있어 필 수적이고 그 염기서열이 비교적 잘 보존되어 있으며, 통계학적으로 분석하기에 용이한 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 먼저, 서열번호 10으로 나타낸 fD1 프라이머와 서열번호 11로 나타낸 rP2 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 얻었다. 그 후 pGEM-T 벡터 시스템을 이용하여 클로닝하여 그 염기서열을 분석하였다.

상기 분석된 염기서열은 메가 프로그램[Kumar, S., Tamura, K. and Nei, M. 1993. MEGA: molecular evolutionary genetics analysis, version 1.0. The Pennsylvania State University, University Park.]에 의해 그 계통도를 작성한 결과 도 2와 같으며, 그 유사도로 볼 때 본 균주는 Pseudomonas spp. 속균에 속함을 알 수 있었다.

Gpf01 균주와Pseudomonas속 균주간 16S rRNA 유전자의 유사도

균주	Gpf01 균주의 16S rRNA 유전자 유사도 (%)
P. putida	97.4-97.7
P. fluorescens	95.0-95.7
P. alcaligenes	95.3-97.0
P. flavescens	95.7
P. monteilii	95.5-96.5
P. nitroreducens	95.4-95.9
P. straminea	94.5-95.4
P. plecoglossicida	97.3

4) 16S-23S ITS(Intergenic Transcribed Spacer) 지역 분석에 의한 특성

상기 Gpf01 균주의 ITS지역을 분석하기 위해, 서열번호 12로 나타낸 R16-1F와 서열번호 13으로 나타낸 R23-1R 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하었다. 그 후 pGEM-T 벡터시스템을 이용하여 클로닝한 후, 그 염기서열을 분석하였다. 상기 분석된 염기서열은 메가 프로그램[Kumar, S., Tamura, K. and Nei, M. 1993. MEGA: molecular evolutionary genetics analysis, version 1.0. The Pennsylvania State University, University Park.]에 의해 그 계통도를 작성한 결과 도 3과 같으며, 그 유사도로 볼 때 본 균주는 Pseudomonas fluorescens와 85.5 ~ 93.5%의 유사도로 가장 높게 나타나 동일한 그룹으로 판명되었다.

Gpf01 균주와Pseudomonas속 균주간 16S-23S ITS 지역 유사도

균주	Gpf01 균주의 16S-23S ITS 지역 유사도 (%)
P. fluorescens I	85.5-93.5
P. fluorescens II	73.0-75.1
P. gingeri	87.8-89.8
P. syringae	64.2-75.1
P. agarici	66.8-81.8
P. tolaasii	90.5-92.3

5) DNA-DNA 하이브리다이제이션에 의한 특성 분석

상기 Gpf01 균주의 전체 게놈 유사도를 조사하였다. 그 방법으로는 순수하게 분리된 전체 DNA를 1 ng/㎕로 정량하여 10 N NaOH를 첨가한 후, 80 ℃에서 10분간 끓여 DNA를 변성시켰다. 그 후 DIG-하이 프라임 시스템[Roche Molecular Biochemicals, Sandhofer Strasse 116, Germany]을 이용하여 탐침으로 사용할 DNA를 라벨링하여 나일론 막에 부착된 DNA와 함께 49 ℃에서 3시간동안 프리하이브리다이제이션을 시켰으며, 그 후 같은 온도에서 16시간동안 하이브리다이제이션 반응을 유도하였다. 반응이 끝난 막은 DIG 냉광 검출 킷[Roche Molecular Biochemicals, Sandhofer Strasse 116, Germany]를 이용하여 그 반응을 검정하였다.

그 결과, 상기 Gpf01 균주의 전체 게놈은 Pseudomonas fluorescens와 74%로, 일반적으로 동일종으로 분류되는 70% 이상의 유사도를 나타내어 상기 균주는 Pseudomonas fluorescens로 최종 판정되었다. 그 결과를 유사도로 표현하면 다음 표 4와 같다.

