CN104651420A - 一种利用剩余污泥发酵液VFAs合成PHBV的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用剩余污泥发酵液VFAs合成PHBV的方法，属于可生物降解塑料合成领域。首先将剩余污泥在厌氧条件下进行产酸发酵，离心分离得到发酵液；然后以剩余污泥发酵液中挥发性脂肪酸为碳源，利用活性污泥中的混合菌群合成PHBV共聚物。本发明方法解决了目前PHBV生产过程中碳源成本高及合成量低的问题，降低了PHBV的生产成本，有利于剩余污泥的资源化利用。

Description

一种利用剩余污泥发酵液VFAs合成PHBV的方法
技术领域
本发明涉及一种利用剩余污泥发酵液VFAs(挥发性脂肪酸)合成PHBV的方法，属于可生物降解塑料合成领域。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是原核微生物在外界环境碳、氮营养失衡的情况下作为碳源和能源物质在细胞内合成并贮存的一类热塑性聚酯。目前一般通过纯种细菌发酵法小规模的生产PHA，Shira等以葡萄糖为唯一碳源利用光合菌Rhodobacter spheroids合成PHA，其产率为6gPHA/L。贺文楠等以葡萄糖为碳源利用菌种DG17(油田土壤中筛选)通过微生物发酵方式合成PHA，得到单位微生物中合成高达65.6％比例的PHA。
活性污泥这种以细菌为主的混合菌群也可以用于合成PHA。Lemos等研究了在驯化活性污泥的两个反应器中分别加入乙酸和丙酸这样的单一酸底物时，得到的微生物PHA产量及组成。结果表明，合成的聚合物PHA的组成和性质随着加入有机酸的种类和比例的改变而发生相应的改变。Dionisi等以乙酸、丙酸、乳酸混合物为底物，研究活性污泥PHA的储存情况，结果发现，单一的乙酸、乳酸合成的物质为PHB(聚3-羟基丁酸酯)，而单一的丙酸转化为PHV(聚3-羟基戊酸酯)，乙酸与乳酸只有和丙酸一起存在时才形成共聚物PHBV(3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物)，以三种酸为混合底物，得到的PHA在细胞内的最大含量为50％(统一以COD为单位)。Bengtsson等研究了应用处理造纸厂污水的污泥合成PHA的情况，包括三个步骤:一是造纸废水的厌氧酸化，转化为乙酸、丙酸、乳酸、丁酸、等易合成PHA的混合酸，二是采用好氧动态供料法对活性污泥进行驯化，三是批式试验合成PHA，通过这种方法得到的PHA合成量可以达到细胞干重的48％。
PHA的材料学性质主要是由它的单体组成决定，目前发现的活性污泥利用废水合成的PHA聚合物主要是短链PHA，其羟基烷酸单体(HA)主要有3-羟基丁酸(HB)、2-甲基-3-羟基丁酸(HMB)、3-羟基戊酸(HV)、2-甲基-3-羟基戊酸(HMV)。其中，HB和HV聚合成的PHBV共聚物的性质与聚丙烯十分接近。随着PHBV中HV含量的增加，PHBV的抗冲击性、韧度、柔性和加工特性得到加强，因此应用前景十分广泛。林东恩等研究表明，合成PHA聚合物的组成与性质与加入碳源的种类和比例有关，并随碳源的改变而发生相应的变化。采用乙酸钠作为碳源所得到的PHA主要成分是PHB，而且碳源转化率较高。采用丙酸钠作为碳源所得到的PHA主要成分是PHV，碳源转化率较低。而采用丁酸钠作为碳源所得到的PHA以3HB单体为主，3HV单体为辅的共混共聚物。
挥发性有机酸(VFAs)作碳源，含奇数碳原子的有机酸(如丙酸、戊酸)会转化成丙酰-CoA，丙酰-CoA和乙酰-CoA缩合成3HV单体；含偶数碳原子的有机酸(如乙酸、丁酸)会转化成3HB单体。由于污泥中同一优势菌群在利用不同类型碳源时，代谢调控方式不同，因此活性污泥能够利用不同类型的碳源合成不同的PHA单体。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用剩余污泥发酵液VFAs合成PHBV的方法，以解决现有技术中存在的合成可生物降解塑料的碳源成本比较高；合成量偏低的问题。
