CN101323864A - 一种合成聚羟基烷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境保护技术领域,具体涉及一种利用富含聚糖菌(GAO)的活性污泥在厌氧条件下合成聚羟基烷酸(PHA)的方法,即通过对污水处理厂的剩余污泥进行培养驯化使GAO得到富集,在序批式反应器(SBR)中,以短链脂肪酸为碳源,通过控制进水pH和氨氮浓度,将富含GAO的活性污泥微生物在厌氧条件下搅拌一段时间,使其合成PHA。本发明提供了一种合成PHA的新方法,降低了PHA的生产成本。
Description
技术领域
本发明属于环境保护技术领域,具体涉及一种利用富含聚糖菌(GAO)的活性污泥在厌氧条件下合成聚羟基烷酸(PHA)的方法。
背景技术
众所周知,随着经济和社会的发展,化学合成塑料所造成的“白色污染”变得越来越为严重。目前,塑料垃圾以每年2.5×107t的速度在自然界中积累,其填埋、焚烧等处理过程中表现出了许多影响环境的弊端。因此,加强可降解塑料的研究与开发,争取在工艺上取得突破并应用于实际,生产出具有生物可降解性且价格合理的塑料制品,对于环境保护和可持续发展都具有重要的现实意义。
聚羟基烷酸(PHA)是许多原核微生物在不平衡生长条件下,作为胞内能量和碳源贮藏性物质而合成的聚酯,是一类可生物降解塑料,不仅具有与化学合成高分子材料(如聚丙烯)相似的性质,而且还有一般化学合成高分子材料所不具有的性质,如可完全生物降解性、生物相容性、压电性、光学活性等特殊性质。因此,PHA是合成塑料的理想替代品,具有广阔的应用前景,也引起了众多学者的研究兴趣。
目前,对PHA合成方法的研究主要有以下两个方向:研究最多的一类是通过野生菌种的筛选、利用基因工程技术获得能够高效合成PHA的菌种以及开发有效的发酵技术,并通过单一菌株的纯培养来收获PHA,采用此方法,其PHA最高合成率可达到细胞干重的70%以上(例如,文献Applied and EnvironmentMicrobiology,1998,64:4897-4903.)。现阶段采用此种方法合成PHA在工业生产中已经可以实现,如美国Monsanto公司以微生物发酵方式生产生物可降解塑料。其生产工艺大多是利用纯种微生物,生产原料主要是葡萄糖等价格昂贵的有机底物,在工艺运行过程中,要求灭菌消毒,保证发酵系统无杂菌存在。因此,这种PHA生产方式与以石油为原料的传统塑料生产工艺相比成本较高:每公斤PHA生产成本约为9欧元,而每公斤合成塑料仅为1欧元,因而,目前采用此方法合成的PHA大多应用于医学领域(如,骨骼替代品等),在日常生活中的大量使用还不太现实。
为了降低PHA的生产成本,近几年来国内外开始利用混合菌种和多种底物合成PHA的活性污泥法进行实验研究。活性污泥是废水处理系统中自然形成的微生物与有机物的聚集体,1974年有人从活性污泥中提取到PHA,为利用活性污泥生产PHA奠定了基础(例如,文献Environmental Science & Technology,1974,8:576-583.)。最初对于胞内储存物质的研究仅仅局限在生物除磷范围内,直到Cech等1993年首次发现同样能累积PHA和糖原的聚糖菌(GAO),研究者开始意识到微生物胞内储存代谢的特殊性与重要性(例如,文献WaterResearch,1993,27(7):1219-1225)。混合菌种多种底物活性污泥法生产PHA比纯菌种单底物的方法更具有现实可行性。混合菌种使工艺运行简单易于操控,不需要严格的灭菌消毒环境,节省了工艺消耗费用。多种底物的使用可以从根本上降低PHA的生产价格,使底物的选择从昂贵的单一底物转向了低廉的混合底物,例如,使用碳源丰富的工业废水、市政污水和有机废料作为底物。上述诸多优势使活性污泥微生物成为PHA合成方法研究中的新宠,国内外很多学者都对此方法进行了探索和尝试(例如,中国发明专利,申请号200510015481.4;中国发明专利,申请号98126486.7;文献Water Science and Technology,1998,38(2):103-109)。从目前的研究来看,采用这一方法,PHA占细胞干重的比例不是很高,且工艺运行的最优条件也不十分明确,还难以解决PHA大规模商业化生产的经济性问题,所以此方法还有待改进。同时,这些研究多局限于利用活性污泥中的聚磷菌(PAO)作为合成PHA的微生物,却忽视了活性污泥中的GAO同样具有这一能力。