Gpf01 균주와Pseudomonas속 균의 전체 게놈 유사도

Source of unlabelled DNA	DNA hybridization (%)
Source of unlabelled DNA	P. fluorescens ATCC 31125
Gpf01 strain	74
P. fluorescens ATCC 31125	100
P. putida ATCC 17426	66
P. viriflava KACC10391	50
P. cichorii LMG2162	33

실시예 2 : 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주로부터 항식물바이러스 물질의 대량 추출

1) 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양 배지 선발

상기 균주의 최적 배양 배지를 선발하기 위하여, 4종류의 배지를 이용하여 항식물바이러스 효과를 조사하였다. 배지로는 MH(Muller Hinton Broth : Beef extract 3g, Casein Hydrolysate 17.5g, Starch1.5 g/L), NB(Nutrient Broth : Beef extract 3g, Bacto pepton 5g/L), LB(Luria Burtani broth :　Bacto tryptone 10g, Yeast extract 5g, Sodium chloride 5g/L), MGY(Manitol Glutamate Yeast Broth : Manitol 10g, L-Glutamic 2g, Potassium phosphate 0.5g, Magnesium sulfate heptahydrate 0.2g, Sodium chloride 0.2g, Yeast extract 0.25g/L) 배지에서 동일조건하에 진탕 배양하였다. 이후, 12000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 회수하여 반엽법으로 오이 모자이크 바이러스(CMV)에 대한 항식물바이러스 효과를 검정하였다.

그 결과, 상기 균주는 MH배지와 LB배지를 이용하여 배양하였을 경우, 각각 84.7%와 73.4%의 높은 방제효과를 나타내었으며 산업화에 적합한 MH배지를 대량생산용 배지로 선발하였다. 반면 MH배지 자체만을 식물체에 처리하였을 경우, 오이 모자이크 바이러스 방제효과가 없는 것으로 나타나 CMV에 대한 항식물바이러스 효과가 배지성분이 아닌 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주가 생산한 물질 때문임을 증명하였다. 한편, NB배지와 MGY배지에서 배양한 경우는 항식물바이러스 효과가 없는 것으로 나타났다[표 5].

Gpf01 균주의 배양 배지 선발

배지	오이 모자이크 바이러스(CMV) 방제효과 (%)
MH 배양여액	84.7
NB 배양여액	15.3
LB 배양여액	73.4
MGY 배양여액	0
MH 배지	13.0

2) 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양 온도 선발

상기 균주의 최적 배양 온도를 선발하기 위해, 다음 표 5에서 선발된 MH배지 를 이용하여 각각 15 ℃, 28 ℃, 37 ℃에서 24시간 배양하여 CFU(colony forming unit/ml)를 조사하였다.

그 결과, 상기 균주의 최적 배양 온도는 28 ℃에서 가장 많은 콜러니수를 나타내어 28 ℃가 최적 배양 온도로 선발되었다[표 6].

Gpf01 균주의 배양 온도 선발

배양시간 (h)	배양온도 (℃)
배양시간 (h)	15	28	37
24	5.2×10⁷cells/ml	1.2×10 ⁸ cells/ml	1.0×10⁸cells/ml

3) 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양 시간 선발

상기 균주의 최적 배양 시간을 선발하기 위해, 상기 표 5에서 선발된 MH배지를 이용하여 1, 3, 5, 7, 9, 12, 24, 48 및 72시간 배양하여 12000 rpm으로 10분간 원심분리한 후, 상층액을 회수하여 오이 모자이크 바이러스(CMV)에 대한 항식물바이러스 효과를 검정하였다.

그 결과, 상기 균주의 경우 12시간 배양에 이미 76%의 오이 모자이크 바이러스 방제효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 상기 균주는 12시간 이상 배양할 경우, 항식물바이러스 물질을 효과적으로 추출할 수 있음이 증명되었다[표 7].

상기 균주의 배양 시간 선발

배양 시간 (h)	오이 모자이크 바이러스 (CMV) 방제효과 (%)
1	34
3	43
5	42
7	42
9	51
12	76
24	81
48	85
72	86

4) 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양액 추출물의 항식물바이러스 효과 검정

상기 표 5에서 증명된 바와 같이, 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주의 항식물바이러스 물질은 배양액으로 분비되고, 배지자체에 의한 항식물바이러스 효과는 없음이 증명되었다. 따라서 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주가 생산하는 항식물바이러스 물질의 특성을 보다 정확하게 규명하고자 다음과 같은 분획실험을 수행하였다.

