CN102643875B - 一种利用菊芋水解液生产d-乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产D-乳酸的方法。本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法包括如下步骤：将菊糖芽孢乳杆菌Sporolactobacillus inulinus)接种到以菊芋水解液作为唯一碳源的发酵培养基中进行发酵培养，得到D-乳酸；所述菊芋水解液中果糖和葡萄糖的质量比为(3-5)∶1；所述菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)为菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No.2185。本发明中2L发酵体系，以含还原糖49.25g/L的菊芋水解液为原料，发酵96h，D-乳酸转化率可达92.8％；本发明方法可以有效降低发酵所使用的各原料成本，变废为宝，降低环境污染，并高效发酵产生旋光性99％聚合级的D-乳酸，具有很好的工业应用型前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种发酵生产D-乳酸的方法；特别涉及一种菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)利用菊芋水解液生产D-乳酸的方法。
背景技术
乳酸又称丙醇酸，分子式C3H6O3(CH3CHOHCOOH)，分子量90.07884。由于乳酸分子中存在一个不对称的碳原子，因此具有光学异构现象，从而分为D-型和L-型两种。其生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法，化学法只能合成DL-乳酸，而发酵法根据所采用的菌株的不同，可以合成单一的L-乳酸、D-乳酸或者DL-乳酸。目前，约90％的乳酸是通过微生物发酵法生产的。D-乳酸作为一种主要的基本有机化工原料，在医药、农药、化工等方面均有十分广泛的应用。尤其是作为下一代高强度生物可降解塑料聚乳酸的单体，正在引起全球大公司和科学家的高度关注。全球D-乳酸的需求量每年都以6％～8％的速度增长，目前全世界D-乳酸的产量为1.6万吨，而D-乳酸的需求量约2.6万吨，由此可见，D-乳酸的市场前景广泛。随着全球性的能源和资源供求关系的日益紧张，以可再生生物质原料的高浓度、高光学纯D-乳酸生物制造势在必行。发展光学纯D-乳酸生物制造技术，将会促进可降解材料——聚乳酸的发展，对实施石油替代战略，确保国家能源与资源安全具有极为重要的作用。
聚乳酸是一种由乳酸聚合而成的生物可降解性高分子聚合物，具有良好的生物相容性和生物可降解性。聚乳酸可用作药物缓释材料、手术缝合线、生物植片、组织修复材料等。聚乳酸制成的生物可降解纤维，耐热性175℃，可与聚酯纤维一样，制成长丝、短丝，用于服装和非服装织物，具有天然纤维的吸湿性，较好的手感，又有合成纤维的光滑和舒适挺括。聚乳酸制成的生物可降解塑料，能够代替PVC、PP塑料，用于塑料食品器具、医用服装、个人卫生用品、婴儿尿布、垃圾袋、农用地膜及各种包装行业，从而减少“白色污染”，有利于环境保护。用乳酸生产生物降解塑料，在我国具有极大的市场发展潜力，目前已成为开发的热点项目。但是，由光学纯L-乳酸制得的聚乳酸在强度、热稳定性等方面尚需进一步的改进才能适应更为广泛的应用的需要。有报道称，由聚L-乳酸和聚D-乳酸混合而成的聚乳酸与聚L-乳酸相比具有更佳的结构和性能。
虽然高纯度D-乳酸具有广阔的市场前景，但目前商业化的高纯度D-乳酸产品很少，高纯度D-乳酸的价格也远高于L-乳酸的价格。因此，采用廉价的非粮原料生产高纯度D-乳酸，具有良好的市场前景，一方面减轻对环境的压力，另一方面也会大大提高其经济价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵生产D-乳酸的方法。
本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法，包括如下步骤：将菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)接种到以菊芋水解液作为唯一碳源的发酵培养基中进行发酵培养，得到D-乳酸。所述菊芋水解液中果糖和葡萄糖的质量比可为(3-5)∶1，具体如4∶1。
所述菊芋水解液中总还原糖在所述发酵培养基中的终浓度可为46-55g/L，如49.25g/L。
所述菊芋水解液中的所述总还原糖为果糖和葡萄糖；所述果糖在所述发酵培养基中的终浓度可为38-42g/L，如39.4g/L，所述葡萄糖糖在所述发酵培养基中的终浓度可为8-12g/L，如9.85g/L。
所述发酵培养基由碳源，氮源和控制发酵液pH的中和剂组成。在本发明的实施例中，所述碳源即为上述菊芋水解液，所述菊芋水解液含有在所述发酵培养基中终浓度为49.25g/L的总还原糖，所述总还原糖为果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的质量比可为(3-5)∶1，具体如4∶1；所述氮源为在所述发酵培养基中终浓度为10g/L的酵母粉；所述中和剂为碳酸钙；所述碳酸钙在所述发酵培养基中的含量可为所述总还原糖质量的60％，在本发明的一个实施例中，所述碳酸钙的终浓度具体为30g/L；所述发酵培养基的pH为6.5。
