KR100646669B1

KR100646669B1 - 식물바이러스병 방제 효과를 갖는 세라티아 속 Ｇｓｍ０１

Info

Publication number: KR100646669B1
Application number: KR1020060014586A
Authority: KR
Inventors: 임춘근; 허장현; 박덕환; 나게쉬 이퍼; 조준모; 구준학; 김정은; 민용원
Original assignee: 주식회사 파이오니아
Priority date: 2006-02-15
Filing date: 2006-02-15
Publication date: 2006-11-23

Abstract

본 발명은 식물바이러스병 방제 효과를 갖는 세라티아 속 Gsm01에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 오이 모자이크 바이러스(CMV), 담배 모자이크 바이러스(TMV), 및 감자 바이러스 Y(PVY) 등의 다양한 식물바이러스병을 효율적으로 방제하는 신규 세라티아 속(Serratia spp.) Gsm01[KCCM-10738P] 균체, 이 균체의 배양액, 배양액 추출물, 추출물의 제조방법 및 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물바이러스병 방제제에 관한 것이다.

식물바이러스병 방제, 세라티아 속 Gsm01, 오이 모자이크 바이러스(CMV), 담배 모자이크 바이러스(TMV), 및 감자 바이러스 Y(PVY)

Description

식물바이러스병 방제 효과를 갖는 세라티아 속 Ｇｓｍ０１{Control of plant viruses with its extract of endemic strain, Serratia spp. Gsm01}

도 1은 본 발명에 따른 세라치아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균주의 유전학적 특성을 RAPD를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 세라치아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균주의 16S rRNA 유전자를 분석하여 계통분류학적 위치를 나타낸 것이다.

도 3은 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체, 균체 배양액 추출물의 항식물바이러스 방제 효과를 규명하기 위하여 균체 및 균체 배양액 추출물층을 분획하는 과정을 나타낸 것이다.

도 4는 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체 및 균체 배양액 추출물을 담배에 처리하였을 때, 상위엽에서의 바이러스병 발생을 방제하는 전신유도저항성을 나타낸 것이다[Gsm01 : 담배 하위엽에 Gsm01 균체 처리, 균체 배양액 추출물 : 담배 하위엽에 Gsm01 균체 배양액 추출물 처리, MH배지 : 담배 하위엽에 MH배지 처리(대조구)].

도 5는 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체 , 균체 배양액 추출물을 오이에 처리하였을 때, 상위엽에서의 바이러스병 발생을 방제하는 전신유도저항성을 나 타낸 것이다[Gsm01 : 오이 떡잎에 균체 처리, 균체 배양액 추출물 : 오이 떡잎에 Gsm01 균체 배양액 추출물 처리, MH배지 : 오이 떡잎에 MH배지 처리(대조구)].

도 6은 한외여과(ultra filtration)를 이용하여 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체로부터 추출한 항식물바이러스 물질의 분자량을 검정하기 위한 방법을 나타낸 것이다.

도 7은 도 6에서 검정된 분자량 100,000 이상의 항식물바이러스 추출물을 분획한 후, 오이 모자이크 바이러스에 대한 항식물바이러스 효과를 검정한 결과를 나타낸 것이다.

국내 원예작물의 국내 총 재배면적은 76,453 ha로 매년 증가하는 추세인데 (98년도 농림통계 연보, 고령지농업시험장 자료; 감자 - 23,252 ha, 봄 재배 배추 - 22,824 ha, 고령지 재배 무 - 3,426 ha), 감자, 고추, 오이, 토마토 등의 과채류, 무, 배추, 당근 등의 엽채류, 상추, 결구상추, 치커리 등의 양채류, 고사리, 고추냉이, 더덕 등의 산채류 그리고 국화, 카네이션, 호접란 등의 화훼류를 포함하는 대부분의 원예작물에서 바이러스 병이 발생하고 있으며, 이로 인한 경제적 피해가 매우 심각한 수준에 이르고 있다[2000 농업과학기술원 주요연구 성과 "종자전염 바이러스의 발생생태 및 방제에 관한 연구; 2004 원예연구소 주요연구 성과 "원예작물 품질향상을 위한 바이러스 진단 및 안전방제기술 개발].

원예작물에 피해를 주고 있는 바이러스로는 CMV, TMV, PVX, PVS, PVM, PVA, PVY, PLRV, PSTVd, TuMV 등 매우 다양하며, 집단재배 방식이 일반화되고 있는 현실을 감안해 볼 때 이들 바이러스에 의한 피해는 증가할 것으로 예상된다. 이러한 식물바이러스를 방제하기 위해서 무병종자를 이용하여 작물을 재배하는 경종적 방법, 바이러스 저항성 품종 육성 등의 방법이 있으나 그 효과는 미비하다.