즉, 상기 균주의 배양여액과 균체를 실험목적에 따라 열처리 또는 초음파 처리한 후의 항식물바이러스 활성의 변화를 검정하였다. 도 4와 같이 12,000 rpm 원심분리를 통하여 분리된 배양여액을 95 ℃에서 10분간 열처리(boiling)하였으며, 균체는 10초간 10회 초음파처리(sonicated) 및 95 ℃ 10분간 열처리하여 오이모자이크 바이러스(CMV)에 대한 방제효과를 조사하였다.

그 결과, 배양여액을 열처리하여 추출한 배양액 추출물층에서 가장 높은 식물바이러스 방제효과를 나타내었으며, 균체, 균체 초음파처리층 그리고 균체 열처 리층에서도 높은 식물바이러스 방제효과가 확인되었다[표 8]. 특히, 본 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주의 경우 주요 항식물바이러스 물질을 세포외로 분비하며 열에 안정하다는 것이 증명되었다. 반면 대조구인 PBS 버퍼에서는 항식물바이러스 효과가 없었다. 따라서, 본 실험을 통하여 국내 토착 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주를 대량 배양한 후, 열처리하여 항식물바이러스 물질을 포함하는 추출물을 대량 생산할 수 있고 나아가서는 산업화도 쉽게 이루어질 수 있음이 증명되었다.

Gpf01[KCCM10642P] 배양액 추출물의 CMV 방제효과

처리구	CMV 감염억제효과(%)
Gpf01균주 배양액 추출물 열처리층	90.4
균체	72.7
균체 초음파처리층	61.9
균체 열처리층	71.0
PBS 버퍼	11.1

5) 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 추출물의 항식물바이러스 지속기간

슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양액 추출물의 식물바이러스 방제효과 지속기간을 조사하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다. 즉 배양액 추출물을 식물체에 처리한 후 시간을 달리하여 각 바이러스를 접종하여 방제효과를 관찰하였다. 담배 모자이크 바이러스(TMV) 방제효과는 담배(N. glutinosa)를 이용하였으며, 오이 모자이크 바이러스(CMV)는 명아주(C. amaranticolar)를 사용하였다.

그 결과, 담배 모자이크 바이러스의 경우 처리 11일 후까지, 오이 모자이크 바이러스 경우는 처리 13일후까지 매우 안정한 항식물바이러스 효과를 나타내었다[표 9].

Gpf01[KCCM10642P] 배양액 추출물의 항식물바이러스 지속기간

Gpf01 배양액 추출물 처리 후 바이러스 접종 일수	담배 모자이크 바이러스(TMV) 방제효과 (%)	오이 모자이크 바이러스(CMV) 방제효과 (%)
1	100	98.6
3	99.1	98.6
5	98.7	95.2
7	94.7	93.5
9	80.2	88.2
11	92.4	86.7
13	82.4	83.8
15	75.6	72.6

6) 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양액 추출물 처리에 의한 식물의 항식물바이러스 전신유도저항성(SAR : systemic acquired resistance)

상기 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양액 추출물층 처리에 의한 식물의 항식물바이러스 전신유도저항성(SAR)을 검정하였다. 바이러스는 오이 모자이크 바이러스(CMV)를 선택하였으며, 기주식물로는 오이 모자이크 바이러스의 전신기주인 담배(N. tabacum cv. Xanthi-nc)를 이용하였다. 처리방법은 하위엽 하나를 선택하여 본 배양액 추출물층을 처리한 후, 다른 하위엽에 오이 모자이크 바이러스를 접종하여 상위엽에 바이러스 병징이 나타나는지를 6반복으 로 관찰하였다. 대조구로는 MH배지와 증류수를 사용하였으며, 배양액 추출물층 처리와 동일한 방법으로 처리하였다.