一种利用剩余污泥发酵液VFAs合成PHBV的方法，包括：首先将剩余污泥在厌氧条件下进行产酸发酵，生成以乙酸为主的挥发性脂肪酸(VFAs)，离心分离得到发酵液；然后以剩余污泥发酵液中挥发性脂肪酸为碳源，利用活性污泥中的混合菌群合成PHBV共聚物，从而降低生产成本。
所述的活性污泥来自于城市污水处理厂；剩余污泥为城市污水处理厂的活性污泥系统中从二次沉淀池或沉淀区排出系统外的活性污泥。
所述的剩余污泥发酵液的制备方法，包括如下步骤：将剩余污泥在25-35℃，初始pH为10-11的条件下，发酵2-3天，吹氮气保证其处于厌氧状态，离心分离得到含VFAs的发酵液。此发酵液中含有以乙酸为主的多种挥发性脂肪酸，可以作为合成可生物降解塑料的碳源。
上述方法中，优选的温度为30℃，pH为10，发酵3天。
上述方法中，剩余污泥中可加入由剩余污泥驯化得到的接种污泥，以加快产酸速度。
以剩余污泥发酵液中挥发性有机酸为碳源，利用活性污泥合成PHBV共聚物的方法，包括如下步骤：将活性污泥置于序批式反应器(SBR反应器)中，采用间歇操作方式运行反应器，8h为一个周期，一次性注入稀释的剩余污泥发酵液，经曝气、沉淀、排水，再补充等量碳源，重复上述操作若干次以提高PHBV合成量，使PHBV的质量百分含量达到污泥干重的30％以上。
合成PHBV共聚物的工艺条件为：溶解氧为0-4mg/L，温度为30±0.1℃，pH为6-8，曝气6h，沉淀1h、排水1h，重复操作6～8次，得到PHBV共聚物。
稀释的剩余污泥发酵液中，化学需氧量(COD)为500-600mg/L。
合成PHBV共聚物的具体步骤包括：将活性污泥置于SBR反应器中，采用间歇操作方式运行反应器，8h为一个周期，在进水时一次性注入稀释的剩余污泥发酵液，匀速注入空气，控制底物溶液中的溶解氧浓度在0-4mg/L，温度30±0.1℃，pH＝6-8；6h后停止曝气，沉淀1h；排出上清液，再补充等量碳源(稀释的剩余污泥发酵液)，曝气，沉淀，排水；重复上述操作6～8次，即完成。PHBV的质量百分含量可达到污泥干重的30％以上。
本发明的优点：
1)提取的PHA为PHBV共聚物，具有高分解温度，低熔点温度。
2)该方法利用剩余污泥发酵液合成共聚体，降低了PHBV的生产成本，提高了合成量；同时有利于实现剩余污泥的资源化。
附图说明
图1是接种污泥驯化反应装置示意图。
图2是接种污泥驯化中COD及VFAs总量随时间的变化。
图3是周期内COD与PHA的变化情况。
图4-1至图4-4分别是周期内VFAs及组分乙酸、丙酸和丁酸的变化情况。
图5是合成的PHBV的红外光谱。
具体实施方式
实施例1：影响厌氧污泥发酵的单因素实验—pH
本实施例主要确定pH的取值，为了加快产酸速度，加了接种污泥，可通过剩余污泥驯化得到，含产酸菌较多，具体驯化方法如下。剩余污泥直接厌氧发酵的效果可以满足要求时可不必加接种污泥。
接种污泥驯化
为提高污泥厌氧发酵产酸的效果，预先对部分剩余污泥进行厌氧发酵培养，驯化出富集产酸菌的接种污泥，接种污泥驯化反应装置如图1所示。反应器为5L的下口瓶1，瓶口有胶塞，用导管连通内外，底部出口用止水夹2封住，加入2L待用污泥和1L驯化营养液。反应器固定在恒温水浴锅3中，水浴锅3下部为加热圈4，侧面具有数显装置5，调节水浴温度为30-35℃。实验前通过导管将氮气吹入瓶中，维持3min以排空瓶内的空气。
驯化营养液采用葡萄糖为单一碳源，其成分包括：C6H12O64688mg/L，NH4Cl477.68mg/L，K2HPO487.18mg/L，CaCl211.10mg/L，MgSO4·7H2O 91.20mg/L，以及2mL/L微量元素。微量元素含有供微生物生长所需的各种物质，其配方为：EDTA10g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.12g·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.06g·L-1，MnCl2·4H2O 0.12g·L-1，KI 0.18g·L-1，CuSO4·5H2O 0.03g·L-1，H3BO30.15g·L-1，FeCl3·6H2O 1.5g·L-1。