所述发酵培养的温度可为42℃；所述发酵培养的培养方式可为静止培养；所述发酵培养的时间可为40-96h，如96h。
本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法中，接种到所述发酵培养基中进行培养的所述菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)是经过活化的菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)；在本发明的具体实施例中，其活化方法为如下1)或2)：
1)将所述菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)接入种子培养基，在42℃静止培养48h，得到培养物1，将所述培养物1按照1∶10的体积比转接到新的种子培养基中，继续42℃静止培养24h，得到培养物2，所述培养物2即为所述活化的菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)；
2)将步骤1)所述培养物2按照1∶10的体积比转接到新的种子培养基中，继续42℃静止培养24h，得到所述活化的菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)；
所述种子培养基中含有终浓度为50g/L的果糖，终浓度为10g/L的酵母粉，以及终浓度为30g/L的碳酸钙，余量为水；所述种子培养基的pH为6.5。所述酵母粉为商业化产品，可以从国内生产商购买，比如安琪酵母股份有限公司。
在本发明中，上述所有菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)均为菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No.2185。
在本发明中，进行所述发酵培养的所述发酵培养基需经高压灭菌，具体为115℃高压灭菌10min。
所述菊芋水解液在发酵生产D-乳酸中的应用也属于本发明的保护范围。
所述应用具体为菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)在以菊芋水解液作为唯一碳源，发酵生产D-乳酸中的应用。
所述菊芋水解液中果糖和葡萄糖的质量比可为(3-5)∶1，具体如4∶1。
本发明的另一个目的是提供一种培养基，其特征在于：所述培养基由菊芋水解液、酵母粉和碳酸钙组成；所述菊芋水解液中含有果糖和葡萄糖，所述果糖在所述培养基中的终浓度为38-42g/L，所述葡萄糖在所述发酵培养基中的终浓度为8-12g/L；所述酵母粉在所述培养基中的终浓度为10g/L；所述碳酸钙在所述培养基中的终浓度为30g/L；所述培养基的pH为6.5。
在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基中所述果糖的终浓度为39.4g/L，所述葡萄糖的终浓度为9.85g/L。
所述培养基在发酵生产D-乳酸中的应用也属于本发明的保护范围。在本发明中，所述应用中所用的发酵菌株为菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASDCGMCC No.2185。
上述所有所述菊芋水解液均为将菊芋块茎用菊粉酶水解得到的菊芋水解液。
在实际应用中，可以新鲜的菊芋块茎为原料，也可以以菊芋粉为原料进行菊粉酶水解，从而获得菊芋水解液。
所述菊粉酶可从商业途径获得，如美国西格玛(Sigma)公司，产品目录号为16285，CAS 9025-67-6。
所述菊粉酶的用量为20U/g菊芋(粉)。酶活单位(U)定义为每分钟产生1μmoL还原糖所需要的酶量。
本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法中，菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus iauliaus)CASD CGMCC No.2185以菊芋水解液为唯一碳源，其生产D-乳酸的能力强，D-乳酸产量45-49克/升(每升发酵液生产45-49克D-乳酸)；糖酸转化率达到92-99％；且光学纯度达到99％。
附图说明
图1为随着菊芋水解液浓度(总还原糖浓度)的提高，发酵液中相应总还原糖浓度的变化。
图2为随着菊芋水解液浓度(总还原糖浓度)的提高，发酵液中相应D-乳酸浓度的变化。
图3为分批发酵模式放大实验高效生产D-乳酸，发酵液中相应总还原糖和D-乳酸浓度的变化。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所有的菊芋水解液，均按照如下方法制备得到：