그 결과, 배양액 추출물층을 처리한 모든 구에서는 접종 하위엽 뿐만 아니라 상위엽에서의 바이러스 병징이 전혀 나타나지 않아, 전신유도저항성 효과를 분명히 관찰할 수 있었다[도 5]. 반면, MH배지와 증류수만을 처리한 담배에서는 접종엽 및 상위엽에서 모두 매우 심한 오이 모자이크 바이러스병이 발생하여 전신유도저항성이 관찰되지 않았다[도 5].

또한, 전신유도저항성(SAR)에 의한 항식물바이러스 효과를 보다 정확하게 분석하고자 RT-PCR과 웨스턴 블랏팅(western-blotting)을 실시하였다. 그 결과, 본 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 추출물층을 처리한 엽에서는 각각 바이러스의 외피단백질 유전자와 외피단백질이 검출되지 않아 항식물바이러스 효과가 배양액 추출물층 처리에 의한 식물의 전신유도저항성(SAR)임이 재확인되었다[도 6, 7].

실시예 3 : 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 추출물로부터 항식물바이러스 물질 분리

1) 유기용매를 이용한 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양액 추출물층의 수용성 확인

도 4에 준하여 추출한 배양액 항식물바이러스 추출물층의 극성을 확인하였 다. 즉, 추출물층 500 mL에 n-헥산[CH₃(CH₂)₄CH₃], 디클로로메탄[CH ₂Cl₂], 에틸아세테이트[CH₃COOC₂H₅], 부탄올[CH₃(CH₂)₂OH], 증류수로 분획[도 8]한 다음 각각의 분획층을 진공 농축장치(vacuum rotary evaporator)로 완전 농축하여 동결 건조시켰다. 동결 건조된 분획물을 증류수 10 mL로 재용해하여 오이 모자이크 바이러스(CMV) 방제효과를 조사하였다

그 결과, 증류수 층에서 57.9%, n-헥산, CH₂Cl₂, EtOAc, BuOH 층에서 각각 4.9%, 2.4%, 18.1%, 22.7% 방제효과를 나타냈다. 따라서, 본 배양액 추출물의 항식물바이러스 물질이 수용성을 지니고 있는 것으로 판단되었으며, 물로써 쉽게 추출이 가능하였다[표 10].

유기용매를 이용한 Gpf01 균주 배양액 추출물층의 수용성 확인

시료	오이 모자이크 바이러스 (CMV) 방제효과 (%)
무처리	-
추출물층	78.5
n-헥산 층	4.9
CH₂Cl₂ 층	2.4
EtOAc층	18.1
BuOH 층	22.7
증류수 층	57.9

2) 한외여과(ultra filtration)를 이용한 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 배양액 추출물 유래 항식물바이러스 물질 분자량 검정

배양액 추출물층으로부터 항식물바이러스 물질의 분자량을 알아보기 위하여 한외여과법으로 추출물층을 분획하여 오이 모자이크 바이러스(CMV)에 대한 방제효과를 조사하였으며[도 9], 그 결과는 다음 표 11과 같다. 즉, 분자량 3,000 ~ 10,000 사이에서 분획한 추출물이 89.3%로 가장 높은 바이러스 방제효과를 나타내었으며, 분자량이 3,000보다 작거나 10,000보다 클 경우에는 28.9% 이하의 낮은 바이러스 방제효과를 나타내었다. 따라서, 본 배양액 추출물층의 항식물바이러스 물질은 고분자 화합물이 아니라 분자량 3,000 ~ 10,000사이의 저분자 화합물임을 알 수 있었다.

