CN109097429A - 一种木质碳源驯化污水混合菌种合成聚3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯共聚物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种木质碳源驯化污水混合菌种合成聚3‑羟基丁酸酯/3‑羟基戊酸酯共聚物(PHBV)的方法,所述方法包含以下步骤:(1)将木质生物资源以水热预处理法水解酶解。(2)以水解酶解产物为碳源,通过好氧动态供料法对含活性污泥的污水进行驯化,富集可合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)的细菌。(3)通过不均衡营养环境的控制积累PHA,提高PHA的产量。最终确定积累的PHA为PHBV。通过比较各实验组细胞干重和PHBV产量的数据可以获取最优培养条件。驯化后的活性污泥经过9个积累周期,生产的PHBV为303.7‑1084.4mg/,其中PHB%为40.45‑69.14%,PHV%为30.86‑59.55%。最终,确定在pH值7,总糖浓度为1700mg/,无机盐成分与氧气充足的条件下PHBV的产量达到最大值。
Description
技术领域
本发明属于生物质资源高效高值利用、可生物降解塑料和固体废弃物处理领域,涉及一种利用木质碳源驯化污水混合菌种合成PHBV的方法,具体涉及一种木质碳源驯化污水混合菌种合成聚3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯共聚物(PHBV)的方法。
背景技术
近年来,随着石油工业的发展,化学合成塑料越来越多的应用到人们的生活中,产生了很多不可降解的塑料废弃物,形成白色污染,导致很多严重的问题。因此人们致力于寻找一种可以替代石油基塑料的产品。PHBV是一种环境友好型高分子生物塑料,与传统的以石油为原料合成的塑料如聚乙烯、聚丙烯等有相似的材料学性质,能完美代替传统的石油化工产品。PHBV的化学结构单元主要有3-羟基丁酸酯(3HB)和3-羟基戊酸酯(3HV),其中3HV的含量决定了其结晶性能,晶体结构与晶体行为与共聚物的力学性能、热性能等有关。共聚物中PHV的摩尔含量为0-37%时,PHBV以PHB晶胞结构结晶;当共聚物中PHV的摩尔含量为53-95%时,则以PHV晶胞结构结晶;当PHV的摩尔含量为40mol%左右时,两种晶胞结构同时存在;PHV含量从0-95%变化时,PHBV的结晶度均高于50%。所以调节共聚物中PHV含量,可以得到性能不同的PHBV,使其能适用于更多的领域。PHBV还具有生物相容性好、降解速率快、具有光学活性、压电性、对人体无毒无害等优点。但目前PHBV的合成工艺主要是纯菌种法,纯菌种的生产原料主要是葡萄糖、丙酸等昂贵的有机碳源,生产工艺要求灭菌消毒,保证发酵过程中没有杂菌存在,这使得PHBV的生产成本很高,大大的阻碍了PHBV的工业化生产。
木质生物质资源来源广泛,包括农业秸秆类废物(如玉米杆,小麦杆等)、林木(软木和硬木)及林产加工废物、草类等,用途广,易收集,是地球上最丰富的可再生资源。木质生物质原料的主要成分为纤维素(35%-50%)、半纤维素(20%-35%)和木质素(10%-15%),每年植物通过光合作用合成的生物质干重有1440-1800亿吨,是宝贵的生物质潜在能源。但是,我国木质生物质废弃物的回收率很低,大多数通过露天燃烧或填埋处置,这对生物质资源是一种极大的浪费。因此,合理利用木质生物质废弃物,使其具有资源化的多重效益具有很重要的意义。研究发现,木质生物质资源中的纤维素和半纤维素能水解成葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等小分子糖类,这些糖类均可以作为微生物合成PHA的底物。
利用混合菌群合成PHA也是降低PHA生产成本的一种方法。活性污泥在驯化过程中微生物的选择基于生态原理,因此菌群结构较稳定,这就为PHA的工业化生产创造了前提;混合菌种可以适应多种不同底物,从而扩大了底物的选择范围,为混合底物应用于生产打下良好基础;活性污泥合成PHA比纯菌种单底物的方法条件更温和,不需要严格的消毒纯菌环境,节省运行费用,更易于实现和操控;有利于简化PHA的工艺条件,使剩余污泥的利用成为可能。