连续每天从反应器底部出口取样20mL置于50mL离心管中，转速5000r/min，离心10min，用0.45μm针式过滤器过滤，得滤液5mL用于COD及VFAs的测定。测定COD及VFAs总量，如图2所示。
由图2可知，前4天，反应器中COD浓度呈现上升趋势，在第5～6天逐渐下降，相应VFAs在前4天增长了280.54mg/L，而在第5～6天趋于平稳。出现上述现象的原因可能是污泥在完全厌氧环境下，提供高浓度有机负荷，污泥能够较快速的进入水解产酸阶段，产酸菌大量增殖，使得污泥发酵液中的COD与VFAs都有较大程度的增加。而随着驯化进入第5天，产酸速率减慢，为了利用接种污泥中的产酸菌，因此确定驯化时间为4天，排出的泥作为接种污泥，用于与剩余污泥混合进行厌氧发酵产酸实验。
实验步骤：分别取剩余污泥和接种污泥各200mL混合均匀，平均加入到6组50mL离心管中，用6mol/L的NaOH或6mol/L的HCl将污泥的pH值分别调节为8、9、10、11、12、13，旋紧管盖，放入恒温水浴振荡器中，在30℃下水浴振荡3天，离心管全部没入水中，控制反应温度和时间，调节转速100r/min，进行发酵产酸实验。将完成实验后的离心管取出，用针式过滤器过滤，得到至少1mL滤液于2mL离心管，加入50μL甲酸和100μL内标物质，然后对六组样品进行气相色谱分析，结果见表1。
表1 不同pH条件的试验结果
由此可知，VFAs产量在pH从8到10过程中呈现递增趋势，在pH从10到13过程中逐渐下降，在pH＝10时达到最大值332.31mg/L。其组分乙酸、丙酸同样分别在pH＝10时达到最大值272.75mg/L、17.94mg/L。此外，pH从8到13过程中乙酸占VFAs总量均在75％以上，占绝大部分。丙酸与其他组分所占比例小，变化也不明显。
实施例2：影响厌氧污泥发酵的正交实验
根据污泥厌氧发酵工艺的控制参数，选择初始pH、反应温度、发酵天数三个因素，对每个影响因素分别选择3个水平，设计L9(33)正交实验，考察这些因素对污泥厌氧发酵工艺的影响，以确定既能保证污泥厌氧发酵液中VFAs总量又能保证乙酸、丙酸含量的最佳工艺条件。正交实验结果见表2。
表2 正交试验结果
以VFAs产量为目标，采用极差法对试验结果进行分析，见表3。
表3 VFAs正交实验极差分析表
在考虑VFAs产量时，最优组合为A2B2C3，根据极差水平分析，A>C>B，即调节初始pH对污泥厌氧发酵产酸量的影响最大，其次为发酵天数，发酵温度的影响最小。
根据上述实验结果，制备剩余污泥发酵液时，将剩余污泥在25-35℃，初始pH＝10-11的条件下，发酵2-3天，定期吹氮气保证其处于厌氧状态，离心分离得到含VFAs的发酵液，此发酵液中含有以乙酸为主的多种挥发性脂肪酸，可以作为合成可生物降解塑料的碳源。
实施例3：活性污泥利用污泥发酵液单周期运行合成PHA
取稀释的剩余污泥发酵液1.5L，测得COD＝540mg/L。小试实验在4L烧杯中进行，烧杯加入主反应器污泥(来自于城市污水处理厂的活性污泥)2L，MLSS(混合液悬浮固体浓度)为1800mg/L，采用瞬时进水方式，曝气，分别考察COD、VFAs、PHA的变化。
图3是周期内COD与PHA的变化情况，由图可知在将近10h长时间的反应条件下，系统内COD浓度不断减少，COD的去除率为70.65％。PHA呈现先增加后减小的规律。在330min时，PHA合成量最大为104.15mg/g，是初始PHA含量的3.57倍，其中PHB为81.52mg/g占PHA的78.27％，PHV为22.63mg/g，占PHA的21.73％。
图4-1至图4-4分别是周期内VFAs及各组分乙酸、丙酸和丁酸的变化情况。在反应周期内，乙酸从389.44mg/L下降到74.60mg/L，利用率为80.84％，丙酸由29.01mg/L下降到8.02mg/L，利用率为72.35％，丁酸从34.58mg/L下降到19.59mg/L，利用率仅为43.35％。可以看出，乙酸和丙酸是活性污泥较为容易利用的碳源，丁酸利用率偏低。
实施例4：活性污泥利用污泥发酵液多周期运行合成PHA