한외여과법을 이용한 추출물층의 항식물바이러스 물질 분자량 검정

시료	오이 모자이크 바이러스 (CMV) 방제효과 (%)
무처리	-
M.W.^a) > pore size 0.2 mm	28.9
100,000 < M.W. < pore size 0.2 mm	8.4
10,000 < M.W. < 100,000	3.1
3,000 < M.W. < 10,000	89.3
M.W. < 3,000	0
a) 분자량

3) 겔 여과 크로마토그래피를 이용한 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 추출물(분자량 3,000 ~ 10,000)의 항식물바이러스 방제 효과

한외여과법으로 분리한 분자량 3,000 ~ 10,000 사이의 물질을 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 분획하였으며, 그 분석 조건은 다음 표 12와 같다. 즉, 5 mL씩 분취된 150개의 분획은 다시 5개씩 그룹화(총 30개 시료)하여 동결 건조하였다. 이 후 각각의 시료는 증류수 10 mL로 재용해한 후 오이모자이크 바이러 스(CMV)에 대한 방제효과를 조사하였다.

겔 여과 크로마토그래피 분석 조건

기구	Low pressure liquid chromatograph (Bio-rad, U.S.A)
온도	4 ℃
이동상	d-water
고형상	Sephadex G50 (M.w. range : 500 - 30,000) (Amersham biosciences, U.S.A)
컬럼	15 mm × 500 mm (Bio-rad, U.S.A)
유속	1 mL min^-1
샘플 로딩 부피	5 mL
분획	15 mL/tube, total 150 tubes

그 결과 도 10에 나타낸 바와 같이 26, 27번 분획, 즉 1,875 ~ 2,025 mL 분획에 존재하는 물질이 가장 높은 항식물바이러스 효과를 지니고 있음이 확인되었다.

실시예 4 : 식물바이러스병 방제제 제조

한외여과법으로 분리한 분자량 3,000 ~ 10,000 사이의 물질을 300배로 희석하고, 여기에 동결방지제 글리세린, PG와 전착제 SOF70, 계면활성제 TD20A를 함유시켜 방제제를 제조하였다. 담배 모자이크 바이러스(TMV)에 감염된 식물에 정식 후 10일부터 경엽 처리(분무)하여 방제 효과를 확인한 결과, 식물바이러스병 방제율이 90% 이상 나타났다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서는 국내 토착 신규 슈도모나스 플루 오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주를 분리, 동정하였고, 본 균주와 이의 배양액 추출물을 이용할 경우 오이 모자이크 바이러스(CMV), 담배 모자이크 바이러스(TMV) 등의 다양한 식물바이러스병을 매우 효율적으로 방제할 수 있음이 증명되었다. 특히, 본 균주 배양액의 추출물은 열에 매우 안정하며 항식물바이러스 활성 물질은 분자량 3,000 ~ 10,000의 저분자량 화합물로 식물에 전신유도저항성(SAR)을 유도하여 식물바이러스병을 방제함을 알 수 있다.

따라서, 식물바이러스 방제를 위하여 본 국내 토착 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 또는 배양액 추출물은 미생물농약, 생화학농약, 친환경농자재 등의 다양한 형태로 산업화가 가능하게 되었다. 특히, 본 발명에 의해 개발된 식물바이러스제는 인체와 환경에 독성이 없는 환경친화적 특징을 지니고 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

분자량 3,000 ~ 10,000인 항식물바이러스 활성 물질을 생산하는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Gpf01[KCCM10642P].
슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 균주 또는 상기 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물바이러스병 방제제.
삭제
1) 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P]를 밀러 힌톤(Muller Hinton) 배지에서 25 ~ 30 ℃에서 12 ~ 48 시간 배양하여 균체와 배양여액을 얻는 단계; 및

2) 상기 배양여액을 95 ~ 100 ℃에서 10 ~ 30 분간 열처리하고, 증류수로 추출하는 단계; 및

3) 상기 추출물을 한외여과법으로 여과하여 분자량이 3,000 ~ 10,000 사이의 물질을 분리하고, 분리된 물질을 겔 여과 크로마토그래피로 분획하여 항바이러스 물질을 포함하는 배양액 추출물을 얻는 단계

을 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 배양액 추출물의 제조방법.
청구항 4의 방법으로 얻어진 것으로, 분자량이 3,000 ~ 10,000 범위인 항식물바이러스 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 배양액 추출물.
청구항 4의 방법으로 얻어진 분자량이 3,000 ~ 10,000 범위인 슈도모나스 플루오레센스 Gpf01[KCCM10642P] 배양액 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물바이러스병 방제제.