한편, 바이러스 외피 단백질 유전자(coat protein gene), 복제관련 유전자 (replicase-associated gene), 위성 RNA 유전자(satelite RNA gene), 바이러스 이동 단백질 유전자(movement gene), 안티센스 유전자(antisense gene), 라이보좀 불활성화 단백질 유전자(ribosome inactivating protein gene) 등의 유전자를 식물체내로 도입하여 바이러스에 저항성을 나타내는 형질전환 식물체를 개발하고 있으나, 산업적으로 성공하기 위해서는 많은 시간이 필요하다[Fitchen, J. H. and Beachy, R. N. 1993. Genetically engineered protection against viruses in transgenic plants. Annu. Rev. Microbiol. 47:739-763].

따라서, 최근에는 미생물을 이용하여 식물바이러스를 방제하고자 하는 생물학적 방제법 개발에 대한 연구가 진행되고 있다. 특히, 생물학적 방제법은 자연 생태계를 보존하고 인축에 독성이 없는 환경친화적 방제법으로 그 수요가 급증하고 있다.

현재 국내 공개 특허 제2005-114294호에 세라티아 마세스센스(Serratia Marcescens) THR-2[KFCC-11331]의 응애에 대한 살충 효과가 공지되어 있으나, 살충 효과와 식물바이러스병 방제 효과는 별개로서, 본 발명과 같이 국내 토착 세라티아 속(Serratia) 균체, 이 균체의 배양액, 그리고 배양액 추출물을 이용하여 식물바이러스병을 방제하고자하는 연구는 전무한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같이 신규한 식물바이러스병 방제 효과가 우수한 새로운 미생물을 선발하고자 연구 노력한 결과, 강원도 홍천 인삼재배지에서 식물바이러스병을 방제하는 새로운 세라티아 속(Serratia spp.) Gsm01[KCCM-10738P]를 분리하였고, 이 균체가 항식물바이러스 활성 물질을 가장 효과적으로 생산할 수 있는 배양조건을 최적화시켰으며, 이 균체로부터 항식물바이러스 물질을 대량으로 추출할 수 있는 기술을 개발하였다.

또한, 국내 토착 세라티아 속(Serratia spp.) Gsm01[KCCM-10738P] 균체 배양액의 추출물을 작물에 처리하였을 때 식물바이러스를 매우 효과적으로 방제할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 식물바이러스병 방제 효과를 갖는 세라티아 속(Serratia spp.) Gsm01[KCCM-10738P] 균체, 이로부터 얻은 배양액 추출물, 이의 제조방법 및 식물바이러스병 방제제로서의 용도를 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명은 식물바이러스병 방제 효과를 갖는 세라티아 속(Serratia spp.) Gsm01[KCCM-10738P] 균체자체를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 균체로부터 얻은 배양액 추출물 및 이의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물바이러스병 방제제를 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 오이 모자이크 바이러스(CMV), 담배 모자이크 바이러스(TMV) 및 감자 바이러스 Y(PVY) 등의 다양한 식물바이러스병을 효율적으로 방제하는 신규 세라치아 속(Serratia spp.) Gsm01[KCCM-10738P] 균체자체, 이 균체의 배양액, 이 배양액 추출물, 이 추출물의 제조방법 및 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물바이러스병 방제제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 신규 세라티아 속(Serratia spp.) Gsm01은 강원도 홍천 인삼재배지에서 식물바이러스를 매우 효과적으로 방제하는 미생물을 선발하여 분리·동정한 결과, 세라티아 속(Serratia spp.)으로 나타났다. 즉, 상기 분리 Gsm01 균체는 세라티아 속을 분류하는데 있어서 주요 특성이 되는 4-아미노부티레이트(aminobutyrate), 아르기닌(arginine), 카프레이트(caprate), D-둘시톨(dulcitol), L-푸코스(fucose) 등의 탄소원 이용도, 젤라틴(gelatin) 및 트리부티린(tributyrin) 액화, 그리고 글루코네이트 시험(gluconate test) 등의 실험에서 세라티아 속(Serratia spp.)으로 동정되었다. 따라서, 상기 신규 균체를 세라티아 속(Serratia spp.) Gsm01로 명명하고, 한국미생물보존센터에 2006년 1월 12일자로 기탁하였으며, 수탁번호는 KCCM-10738P이다. 본 발명의 신규 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체를 식물체에 처리하였을 때, 식물바이러스병을 방제하여 균체가 항식물바이러스 능력이 있음이 확인되었다. 또한, 신규 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체가 항식물바이러스 활성 물질을 가장 효과적으로 생산할 수 있는 배양배지 및 온도조건을 규명하였으며, 본 균체로부터 항식물바이러스 물질을 대량으로 추출할 수 있다.