因此,本发明利用回收的木质生物质水解产生混合的小分子糖类水解物,以混合的小分子糖类水解物为碳源喂养活性污泥混合菌群生产PHBV。本发明利用回收的木质生物质资源和活性污泥混合菌群制备PHBV,大大降低了PHBV的生产成本,具有良好的工业应用前景。同时,改变投加到反应器中的底物浓度能改变PHBV中PHB和PHV的比例,使合成的PHBV具有不同的性能,能适用于不同的领域,扩大PHBV的应用范围。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种一种木质碳源驯化污水混合菌种合成聚3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯共聚物的方法。
本发明为解决技术背景中的问题,采用的技方案是:一种木质碳源驯化污水混合菌种合成聚3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯共聚物的方法,包括如下步骤:
1)水热预处理水解酶解木粉:
将40-80目木粉和超纯水以1:4比例加入高温高压反应釜,反应温度为180-210℃,反应时间为30-60分,得到木粉水解液,冷却;
将冷却后的木粉水解液加超纯水至1L,并调节pH至4.8,加3ml酶解液,放在磁力搅拌器中搅拌,酶解温度为30-60℃,酶解时间为24h-96h,搅拌完成后放入90℃的水浴中加热20分钟,拿出冷却后抽滤,所得滤液测总糖后放入4℃冰箱储存;
2)对污水中能合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)的混合菌群进行驯化富集:
将污水投加在烧杯中进行驯化培养,驯化周期的运行方式为:进水→曝气+搅拌→沉淀→出水,运行周期为12h;
进水为木粉水解液,水的碳源浓度为500mg/L,加入的氮源浓度为40mg/L,磷源浓度为8mg/L,配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液;
在每个周期曝气段结束后排出100ml活性污泥混合液。运行周期中沉淀段为1h,沉淀结束后排出250ml上清液;
3)积累PHA:
在烧杯中投加驯化后污水,污水的初始混合液悬浮颗粒浓度(MLSS)为1500mg/L,培养积累PHA周期的运行方式为进水→曝气+搅拌→沉淀→出水,运行周期为12h;
进水为木粉水解液,水的碳源浓度为800-1700mg/L,加入的氮源浓度为20-40mg/L,磷源浓度为4-8mg/L,配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液;
运行周期中沉淀段为1h,沉淀结束后排出250ml上清液。
本发明所述步骤1)中木粉来源包括工农业的木质废弃物粉碎过筛获得、加工剩余、废木屑、秸秆、蔗渣。
本发明所述步骤1)中木粉水解液的成分包括:葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸。
本发明所述步骤2)污水中的菌群包括动胶菌属、芽孢杆菌属、色杆菌属、诺卡氏菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、酵母菌属、放线菌属、黄色杆菌属。
本发明所述步骤2)中微量元素液组分及含量为40mg/LCaCl2,3mg/LFeCl3·3H2O,0.24mg/LZnSO4·7H2O,0.3mg/LCoCl2·6H2O,0.3mg/LMnCl2·4H2O,0.3mg/LH3BO3,0.06mg/LCuSO4·5H2O,0.06mg/LKI。
本发明所述步骤2)中氮源包含但不限于NH4Cl,磷源包含但不限于KH2PO4。
本发明所述步骤3)中积累PHA是在生长限制的条件下完成的,其中生长限制通过限制至少一种营养物来实现,所述至少一种营养物选自P、N、O、K、Mg、Fe或其组合。
本发明限制营养优选为N和P,其中C:N:P=100:(2-10):(0.4-1.6)。
本发明所述步骤1)中木粉水解液的pH值为7左右,通入的氧气含量充足。
积累PHA的过程中合成的聚羟基脂肪酸酯为PHBV。
本发明还包括连续监测所述微生物中生成的PHBV含量的步骤。
本发明调节加入反应器中的碳源浓度,可以调节PHBV中PHB和PHV的比例,其中PHB/PHV为0.9-2.4,生产出具有不同性能的PHBV,扩大PHBV的应用范围。