PAO和GAO都是活性污泥中存在的微生物,但到目前为止,还没有文献报导能够分离出纯的GAO或PAO,但这并没有影响人们对其进行研究。在文献中,PAO指的是活性污泥中具有在厌氧条件下释放磷、合成PHA,好氧条件下过量吸收磷、分解PHA的一类微生物的总称;而GAO指的是活性污泥中具有在厌氧条件下分解糖原、合成PHA、但不释放磷,好氧条件下积累糖原、分解PHA、但不过量吸收磷的一类微生物的总称。GAO具有的微生物学特征是:呈四分体排列,主要来自于蛋白菌属(Proteobacteria)的α亚纲以及γ亚纲,35%的微生物呈杂交阳性,Gram染色呈阴性。此外,不像PAO合成PHA时要求废水中有一定量的磷存在,利用GAO合成PHA的一个优势是可以在污水中磷含量较低的条件下进行。
本发明另辟蹊径,依据GAO的代谢规律,建立了一种利用富集GAO的活性污泥在厌氧条件下合成PHA的方法。该活性污泥为来源于A/O、SBR等具除磷功能的污水处理厂的剩余污泥,由于这些工艺多采用厌氧/好氧交替的方式运行,使其剩余污泥中不仅含有大量的PAO,而且含有GAO,便于从中富集培养GAO。该方法的基本原理是:在厌氧条件下,富集GAO的活性污泥微生物利用降解体内糖原所获得的能量吸收乙酸等挥发性脂肪酸,并以PHA的形式储存在体内,能量也随之转移到PHA中。而在好氧条件下,由于此时在环境溶液中缺乏营养物质,但却存在着氧气这种电子受体,所以GAO就会降解体内的PHA,并将产生的电子通过电子传递链最终传递给氧气,使其还原成H2O,在这个过程中产生大量的能量,这些能量一部分用于GAO的自身生长,而余下的则在PHA重新转化成糖原的过程中以糖原的形式储存起来,以便下次在厌氧条件下重新被利用。本发明利用了GAO能在厌氧条件下合成PHA的代谢特点,为解决PHA的合成问题提供了一种有益的方法。到目前为止,有关利用富集GAO的活性污泥在厌氧条件下合成PHA的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用富含聚糖菌(GAO)的活性污泥在厌氧条件下合成聚羟基烷酸(PHA)的方法。
一种合成聚羟基烷酸的方法,其中利用污泥中的聚糖菌合成聚羟基烷酸,步骤如下:
(a)采用除磷污水处理厂的剩余污泥在一定条件下富集培养聚糖菌,得到富含聚糖菌的活性污泥;
(b)富含聚糖菌的活性污泥在厌氧条件下经处理合成聚羟基烷酸。
(c)收集、分离含有聚羟基烷酸的聚糖菌,经溶剂抽提后处理得到聚羟基烷酸产物。
如上所述的方法,其中所述的GAO呈四分体排列,属于蛋白菌属Proteobacteria的α亚纲以及γ亚纲,35%的微生物呈杂交阳性,Gram染色呈阴性;其生理代谢特征是:厌氧阶段不释放磷、但分解糖原和合成PHA,好氧阶段积累糖原并分解PHA、但不过量吸收磷。
如上所述的方法,其中步骤(a)将除磷污水处理厂的活性污泥放入反应器中,加入磷浓度1.3-5mg/L、有机酸浓度216.7-350mg-COD/L、pH6.8-8.0的废水,在厌氧条件下搅拌反应0.5-4h,然后好氧曝气2-5h,经过沉淀和排水后,再加入0.3-0.8体积新鲜废水,如此进行一天3-6个周期、每个周期4-8h的操作。经过1-5个月的培养后,测得每周期厌氧末,活性污泥微生物吸收单位有机酸的磷释放量小于0.25mol磷/C-mol乙酸,吸收单位有机酸的糖原降解量大于0.8C-mol糖原/C-mol乙酸,据此可以判断活性污泥中聚糖菌已成为优势种群,该污泥即为富含聚糖菌的活性污泥。
如上所述的方法,其中步骤(b)将步骤(a)得到的含有富集聚糖菌的活性污泥经1-5小时静置沉淀,取出沉淀物稀释至浓度1500-4500mg/L,置于反应器中在有机酸浓度216-2100mg-COD/L,控制进水pH值6.4-8.0,氨氮浓度3-21mg/L,在厌氧条件下搅拌0.5-3h,反应结束后收集含有聚羟基烷酸的聚糖菌体。