또한, 국내 토착 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체 배양액의 추출물을 작물에 처리하였을 때 식물바이러스를 매우 효과적으로 방제할 수 있음을 확인하였다. 이는 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체뿐만 아니라 균체 배양액의 추출물을 식물체에 처리하면, 식물바이러스를 방제하는 것임을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 식물바이러스병 방제 효과를 갖는 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 배양 추출물을 포함한다.

상기 추출물의 제조과정을 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P]를 MH(Muller Hinton) 배지에서 25 ~ 30 ℃에서 12 ~ 72 시간 배양하여 균체 배양여액 및 균체 배양여액 추출물을 얻는다. 이때, 상기 배양온도 범위를 벗어날 경우에는 균의 생장이 저조할 뿐만 아니라 이로부터 분획한 추출물의 항바이러스 방제효과가 감소하는 문제점이 있고, 또한 배양시간이 12시간 미만일 경우에도 추출물의 항바이러스 방제효과가 감소하는 문제가 있고, 72 시간을 초과하면 세라티아 속 Gsm01 균체의 자가용출에 의한 항바이러스 물질의 분해 문제가 있어 바람직하지 못하다.

상기에서 얻은 배양여액을 95 ~ 100 ℃에서 10 ~ 30 분간 열처리하고 물로 추출하여 배양액 추출물을 수득한다. 상기 열처리 온도가 95 ℃ 미만의 경우에는 오염원의 제거가 완벽히 이루어지지 않는 문제점이 있고, 100 ℃를 초과하면 항식물바이러스 방제 효과가 감소하는 문제점이 있다. 또한, 10분 미만으로 열처리하면 오염원의 제거가 완벽히 이루어지지 않는 문제가 있고, 30분을 초과하면 항식물바이러스 방제 효과가 감소하는 문제가 있어 바람직하지 못하다. 즉, 본 발명의 항식물바이러스 활성 물질은 열처리과정을 거치면서 식물바이러스에 전신유도저항성(SAR)을 유도하여 식물바이러스병을 방제할 수 있는 것이다.

이렇게 추출된 항식물바이러스 활성 물질은 분자량이 100,000 이상인 것으로, 더욱 바람직하기로는 분자량이 100,000 ~ 3,000,000인 것으로, 다른 분획물에 비해 우수한 식물바이러스 방제 효과를 나타내었다.

또한, 본 발명은 상기 추출 단계별에서 얻어진 각각의 수득물(균체, 배양여액, 추출물)을 유효성분으로 함유하는 식물바이러스병 방제제 등의 생물농약을 포함한다.

이러한 생물농약은 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 외에 농약제제로 사용가능한 담체를 함께 사용하여 제조될 수 있다. 담체로는 통상적으로 사용되는 농약제형으로 허용 가능한 담체면 모두 사용할 수 있으나, 특히 동결보존제 스킴밀크(skim milk), 이스트 익스트렉트(yeast extract, PG와 전착제 SOF70, 계면활성제 TD20A, AS65D 등을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 유효성분은 전체 미생물제제 조성물에 대하여 0.001 ~ 90%를 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기로는 본 발명에 따른 균주 배양액 추출물을 100 ~ 500배 희석하여 분제로 제제화시킨다. 이렇게 제조된 항식물바이러스제제를 오이 모자이크 바이러스(CMV), 담배 모자이크 바이러스(TMV), 감자 바이러스 Y(PVY) 등을 억제하기 위하여, 작물을 정식한 후 10일부터 또는 발병직전 시기에 식물체 지상부에 경엽처리 방법으로 처리하는 것이 바람직하다.

이러한 미생물제제는 식물바이러스병 방제제, 종자코팅제, 미생물영양제, 토양개량제 등의 전반적인 농약제로 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 국내 토착 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체의 분리 및 동정

1) 생리ㆍ생화학 동정

강원도 홍천 인삼 재배지에서 미생물들을 다수 분리한 후, 항식물바이러스 효과를 가장 우수하게 나타내는 본 균체를 선발하여 Bergey's manual[Lelliott, R. A. and Dickey, R. S. 1984. Genus Serratia. In: Bergey's Manual of Systemic Bacteriology. vol. 1, pp. 477-484, Williams and Willkins Co., Baltimore/London]에 준하여 세라티아 속의 생리ㆍ생화학 실험들을 수행하였으며, 그 결과는 다음 표 1과 같다.

즉, 상기 분리 Gsm01 균체는 세라치아 속을 분류하는데 있어서 주요 특성이 되는 4-아미노부티레이트(aminobutyrate), 아르기닌(arginine), 카프레이트(caprate), D-둘시톨(dulcitol), L-푸코스(fucose) 등의 탄소원 이용도, 젤라틴(gelatin) 및 트리부티린(tributyrin) 액화, 그리고 글루코네이트 시험(gluconate test) 등의 실험에서 세라티아 속(Serratia sp.)으로 동정되었다.