从污水处理厂取活性污泥200ml置于500ml锥形瓶中，采用间歇操作方式运行反应器，一个周期8h，在进水时一次性注入150ml稀释的剩余污泥厌氧发酵液(COD520mg/L左右)，反应器中污泥的浓度为1840mg/L，匀速注入空气，控制反应器中溶解氧浓度不高于4mg/L。6h后停止曝气，沉淀1h，排出上清液，取泥样通过气相色谱检测PHA含量。
再次注入150ml污泥发酵液，曝气6h，沉淀1h，排水；如此重复8个周期，得到的PHA的质量百分含量(占污泥干重的百分比)如表4。可以看到，运行6-8个周期PHA合成量可高于污泥干重的30％。
表4 8个周期合成PHA实验结果
根据上述实验，取活性污泥置于SBR反应器中，采用间歇操作方式运行反应器，8h一个周期，在进水时一次性注入稀释的污泥厌氧发酵液(COD500-600mg/L)，匀速注入空气，控制底物溶液中的溶解氧浓度在0-4mg/L(优选1-3mg/L)。6h后停止曝气，沉淀1h。排出上清液，再补充等量碳源，曝气，沉淀，排水；如此重复6～8次，即完成。条件：温度30±0.1℃，pH＝6-8；PHA的质量百分含量可达到污泥干重的30％以上。
实施例5：对实施例4合成的PHA进行鉴定
采用100％次氯酸钠破壁剂破壁，提取温度为45℃，提取时间为6小时，提取PHAs。进行傅里叶变换红外光谱分析，如图5。一般来说，羰基峰在1724cm-1左右，确定为PHB；羰基峰位在1725-1730cm-1左右，可认为是PHB与PHV共聚，其中PHB含量高；羰基峰位在1730-1740cm-1左右，则认为PHB与PHV共聚，其中PHV的含量高；羰基峰位在1740cm-1以上，则认为是中碳链的PHA共聚。
由图5中可以看出，羰基峰的峰位在1732cm-1左右，因此推测PHA样品为PHB与PHV共聚，即为PHBV。
本发明首先将剩余污泥在厌氧条件下进行产酸发酵，生成以乙酸为主的挥发性脂肪酸(VFAs)，离心分离得到发酵液。然后取活性污泥置于SBR反应器中，采用间歇操作方式运行反应器，8h一个周期，一次性注入稀释的污泥厌氧发酵液，经曝气，沉淀，排水的若干次重复，使PHBV的质量百分含量可达到污泥干重的30％以上。本发明方法解决了目前PHBV生产过程中碳源成本高及合成量低的问题，降低了PHBA的生产成本，有利于剩余污泥的资源化利用。

Claims (7)

1.一种利用剩余污泥发酵液VFAs合成PHBV的方法，其特征在于：首先将剩余污泥在厌氧条件下进行产酸发酵，离心分离得到发酵液；然后以剩余污泥发酵液中挥发性脂肪酸为碳源，利用活性污泥中的混合菌群合成PHBV共聚物。
2.根据权利要求1所述的利用剩余污泥发酵液VFAs合成PHBV的方法，其特征在于：剩余污泥发酵液的制备方法，包括如下步骤：将剩余污泥在25-35℃，初始pH为10-11的条件下，发酵2-3天，吹氮气保证其处于厌氧状态，离心分离得到发酵液。
3.根据权利要求2所述的利用剩余污泥发酵液VFAs合成PHBV的方法，其特征在于：所述的剩余污泥发酵液的制备方法中，温度为30℃，pH为10，发酵时间为3天。
4.根据权利要求2所述的利用剩余污泥发酵液VFAs合成PHBV的方法，其特征在于：所述的剩余污泥中加入由剩余污泥驯化得到的接种污泥。
5.根据权利要求1所述的利用剩余污泥发酵液VFAs合成PHBV的方法，其特征在于：合成PHBV共聚物的方法，包括如下步骤：将活性污泥置于序批式反应器中，采用间歇操作方式运行反应器，8h为一个周期，一次性注入稀释的剩余污泥发酵液，经曝气、沉淀、排水，再补充等量碳源，重复上述操作若干次，使PHBV的质量百分含量达到污泥干重的30％以上。
6.根据权利要求4所述的利用剩余污泥发酵液VFAs合成PHBV的方法，其特征在于：合成PHBV共聚物的工艺条件为：溶解氧为0-4mg/L，温度为30±0.1℃，pH为6-8，曝气6h，沉淀1h、排水，重复操作6～8次，得到PHBV共聚物。
7.根据权利要求4所述的利用剩余污泥发酵液VFAs合成PHBV的方法，其特征在于：所述的稀释的剩余污泥发酵液中，化学需氧量为500-600mg/L。
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