如上所述的方法,其中步骤(b)中控制进水pH在7.6-8.0;氨氮浓度为7mg/L;有机酸浓度为420-490mg/L,采用的有机酸种类为:乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸;厌氧运行时间为2h;所用的反应器为SBR序批式反应器。
与纯种微生物合成PHA相比,本发明的有益效果是:无需灭菌消毒提供无菌环境,可有效降低运行成本,同时系统也较稳定,为PHA的大规模工业化生产提供了可能。
具体实施方式
下面结合实例作进一步详细说明,其中PHA的测定方法参照相关文献(Applied Microbiology and Biotechnology,1978,6:29-37),具体步骤是:将污泥样品于冷冻干燥机中干燥至粉末状,称取干燥后的污泥粉于裂解瓶中,依次加入氯仿、硫酸-甲醇和苯甲酸-甲醇溶液,于102℃下裂解数小时,待冷却后,加蒸馏水离心,取有机相进行气相色谱分析。
实施例1
GAO的富集培养:按文献(Biotechnology and Bioengineering,2001,76(1):17-31)的培养方法并适当改进进行,即将具除磷功能的城市污水处理厂的剩余污泥放入有机玻璃制成的3.5L反应器中,加入磷浓度1.3mg/L、乙酸浓度216.7mg-COD/L、pH6.8的废水2.75L,在厌氧条件下搅拌反应2h,然后好氧曝气3h,经过沉淀和排水后,再加入2.75L新鲜废水,如此进行一天3个周期、每个周期8h的操作。经过近三个月的培养后,测得每周期厌氧末,活性污泥微生物吸收单位有机酸的磷释放量小于0.25mol磷/C-mol乙酸,吸收单位有机酸的糖原降解量大于0.8C-mol糖原/C-mol乙酸,据此可以判断活性污泥中聚糖菌已成为优势种群,该污泥即为富含GAO的活性污泥,其微生物学特征是:呈四分体排列,主要来自于蛋白菌属(Proteobacteria)的α亚纲以及γ亚纲,35%的微生物呈杂交阳性,Gram染色呈阴性;其生理代谢特征是:厌氧阶段基本没有磷的释放、但分解糖原和合成PHA,好氧阶段积累糖原并分解PHA、但没有磷的过量吸收。
PHA的合成方法如下:将700ml经3小时静置沉淀的富含GAO的活性污泥置于工作容积3.5L的有机玻璃反应器中,并稀释至污泥浓度约3000mg/L,以丙酸为碳源(浓度280mg-COD/L),控制进水pH=6.4,氨氮浓度21mg/L,在厌氧条件下搅拌2h,厌氧结束时收集菌体,测得每克菌体中含PHA 35mg。
实施例2
GAO的富集培养及污泥中PHA的测定方法见实施例1。PHA的合成如下:改变进水pH=7.2,并在厌氧条件下搅拌3h,其余合成条件同实施例1,测得每克菌体中含PHA44mg。
实施例3
GAO的富集培养及污泥中PHA的测定方法见实施例1。PHA的合成如下:改变丙酸浓度为350mg-COD/L,并控制进水pH=7.6,在厌氧条件下搅拌0.5h,其余合成条件同实施例1,测得每克菌体中含PHA 31mg。
实施例4
GAO的富集培养及污泥中PHA的测定方法见实施例1。PHA的合成如下:改变进水pH=8.0,其余合成条件同实施例1,测得每克菌体中含PHA 69mg。
实施例5
GAO的富集培养及污泥中PHA的测定方法见实施例1。PHA的合成如下:改为以乙酸和丙酸为碳源(浓度216mg-COD/L,其中丙酸193mg-COD/L,乙酸23mg-COD/L),并控制进水pH=6.8,其余合成条件同实施例1,测得每克菌体中含PHA 54mg。
实施例6
GAO的富集培养及污泥中PHA的测定方法见实施例1。PHA的合成如下:改为将GAO置于工作容积1L的烧杯中,并以乙酸和丙酸为碳源(浓度2100mg-COD/L,其中乙酸1750mg-COD/L,丙酸350mg-COD/L),控制进水pH=7.6,氨氮浓度7mg/L,其余合成条件同实施例1,测得每克菌体中含PHA 30mg。
实施例7
GAO的富集培养及污泥中PHA的测定方法见实施例1。PHA的合成如下:改变丙酸浓度为350mg-COD/L,并控制进水pH=8.0,其余合成条件同实施例1,测得每克菌体中含PHA 90mg。
实施例8
GAO的富集培养及污泥中PHA的测定方法见实施例1。PHA的合成如下:改变丙酸浓度为350mg-COD/L,并控制进水pH=7.6,氨氮浓度7mg/L,其余合成条件同实施例1,测得每克菌体中含PHA 161mg。