Gsm01 균체의 생리ㆍ생화학 동정

특징	Gsm01	세라티아(Serratia)	에르위니아 헤르비콜라 (Erwinia herbicola) 군	에르위니아카로토보라 (Erwinia carotovora) 군	엔테로박터 (Enterobacter) 군	클렙시엘라(Klebsiella)
탄소원 이용 시험(carbon source utilization test):
4-아미노부티레이트 (4-Aminobutyrate)	+^a	+	+	-	V	V
5-아미노발레레이트 (5-Aminovalerate)	V	-	-	-	-	V
아르기닌(Arginine)	-	-	-	-	-	+
캡레이트(Caprate)	+	+	-	-	-	-
캡로에이트(Caproate)	+	+	-	-	-	-
캡릴레이트(Caprylate)	+	+	-	-	-	-
D-둘시톨(Dulcitol)	-	-	-	-	-	-
L-푸코스(Fucose)	+	+	-	-	-	+
펠라고네이트 (Pelargonate)	+	V	-	-	-	-
타카토스(Tagatose)	-	-	-	-	-	V
타이로신(Tyrosine)	+	+	-	-	-	V
보게스-프로스카워 시험(Voges-Proskauer test)	+	+	+	+	+	+
젤라틴 하이드롤라이즈드(Gelatin hydrolyzed)	+	+	V	V	V	V
트리부티린 하이드롤라이즈드(Tributyrin hydrolyzed)	+	+	-	-	-	-
데옥시리보뉴클레아제 (Deoxyribonuclease)	+	+	-	V	-	-
글루코네이트 시험(Gluconate test)	+	+	-	-	+	+
요오드아세테이트 시험(Iodoacetate test)	+	+	+	-	+	+
^a +, 80% or more strains positive; -, 80% or more strains negative; V, variable

2) RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA) 분석에 의한 특성

상기 Gsm01 균체의 유전학적 특성을 알아보기 위해, RAPD를 실시하였다. 랜덤 프라이머(Random primer)로는 OPERON 10mer kit를 이용하였으며, 분리균체 DNA는 50 ng의 게놈 DNA를 사용하였고, PCR 반응은 10 mM tris-HCL(pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂ _,0.01% 젤라틴, 200 μM dNTP, 200 ng 프라이머 및 2.5U의 Taq 중합효소를 첨가하여 전체 반응액은 25 ㎕가 되게 하여 94 ℃ 1 분, 38 ℃ 1 분, 72 ℃ 2 분으로 45cycle 반응시켰다. 증폭된 PCR 산물은 5% 폴리아크릴아마이드 겔로 전기영동한 후, 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)용액에 염색하여 관찰하였다.

랜덤 프라이머 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 나타낸 B-05, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 15 및 16의 총 9개의 프라이머로부터 다형화 밴드양상을 얻을 수 있었으며, 이를 바탕으로 NTSYS 프로그램[Rolf, F. J. 1992. NTSYS. Numerical taxonomy and multivariate analysis system. version 1.70. Exeter, Setauket, New York]을 이용하여 계통도를 작성하였다[도 1].

그 결과, 상기 Gsm01 균체는 세라티아 마르센세스(Serratia marcescens)로 판명되었다.

3) 16S rRNA 유전자 분석에 의한 특성

상기 Gsm01 균체의 계통분류학적 위치를 알아보기 위해, 생명현상에 있어 필수적이고 그 염기서열이 비교적 잘 보존되어 있으며, 통계학적으로 분석하기에 용이한 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 먼저, 서열번호 10으로 나타낸 fD1 프라이머와 서열번호 11로 나타낸 rP2 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 얻었다. 그 후 pGEM-T 벡터 시스템을 이용하여 클로닝하여 그 염기서열을 분석하였다.

상기 분석된 염기서열은 메가 프로그램[Kumar, S., Tamura, K. and Nei, M. 1993. MEGA: molecular evolutionary genetics analysis, version 1.0. The Pennsylvania State University, University Park.]에 의해 그 계통도를 작성한 결과가 도 2와 같으며, 표 2와 같이 그 유사도로 볼 때 본 Gsm01 균체는 세라티아 마르센세스(Serratia marcescens)로 동정되었다.