PHA组成与含量测量的具体操作步骤如下:
取8mL菌液于10mL离心管中,10000rpm离心10min,转移上清液后加入蒸馏水洗涤菌体,震荡重悬后再离心,反复两次后,放入冷冻干燥机中于-50℃条件下冷冻干燥24h,冻干后将剩余的菌体称重并记录。
PHA酯化反应液:准确称取1.0g苯甲酸(分析纯),溶解至100mL的甲醇(色谱纯)中,再加入10mL的浓硫酸(优级纯),超声5min至完全溶解,作为PHA检测的酯化反应液。
操作过程:称取一定量冷冻干燥后的菌体于酯化管中,加入2mL氯仿、1mL酯化反应液,于100℃反应4小时,冷却至室温后加入1mL高纯水,剧烈震荡,4℃静置。当下层有机相澄清时,即可用1mL注射针管吸取下层有机相1.0-1.5mL,转移至样品瓶内,进行高效气相色谱分析。
色谱条件:
进样口:分流/不分流进样口,温度200℃,载气N2,压力10.33psi,流量40mL/min,分流比25:1。
柱箱:程序升温,初始温度70℃,保持2min,之后以7℃/min的速度升到140℃,保持1min,再次以10℃/min的速度升高到220℃,保持1min。
检测器:FID检测器,温度250℃,H2流量40mL/min,空气流量450mL/min。积累PHA的过程中合成的聚羟基脂肪酸酯为PHBV;PHBV含量根据标品与内标在色谱图的峰面积之比计算得出。通过对不同实验组菌体生长和PHA产量的测定结果的比较分析,可以确定混合菌群的最优培养条件。
有益效果
本发明提供一种使用木质生物质水解物为碳源以混合菌群合成PHBV的方法。本发明以木质水解物为混合菌群的碳源,与以往的以淀粉、葡萄糖等为碳源合成PHA的研究相比,能够在不与人争粮的情况下降低生产PHBV的成本;以污水中的混合菌群为PHA合成菌,与纯菌种培养合成PHA相比,不需要严格的灭菌设备和无菌环境,大大降低了生产成本;污水中有多种PHAs合成菌,与单一的菌种或单一的底物合成PHA的研究比较,不同的菌能利用不同的底物,能让水解产物的的更多的物质转化为PHBV,在提高了PHBV产量的同时,降低了PHBV的生产成本。实验结果表明,木质水解酶解的最佳工艺条件为水解反应温度为200℃,反应时间为30分,酶解温度为60℃,酶解时间为48h,此时的水解产物总糖含量达到最大为13.61g/L;混合菌群积累PHA的过程中,在营养平衡的条件下,通过提高碳源浓度,可以提高PHBV的合成量,PHBV的最高合成量为为瞬时投加碳源1700mg/L 2h后,最高合成量达1084.4mg/L;在氮源或磷源缺乏的情况下,不利于PHBV的合成。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明:
以碳源浓度、氮源浓度和磷源浓度为影响因素设计不同的实验组,测试混合菌群在不同条件下的PHBV积累量。其中碳源浓度的变量为500、800、1100、1400、1700mg/L,氮源浓度的变量为20、40mg/L,磷源浓度的变量为4、8mg/L。本发明污水取自城市污水厂二沉池的含活性污泥的污水。
实施例1
在烧杯中投加驯化后污水,污水的初始混合液悬浮颗粒浓度(MLSS)为1500mg/L,积累周期的运行方式为进水→曝气+搅拌→沉淀→出水,运行周期为12h。进水为木粉水解液,水的碳源浓度为500mg/L,氮源浓度为40mg/L,磷源浓度为8mg/L,配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液。在每个周期曝气段结束后排出100ml活性污泥混合液。运行周期中沉淀段为1h,沉淀结束后排出250ml上清液。在第9个培养周期对活性污泥进行取样测量。将混合液离心后,取沉淀在-50℃冷冻干燥,再进行酯化,以气相色谱法测量PHBV的合成量。
实施例2
在烧杯中投加驯化后污水,污水的初始混合液悬浮颗粒浓度(MLSS)为1500mg/L,积累周期的运行方式为进水→曝气+搅拌→沉淀→出水,运行周期为12h。进水为木粉水解液,水的碳源浓度为800mg/L,氮源浓度为40mg/L,磷源浓度为8mg/L,配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液。在每个周期曝气段结束后排出100ml活性污泥混合液。运行周期中沉淀段为1h,沉淀结束后排出250ml上清液。在第9个培养周期对活性污泥进行取样测量。将混合液离心后,取沉淀在-50℃冷冻干燥,再进行酯化,以气相色谱法测量PHBV的合成量。