实施例9
GAO的富集培养及污泥中PHA的测定方法见实施例1。PHA的合成如下:改变进水pH=6.8,并控制进水氨氮浓度3mg/L,其余合成条件同实施例1,测得每克菌体中含PHA 132mg。
实施例10
GAO的富集培养及污泥中PHA的测定方法见实施例1。PHA的合成如下:改变丙酸浓度为420mg-COD/L,并控制进水pH=7.6,氨氮浓度7mg/L,其余合成条件同实施例1,测得每克菌体中含PHA 418mg。
实施例11
GAO的富集培养及污泥中PHA的测定方法见实施例1。PHA的合成如下:改变丙酸浓度为490mg-COD/L,并控制进水pH=7.6,氨氮浓度7mg/L,其余合成条件同实施例1,测得每克菌体中含PHA 589mg,采用凝胶渗透色谱测得该PHA相对分子质量约8×105,采用差示扫描量热仪测得结晶度约80%。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于这里的实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种合成聚羟基烷酸的方法,其特征在于利用污泥中的聚糖菌合成聚羟基烷酸,步骤如下:
(a)采用具除磷功能的污水处理厂的剩余污泥在一定条件下培养富集聚糖菌,得到富含聚糖菌的活性污泥;
(b)富含聚糖菌的活性污泥在厌氧条件下经处理合成聚羟基烷酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的聚糖菌呈四分体排列,属于蛋白菌属Proteobacteria的α亚纲以及γ亚纲,35%的微生物呈杂交阳性,Gram染色呈阴性;其生理代谢特征是:厌氧阶段不释放磷、但分解糖原和合成PHA,好氧阶段积累糖原并分解PHA、但不过量吸收磷。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(a)将除磷污水处理厂的活性污泥放入反应器中,加入磷浓度1.3-5mg/L、有机酸浓度216.7-350mg-COD/L、pH6.8-8.0的废水,在厌氧条件下搅拌反应0.5-4h,然后好氧曝气2-5h,经过沉淀和排水后,再加入0.3-0.8体积新鲜废水,如此进行一天3-6个周期、每个周期4-8h的操作;经过1-5个月培养,测得每周期厌氧末,活性污泥微生物吸收单位有机酸的磷释放量小于0.25mol磷/C-mol乙酸,吸收单位有机酸的糖原降解量大于0.8C-mol糖原/C-mol乙酸,据此可以判断活性污泥中聚糖菌已成为优势种群,该污泥即为富含聚糖菌的活性污泥。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(b)将步骤(a)得到的富含聚糖菌的活性污泥经1-5小时静置沉淀,取出沉淀物稀释至浓度1500-4500mg/L,置于反应器中在有机酸浓度216-2100mg-COD/L,控制进水pH值6.4-8.0,氨氮浓度3-21mg/L,在厌氧条件下搅拌0.5-3h,反应结束后收集含有聚羟基烷酸的聚糖菌体。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于步骤(b)中控制进水pH在7.6-8.0。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于步骤(b)中控制进水氨氮浓度为7mg/L。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于步骤(b)中控制进水有机酸浓度为420-490mg/L。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于步骤(b)中采用的有机酸种类为C2-C6短链脂肪酸,具体包括乙酸、丙酸、丁酸。
9.根据权利要求4所述的方法,其特征在于步骤(b)中厌氧运行时间为2h。
10.根据权利要求4所述的方法,其特征在于步骤(b)中所用的反应器为SBR序批式反应器。
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