Gsm01 균체와 Serratia 속 균주간 16S rRNA 유전자의 유사도

균주	Gsm01 균체의 16S rRNA 유전자 유사도 (%)
*S. marcescens*	97.8-99.1
S. fonticola	94.1-94.3
S. rubidaea	96.0-96.8
S. ficaria	94.0-97.2
S. proteanaculans	95.2
S. plymuthica	93.3
S. entomophica	96.6
S. odorifera	96.7
S. liquefaciens	95.2

4) 16S-23S ITS(Intergenic Transcribed Spacer) 지역 분석에 의한 특성

상기 Gsm01 균체의 ITS지역을 분석하기 위해, 서열번호 12로 나타낸 R16-1F와 서열번호 13으로 나타낸 R23-1R 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였다. 그 결과, 엔테로박테리아시애(Enterobacteriaceae) 과에 속하는 미생물들로부터 16S-23S ITS 지역은 tRNA-Glu을 포함하는 small fragment (약 600bp)와 tRNA-Ala 및 tRNA-Ile을 포함하는 large fragment (약 800bp) 즉, 두개의 단편이 증폭된다는 기존의 보고와 같이 동일하게 PCR로 증폭된 두개의 단편을 얻을 수 있었다. 이 후 pGEM-T 벡터시스템을 이용하여 클로닝한 후, 그 염기서열을 분석하였다. 그러나 세라티아 속은 아직 GenBank data에 등록된 16S-23S ITS 지역의 참고자료가 없었기에 염기서열을BLAST search를 통하여 분석한 결과 tRNA-Glu를 포함하는 small 단편은 Pectobacterium, Yersinia, Salmonella, Shigella, Escherichia coli , Erwinia 속 등과 아주 높은 유연관계를 나타냈고, tRNA-Ala 및 tRNA-Ile를 포함하는 large 단편은 Yersinia, Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Pectobacterium, Erwinia 속 등과 높은 유연관계를 나타내어 본 Gsm01 균체는 세라티아 속이 포함된 엔테로박테리아시애(Enterobacteriaceae)　과 미생물들과 매우 유사한 것으로 판명되었다.

5) DNA-DNA 하이브리다이제이션에 의한 특성 분석

상기 Gsm01 균체의 전체 게놈 유사도를 조사하였다. 그 방법으로는 순수하게 분리된 전체 DNA를 1 ng/㎕로 정량하여 10 N NaOH를 첨가한 후, 80 ℃에서 10분간 끓여 DNA를 변성시켰다. 그 후 DIG-하이 프라임 시스템[Roche Molecular Biochemicals, Sandhofer Strasse 116, Germany]을 이용하여 탐침으로 사용할 DNA를 라벨링하여 나일론 막에 부착된 DNA와 함께 49 ℃에서 3시간 동안 프리하이브리다이제이션을 시켰으며, 그 후 같은 온도에서 16시간동안 하이브리다이제이션 반응을 유도하였다. 반응이 끝난 막은 DIG 냉광 검출 킷[Roche Molecular Biochemicals, Sandhofer Strasse 116, Germany]를 이용하여 그 반응을 검정하였다.

그 결과, 상기 Gsm01 균체의 전체 게놈은 세라티아 마르센세스와 89-92%로, 일반적으로 동일종으로 분류되는 70% 이상의 유사도를 나타내어 상기 균체는 세라티아 마르센세스로 최종 판정되었다. 그 결과를 유사도로 표현하면 다음 표 3과 같다.

Gsm01 균체와 Serratia속 균의 전체 게놈 유사도

Source of unlabelled DNA	DNA hybridization (%)
Source of unlabelled DNA	Gsm01 균체
Gsm01	100.0
*S. marcescens* KACC10002	92.0
*S. marcescens* KACC 10502	89.0
S. ficaria KCTC2921	61.0
S. rubidaea KCTC 2927	48.0
S. entomophila KCTC 2934	55.0
S. odorifera KCTC 2937	44.0
S. plymuthica KCTC 2924	46.0
S. proteanaculans KCTC 2936	48.0
S. liquefaciens KCCM 40893	51.0

실시예 2 : 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체의 항식물바이러스 특성 분석

1) 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체의 항식물바이러스 효과 검정

먼저 상기 Gsm01 균체의 항식물바이러스 효과를 검정하기 위하여, TSA 고체배지(Tryptic soy agar, Difco)를 이용하여 28 ℃ 항온 배양한 후, 충분히 성장한 균체를 멸균수 1ml에 현탁하였다. 이후 균체 현탁액을 반엽법으로 오이 모자이크 바이러스(CMV)에 대한 항식물바이러스 효과를 검정하였다.

그 결과, Gsm01 균체는 91.2%의 높은 방제효과를 나타낸 반면, 멸균수만을 처리한 대조구에서는 오이 모자이크 바이러스에 대한 항식물바이러스 효과가 없는 것으로 나타나 CMV에 대한 항식물바이러스 효과가 본 세라티아 속(Serratia sp.) Gsm01[KCCM-10738P] 균체에 의한 효과로 증명되었다[표 4].