实施例3
在烧杯中投加驯化后污水,污水的初始混合液悬浮颗粒浓度(MLSS)为1500mg/L,积累周期的运行方式为进水→曝气+搅拌→沉淀→出水,运行周期为12h。进水为木粉水解液,水的碳源浓度为1100mg/L,氮源浓度为40mg/L,磷源浓度为8mg/L,配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液。在每个周期曝气段结束后排出100ml活性污泥混合液。运行周期中沉淀段为1h,沉淀结束后排出250ml上清液。在第9个培养周期对活性污泥进行取样测量。将混合液离心后,取沉淀在-50℃冷冻干燥,再进行酯化,以气相色谱法测量PHBV的合成量。
实施例4
在烧杯中投加驯化后污水,污水的初始混合液悬浮颗粒浓度(MLSS)为1500mg/L,积累周期的运行方式为进水→曝气+搅拌→沉淀→出水,运行周期为12h。进水为木粉水解液,水的碳源浓度为1400mg/L,氮源浓度为40mg/L,磷源浓度为8mg/L,配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液。在每个周期曝气段结束后排出100ml活性污泥混合液。运行周期中沉淀段为1h,沉淀结束后排出250ml上清液。在第9个培养周期对活性污泥进行取样测量。将混合液离心后,取沉淀在-50℃冷冻干燥,再进行酯化,以气相色谱法测量PHBV的合成量。表1为实施例1至7的PHBV含量测试结果。
表1实施例1-7的PHA含量测试结果
PHBV含量(mg/L) | PHB% | PHV% | |
实施例1 | 303.7 | 40.45% | 59.55% |
实施例2 | 388.5 | 49.41% | 50.59% |
实施例3 | 716.6 | 65.30% | 34.70% |
实施例4 | 718.4 | 69.14% | 30.86% |
实施例5 | 1084.4 | 57.08% | 42.92% |
实施例6 | 619.3 | 59.25% | 40.75% |
实施例7 | 492.5 | 47.49% | 52.51% |
实施例5
在烧杯中投加驯化后污水,污水的初始混合液悬浮颗粒浓度(MLSS)为1500mg/L,积累周期的运行方式为进水→曝气+搅拌→沉淀→出水,运行周期为12h。进水为木粉水解液,水的碳源浓度为1700mg/L,氮源浓度为40mg/L,磷源浓度为8mg/L,配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液。在每个周期曝气段结束后排出100ml活性污泥混合液。运行周期中沉淀段为1h,沉淀结束后排出250ml上清液。在第9个培养周期对活性污泥进行取样测量。将混合液离心后,取沉淀在-50℃冷冻干燥,再进行酯化,以气相色谱法测量PHBV的合成量。
实施例6
在烧杯中投加驯化后污水,污水的初始混合液悬浮颗粒浓度(MLSS)为1500mg/L,积累周期的运行方式为进水→曝气+搅拌→沉淀→出水,运行周期为12h。进水为木粉水解液,水的碳源浓度为1100mg/L,氮源浓度为20mg/L,磷源浓度为8mg/L,配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液。在每个周期曝气段结束后排出100ml活性污泥混合液。运行周期中沉淀段为1h,沉淀结束后排出250ml上清液。在第9个培养周期对活性污泥进行取样测量。将混合液离心后,取沉淀在-50℃冷冻干燥,再进行酯化,以气相色谱法测量PHBV的合成量。
实施例7
在烧杯中投加驯化后污水,污水的初始混合液悬浮颗粒浓度(MLSS)为1500mg/L,积累周期的运行方式为进水→曝气+搅拌→沉淀→出水,运行周期为12h。进水为木粉水解液,水的碳源浓度为1100mg/L,氮源浓度为40mg/L,磷源浓度为4mg/L,配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液。在每个周期曝气段结束后排出100ml活性污泥混合液。运行周期中沉淀段为1h,沉淀结束后排出250ml上清液。在第9个培养周期对活性污泥进行取样测量。将混合液离心后,取沉淀在-50℃冷冻干燥,再进行酯化,以气相色谱法测量PHBV的合成量。