先将新鲜的菊芋块茎洗净，切成薄片，过夜烘干后，用高速粉碎机打粉过60目筛子。然后用蒸馏水将菊芋粉配成一定浓度的浸液，加入菊粉酶(美国西格玛(Sigma)公司，产品目录号为16285，CAS 9025-67-6。酶活单位(U)定义为每分钟产生1μmoL还原糖所需要的酶量)的量为20U/g菊芋粉，用2mol/L的HCl调pH至5.2，置于42℃条件下水解过夜，所得溶液即为本发明所用的菊芋水解液。所得菊芋水解液含果糖66.2g/L和葡萄糖16.55g/L，其中果糖和葡萄糖的质量比为4∶1。
下述实施例中所涉及的各参数测定方法均如下：
(1)总还原糖浓度采用DNS法(3，5-二硝基水杨酸比色法)测定，使用山东省科学院生物研究所的总还原糖测定仪测定，仪器型号为SGD-IV。
其中DNS法的原理是：在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸(DNS)共热，3，5-二硝基水杨酸被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，而还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。
(2)L-乳酸和D-乳酸浓度的测定方法为，采用Agilent 1200液相色谱仪，配备手性分离柱(日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10W，4.6mm ID×50mm，光学异构体分离用)。具体操作条件为：2mM的硫酸铜作为流动相，流量0.5ml/min，进样量10μl，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25℃。利用L-乳酸和D-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量。
(3)糖酸转化率均定义为：D-乳酸产量(克/升)÷总还原糖的消耗量(克/升)×100％。
(4)光学纯度(optical purity)：是衡量旋光性样品中一个对映体超过另一个对映体的量的量度，它可用对映体过量值(enantiomeric excess)表示。本发明中D-乳酸的光学纯度按以下公式计算：(D-乳酸含量-L-乳酸含量)÷(D-乳酸含量+L-乳酸含量)×100％。
菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)为菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD，该菌株已于2007年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.2185(专利授权公告号CN 100485027C)。
种子培养基：终浓度为50g/L的果糖，终浓度为10g/L的酵母粉，以及终浓度为30g/L的碳酸钙，余量为水；pH为6.5。
实施例1、高效生产D-乳酸的最适菊芋水解液浓度的确定
本实施例所用发酵培养基依据菊芋水解液浓度的不同，共四种：取0.3L(或0.6L，或0.9L，或1.0L)上述菊芋水解液，10g酵母粉(安琪酵母股份有限公司)，含量为总还原糖质量60％的碳酸钙，用蒸馏水定容至1L；调pH为6.5。按照上述方法配制所得的四种发酵培养基中总还原糖(果糖和葡萄糖的总和，来自于菊芋水解液)的终浓度，依据菊芋水解液加量由少到多的顺序，分别为24.75g/L、49.25g/L、73.5g/L和82.75g/L。
确定用于生产D-乳酸的最适菊芋水解液浓度的具体步骤如下：
1)种子菌培养：将保存在MRS固体培养基上的菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No.2185用接种环接一环到含有6mL种子培养基的试管中，42℃静止培养2d，然后从中取3ml转接到含有30mL新鲜种子培养基的三角瓶中，42℃静止培养1d，得到种子液(活化的菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No.2185)。
2)将步骤1)的种子液按体积比1∶10的接种量接到上述四种含有不同浓度菊芋水解液的发酵培养基中。42℃静止发酵96小时。从0h(将种子液接种到发酵培养基中的一刻)开始，每隔6h，取发酵液，12000rpm离心10分钟后，，取上清液测定如下参数：总还原糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度；计算糖酸转化率。实验设3个重复，结果取平均值。
结果如图1和图2所示，当在含总还原糖24.75g/L浓度水平时，发酵20h时还原糖基本消耗完毕，总还原糖49.25g/L(果糖39.4g/L；葡萄糖9.85g/L)的菊芋水解液在发酵40h时还原糖基本消耗完毕，总还原糖73.5g/L和总还原糖82.75g/L的菊芋水解液在96h发酵结束时残糖浓度依旧很高；在发酵40h时，随着初始总还原糖含量的由低到高，四种发酵培养基中D-乳酸的产量分别为：24.5g/L、49g/L、38g/L和33g/L。依据发酵时间短，糖酸转化率高和D-乳酸产量高，确定菊粉水解液的最适浓度为总还原糖49.25g/L。