Gsm01 균체의 항식물바이러스 효과

배지	오이 모자이크 바이러스(CMV) 방제효과 (%)
Gsm01 균체	91.2
멸균수	0

2) 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체 배양 배지 선발

상기 균체의 최적 배양 배지를 선발하기 위하여, 4종류의 배지를 이용하여 항식물바이러스 효과를 조사하였다. 배지로는 MH(Muller Hinton Broth : Beef extract 3g, Casein Hydrolysate 17.5g, Starch1.5 g/L), NB(Nutrient Broth : Beef extract 3g, Bacto pepton 5g/L), LB(Luria Burtani broth :　Bacto tryptone 10g, Yeast extract 5g, Sodium chloride 5g/L), MGY(Manitol Glutamate Yeast Broth : Manitol 10g, L-Glutamic 2g, Potassium phosphate 0.5g, Magnesium sulfate heptahydrate 0.2g, Sodium chloride 0.2g, Yeast extract 0.25g/L) 배지에서 동일조건하에 진탕 배양하였다. 이후, 12000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 회수하여 반엽법으로 오이 모자이크 바이러스(CMV)에 대한 항식물바이러스 효과를 검정하였다.

그 결과, 상기 균체는 MH배지와 LB배지를 이용하여 배양하였을 경우, 각각 87.1%와 85.4%의 높은 방제효과를 나타내었으며 산업화에 적합한 MH배지를 대량생산용 배지로 선발하였다. 반면 MH배지 자체만을 식물체에 처리하였을 경우, 오이 모자이크 바이러스 방제효과가 없는 것으로 나타나 CMV에 대한 항식물바이러스 효과가 배지성분이 아닌 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균주 자체에 의한 효과로 증명되었으며, 또한 본 균체가 생산한 물질 때문임이 증명되었다. 한편, NB배지와 MGY배지에서 배양한 경우는 항식물바이러스 효과가 없는 것으로 나타났다[표 5].

Gsm01 균체의 배양 배지 선발

배지	오이 모자이크 바이러스(CMV) 방제효과 (%)
MH 배양여액	87.1
NB 배양여액	14.4
LB 배양여액	85.4
MGY 배양여액	15.0
MH 배지	9.8

3) 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체 배양 온도 선발

상기 균체의 최적 배양 온도를 선발하기 위해, 다음 표 3에서 선발된 MH배지를 이용하여 각각 15 ℃, 28 ℃, 37 ℃에서 24시간 배양하여 CFU(colony forming unit/ml)를 조사하였다.

그 결과, 상기 균체의 최적 배양 온도는 28 ℃에서 가장 많은 콜로니수를 나타내어 28 ℃가 최적 배양 온도로 선발되었다[표 6].

Gsm01 균체의 배양 온도 선발

배양시간 (h)	배양온도 (℃)
배양시간 (h)	15	28	37
24	3.8 ×10⁶cells/ml	3.4 ×10 ⁷ cells/ml	1.2 ×10⁷cells/ml

4) 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체 배양 시간 선발

상기 균체의 최적 배양 시간을 선발하기 위해, 선발된 MH배지를 이용하여 1, 3, 5, 7, 9, 12, 24, 48 및 72시간 배양하여 12000 rpm으로 10분간 원심분리한 후, 상층액을 회수하여 오이 모자이크 바이러스(CMV)에 대한 항식물바이러스 효과를 검정하였다.

그 결과, 상기 균체의 경우 7시간 배양에 이미 85.0%의 오이 모자이크 바이러스 방제효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 균체는 7시간 이상 배양할 경우, 항식물바이러스 물질을 효과적으로 추출할 수 있음이 증명되었다[표 7].

Gsm01 균체의 배양 시간 선발

배양 시간 (h)	오이 모자이크 바이러스(CMV) 방제효과 (%)
1	10.4
3	15.2
5	56.0
7	85.0
9	86.7
12	92.5
24	95.5
48	94.7
72	94.1

5) 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체 배양액 추출물의 항식물바이러스 효과 검정

상기 표 4, 5에서 증명된 바와 같이, 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체만으로도 항식물바이러스 효과가 매우 우수하며, 이 균체로부터 항식물바이러스 물질은 배양액으로 분비되고, 배지자체에 의한 항식물바이러스 효과는 없음이 증명되었다. 따라서, 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체가 생산하는 항식물바이러스 물질의 특성을 보다 정확하게 규명하고자 다음과 같은 분획실험을 수행하였다.

즉, 상기 균체의 배양여액과 균체를 실험목적에 따라 열처리 또는 초음파 처리한 후의 항식물바이러스 활성의 변화를 검정하였다. 도 3과 같이 12,000 rpm 원심분리를 통하여 분리된 배양여액을 95 ℃에서 10분간 열처리(boiling)하고 물로 추출하였으며, 균체는 10초간 10회 초음파처리(sonicated) 및 95 ℃ 10분간 열처리하여 오이모자이크 바이러스(CMV)에 대한 방제효과를 조사하였다.