Claims (10)
1.一种木质碳源驯化污水混合菌种合成聚3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯共聚物的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)水热预处理水解酶解木粉:
将40-80目木粉和超纯水以1:4比例加入高温高压反应釜,反应温度为180-210℃,反应时间为30-60分,得到木粉水解液,冷却;
将冷却后的木粉水解液加超纯水至1L,并调节pH至4.8,加3ml酶解液,放在磁力搅拌器中搅拌,酶解温度为30-60℃,酶解时间为24h-96h,搅拌完成后放入90℃的水浴中加热20分钟,拿出冷却后抽滤,所得滤液测总糖后放入4℃冰箱储存;
2)对污水中能合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)的混合菌群进行驯化富集:
将污水投加在烧杯中进行驯化培养,驯化周期的运行方式为:进水→曝气+搅拌→沉淀→出水,运行周期为12h;
进水为木粉水解液,水的碳源浓度为500mg/L,加入的氮源浓度为40mg/L,磷源浓度为8mg/L,配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液;
在每个周期曝气段结束后排出100ml活性污泥混合液。运行周期中沉淀段为1h,沉淀结束后排出250ml上清液;
3)积累PHA:
在烧杯中投加驯化后污水,污水的初始混合液悬浮颗粒浓度(MLSS)为1500mg/L,培养积累PHA周期的运行方式为进水→曝气+搅拌→沉淀→出水,运行周期为12h;
进水为木粉水解液,水的碳源浓度为800-1700mg/L,加入的氮源浓度为20-40mg/L,磷源浓度为4-8mg/L,配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液;
运行周期中沉淀段为1h,沉淀结束后排出250ml上清液。
2.根据权利要求1中所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中木粉来源包括工农业的木质废弃物粉碎过筛获得、加工剩余、废木屑、秸秆、蔗渣。
3.根据权利要求1中所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中木粉水解液的成分包括:葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸。
4.根据权利要求1中所述的方法,其特征在于,所述步骤2)污水中的菌群包括动胶菌属、芽孢杆菌属、色杆菌属、诺卡氏菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、酵母菌属、放线菌属、黄色杆菌属。
5.根据权利要求1中所述的方法,其特征在于,所述步骤2)中微量元素液组分及含量为40mg/LCaCl2,3mg/LFeCl3·3H2O,0.24mg/LZnSO4·7H2O,0.3mg/LCoCl2·6H2O,0.3mg/LMnCl2·4H2O,0.3mg/LH3BO3,0.06mg/LCuSO4·5H2O,0.06mg/LKI。
6.根据权利要求1中所述的方法,其特征在于,所述步骤2)中氮源包含但不限于NH4Cl,磷源包含但不限于KH2PO4。
7.根据权利要求1中所述的方法,其特征在于,所述步骤3)中积累PHA是在生长限制的条件下完成的,其中生长限制通过限制至少一种营养物来实现,所述至少一种营养物选自P、N、O、K、Mg、Fe或其组合。
8.根据权利要求7中所述的方法,其特征在于,限制营养优选为N和P,其中C:N:P=100:(2-10):(0.4-1.6)。
9.根据权利要求1中所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中木粉水解液的pH值为7左右,通入的氧气含量充足。
10.根据权利要求1中所述的方法,其特征在于,所述步骤3)中调节加入反应器中的碳源浓度,可以调节PHBV中PHB和PHV的比例,其中PHB/PHV为0.9-2.4。
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