实施例2、分批发酵模式放大实验高效生产D-乳酸
本实施例所用发酵培养基的配方如下：在发酵培养基中总还原糖终浓度为49.25g/L(果糖39.4g/L；葡萄糖9.85g/L)的菊芋水解液(每升发酵培养基中菊芋水解液的用量为0.6L)；氮源为终浓度10g/L的酵母粉；终浓度为30g/L的碳酸钙；pH6.5。
分批发酵模式放大实验高效生产D-乳酸的具体步骤如下：
1)种子菌培养：将保存在MRS固体培养基上的菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No.2185用接种环接一环到含有6mL种子培养基的试管中，42℃静止培养2d，然后从中取3ml转接到含有30mL新鲜种子培养基的三角瓶中，42℃静止培养1d，接着从中取20ml转接到含有200mL新鲜培养基的三角瓶中，42℃静止培养1d，得到种子液(活化的菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No.2185)。
2)将步骤1)的种子液按体积比10％的接种量接到2L的上述发酵培养基中。42℃静止发酵96小时。从0h(将种子液接种到发酵培养基中的一刻)开始，每隔6h，取发酵液，12000rpm离心10分钟后，取上清液测定如下参数：总还原糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度；计算糖酸转化率和D-乳酸光学纯度。实验设3个重复，结果取平均值。
结果如图3和表1所示，发酵到48h时还原糖基本消耗完毕，D-乳酸浓度为45.7g/L，糖酸转化率为92.8％，D-乳酸的光学纯度达到99％。这一结果表明，菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No.2185在以菊芋水解液为唯一碳源发酵生产D-乳酸中，显示出了非常好的工业应用前景。
表1分批发酵模式放大实验高效生产D-乳酸3次重复实验的结果
| 重复 | D-乳酸产量(g/L) | 糖酸转化率(％) | D-乳酸光学纯度(％) |
| 1 | 47.8 | 97.1 | 99.0 |
| 2 | 43.1 | 87.5 | 99.0 |
| 3 | 46.2 | 93.8 | 99.0 |
| 平均值±标准差 | 45.7±2.39 | 92.8±4.88 | 99.0±0.0 |
Claims (10)
1.一种发酵生产D-乳酸的方法，包括如下步骤：将菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）接种到以菊芋水解液作为唯一碳源的发酵培养基中进行发酵培养，得到D-乳酸；所述菊芋水解液中果糖和葡萄糖的质量比为（3-5）：1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述菊芋水解液中总还原糖在所述发酵培养基中的终浓度为46-55g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述果糖在所述发酵培养基中的终浓度为38-42g/L；所述葡萄糖在所述发酵培养基中的终浓度为8-12g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基由所述菊芋水解液、酵母粉和碳酸钙组成；所述菊芋水解液含有在所述发酵培养基中终浓度为49.25g/L的总还原糖，所述总还原糖为果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的质量比为（3-5）：1；所述酵母粉的终浓度为10g/L；所述碳酸钙的终浓度为30g/L；所述发酵培养基的pH为6.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为42℃；所述发酵培养的培养方式为静止培养；所述发酵培养的时间为40-96h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）为菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）CASD CGMCC No.2185。
7.菊芋水解液在发酵生产D-乳酸中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述菊芋水解液中果糖和葡萄糖的质量比为（3-5）：1。
9.发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基由菊芋水解液、酵母粉和碳酸钙组成；所述菊芋水解液中含有果糖和葡萄糖，所述果糖在所述发酵培养基中的终浓度为38-42g/L，所述葡萄糖在所述发酵培养基中的终浓度为8-12g/L；所述酵母粉在所述发酵培养基中的终浓度为10g/L；所述碳酸钙在所述发酵培养基中的终浓度为30g/L；所述发酵培养基的pH为6.5。
10.权利要求9所述培养基在发酵生产D-乳酸中的应用。
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