그 결과, 배양여액을 열처리하여 물로 추출한 배양액 추출물 층에서 가장 높은 식물바이러스 방제효과를 나타내었으며, 균체, 균체 초음파 처리층 그리고 균체 열처리층에서도 높은 식물바이러스 방제효과가 확인되었다[표 8]. 특히, 본 발명의 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체의 경우 주요 항식물바이러스 물질을 세포외로 분비하며 열에 안정하다는 것이 증명되었다. 반면 대조구인 PBS 버퍼에서는 항식물바이러스 효과가 없었다. 따라서, 본 실험을 통하여 국내 토착 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체를 대량 배양한 후, 열처리하여 항식물바이러스 물질을 포함하는 추출물을 대량 생산할 수 있고 나아가서는 산업화도 쉽게 이루어질 수 있음이 증명되었다.

Gsm01 균체 배양액 추출물의 CMV 방제효과

처리구	CMV 감염억제효과(%)
Gsm01균체 배양액 추출물 열처리층	82.9
균체	67.4
균체 초음파처리층	59.2
균체 열처리층	65.8
PBS 버퍼	15.1

6) 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체 배양액 추출물의 항식물바이러스 지속기간

세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체 배양액 추출물의 식물바이러스 방제효과 지속기간을 조사하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다. 즉, 균체 배양액 추출물을 식물체에 처리한 후 시간을 달리하여 각 바이러스를 접종하여 방제효과를 관찰하였다. 담배 모자이크 바이러스(TMV) 방제효과는 담배(N. glutinosa)를 이용하였으며, 오이 모자이크 바이러스(CMV)는 명아주(C. amaranticolar)를 사용하였다.

그 결과, 담배 모자이크 바이러스의 경우 처리 15일 후까지, 오이 모자이크 바이러스 경우는 처리 13일 후까지 매우 안정한 항식물바이러스 효과를 나타내었다[표 9].

Gsm01 균체 배양액 추출물의 항식물바이러스 지속기간

Gsm01 균체 배양액 추출물 처리 후 바이러스 접종 일수	담배 모자이크 바이러스(TMV) 방제효과 (%)	오이 모자이크 바이러스(CMV) 방제효과 (%)
1	100.0	98.3
3	99.9	97.4
5	99.9	95.7
7	99.6	93.9
9	99.6	92.3
11	99.4	89.6
13	99.3	82.3
15	99.5	75.6

7) 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체 배양액 추출물 처리에 의한 식물의 항식물바이러스 전신유도저항성(SAR : systemic acquired resistance)

상기 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체, 이 균체 배양액 추출물층 처리에 의한 식물의 항식물바이러스 전신유도저항성(SAR)을 검정하였다. 바이러스는 오이 모자이크 바이러스(CMV)를 선택하였으며, 기주식물로는 오이 모자이크 바이러스의 전신기주인 담배(N. tabacum cv. Xanthi-nc)와 오이(Cucumis sativus L.)를 이용하였다. 처리방법은 하위엽 하나를 선택하여 본 균체 및 이 균체 배양액 추출물층을 처리한 후, 다른 하위엽에 오이 모자이크 바이러스를 접종하여 상위엽에 바이러스 병징이 나타나는지를 6회 반복으로 관찰하였다. 대조구로는 MH배지를 사용하였으며, 균체 및 이 균체 배양액 추출물층 처리와 동일한 방법으로 처리하였다.

그 결과, 균체, 이 균체 배양액 추출물층을 처리한 모든 담배에서는 접종 하위엽 뿐만 아니라 상위엽에서의 바이러스 병징이 나타나지 않아, 전신유도저항성 효과를 분명히 관찰할 수 있었다[도 4]. 반면, MH배지만을 처리한 담배에서는 접종엽 및 상위엽에서 모두 매우 심한 오이 모자이크 바이러스병이 발생하여 전신유도저항성이 관찰되지 않았다[도 4]. 또한 오이에서도 동일하게 전신유도저항성이 잘 이루어지고 있음을 확인하였다[도 5].

실시예 3 : 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체 추출물로부터 항식물바이러스 특성 분석

1) 한외여과(ultra filtration)를 이용한 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체 배양액 추출물 유래 항식물바이러스 물질 분자량 검정

배양액 추출물층으로부터 항식물바이러스 물질의 분자량을 알아보기 위하여 한외여과법으로 추출물층을 분획하여 오이 모자이크 바이러스(CMV)에 대한 방제효과를 조사하였으며[도 6], 그 결과는 다음 표 10과 같다. 즉, 분자량 100,000이상에서 분획한 추출물이 48.9%로 가장 높은 바이러스 방제효과를 나타내었으며, 분자량이 10,000보다 작거나 10,000 ~ 100,000사이에서는 각각 12.2%, 3.7%의 낮은 바이러스 방제효과를 나타내었다. 따라서, 본 배양액 추출물층의 항식물바이러스 물질은 분자량 100,000 이상의 고분자 화합물임을 알 수 있었다.

한외여과법을 이용한 Gsm01 균체 배양액 추출물층의 항식물바이러스 물질 분자량 검정

시료	오이 모자이크 바이러스 (CMV) 방제효과 (%)
무처리	0
M.W. ^a) > 100,000	48.9
10,000 < M.W. < 100,000	3.7
M.W. < 10,000	12.2
a) 분자량

2) 겔 여과 크로마토그래피를 이용한 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체 배양액 추출물(분자량 〉100,000)의 항식물바이러스 방제 효과

한외여과법으로 분리한 분자량 100,000 이상의사이의 물질을 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 분획하였으며, 그 분석 조건은 다음 표 11과 같다. 즉, 5 mL씩 분취된 125개의 분획은 다시 5개씩 그룹화(총 25개 시료)하여 동결 건조하였다. 이 후 각각의 시료는 증류수 10 mL로 재용해한 후 오이모자이크 바이러스(CMV)에 대한 방제효과를 조사하였다.

겔 여과 크로마토그래피 분석 조건

기구	Low pressure liquid chromatograph (Bio-rad, U.S.A)
온도	4 ℃
이동상	d-water
고형상	Sephadex G50 (M.w. range : 500 - 30,000) (Amersham biosciences, U.S.A)
컬럼	15 mm ㅧ 500 mm (Bio-rad, U.S.A)
유속	1 mL min^-1
샘플 로딩 부피	5 mL
분획	15 mL/tube, total 150 tubes

그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이 2, 4, 13, 14번 분획에 존재하는 물질이 가장 높은 항식물바이러스 효과를 지니고 있음이 확인되어 본 Gsm01 균주 배양액 추출물층의 항식물바이러스 물질은 여러 개의 물질들로 구성된 복합물로 판명되었다.

실시예 4 : 식물바이러스병 방제제 제조

한외여과법으로 분리한 분자량 100,000 이상의 물질을 250배로 희석하고, 여기에 동결방지제 스킴밀크, 이스트 익스트렉트, PG와 전착제 SOF70, 계면활성제 TD20A를 함유시켜 방제제를 제조하였다. 담배 모자이크 바이러스(TMV) 및 오이 모자이크 바이러스(CMV)를 억제하기 위하여 작물을 정식한 후 10일부터 또는 발병직전 시기에 식물체 지상부에 경엽처리 방법으로 처리하여 방제 효과를 확인한 결과, 식물바이러스병 방제율이 90% 이상 나타났다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서는 국내 토착 신규 세라티아 속 Gsm01[KCCM-10738P] 균체를 분리 동정하였고, 본 균체자체와 이의 배양액 추출물 두 경우 모두 오이 모자이크 바이러스(CMV), 담배 모자이크 바이러스(TMV), 및 감자 바이러스 Y(PVY) 등의 다양한 식물바이러스병을 매우 효율적으로 방제할 수 있음이 증명되었다. 특히, 본 발명의 균체 및 이 균체 배양액의 추출물은 열에 매우 안정하며 항식물바이러스 활성 물질은 분자량 100,000 이상의 고분자량 화합물로 식물에 전신유도저항성(SAR)을 유도하여 식물바이러스병을 방제함을 알 수 있다.

따라서, 식물바이러스 방제를 위하여 본 국내 토착 세라티아 속 Gsm01[KCCM- 10738P] 균체와 균체 배양액 추출물은 미생물농약, 생화학농약, 친환경농자재 등의 다양한 형태로 산업화가 가능하게 되었다. 특히, 본 발명에 의해 개발된 식물바이러스제는 인체와 환경에 독성이 없는 환경친화적 특징을 지니고 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

식물바이러스병 방제효과를 갖는 세라티아 속(Serratia spp.) Gsm01[KCCM-10738P].
세라티아 속(Serratia spp.) Gsm01[KCCM-10738P] 균체 또는 상기 균체 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물바이러스병 방제제.
1) 세라티아 속(Serratia spp.) Gsm01[KCCM-10738P]를 밀러 힌톤(Muller Hinton) 배지에서 25 ~ 30 ℃에서 12 ~ 72 시간 배양하여 균체와 배양여액을 얻는 단계;

2) 상기 배양여액을 95 ~ 100 ℃에서 10 ~ 30 분간 열처리하고, 물로 추출하는 단계; 및

3) 상기 추출물을 한외여과법으로 여과하여 분자량 100,000 이상인 물질을 분리하고, 분리된 물질을 겔 여과 크로마토그래피로 분획하여 항바이러스 물질을 포함하는 배양액 추출물을 얻는 단계

을 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 세라티아 속(Serratia spp.) Gsm01[KCCM-10738P] 배양액 추출물의 제조방법.
삭제
삭제
식물바이러스병 방제효과를 갖는 세라티아 속(Serratia spp.) Gsm01[KCCM-10738P] 균체 배양액.