CN105925637A - 一种利用深海链霉菌SCSIO 5604制备抗生素dihydrotetrodecamycin的方法 - Google Patents

一种利用深海链霉菌SCSIO 5604制备抗生素dihydrotetrodecamycin的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用深海链霉菌SCSIO 5604制备抗生素dihydrotetrodecamycin的方法。所述的抗生素dihydrotetrodecamycin是从深海链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604的发酵培养物中分离得到的。本发明的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604能够产生对耐药细菌MRSA和水产病原菌具有抑制潜力的抗生素dihydrotetrodecamycin，这是首次从深海放线菌中发酵提取分离得到dihydrotetrodecamycin，为先导化合物提供了更多的制备源泉。

Description

一种利用深海链霉菌SCSIO 5604制备抗生素dihydrotetrodecamycin的方法
技术领域：
本发明属于生物领域，具体涉及一种利用深海链霉菌SCSIO 5604制备抗生素dihydrotetrodecamycin的方法。
背景技术：
Dihydrotetrodecamycin(式Ⅰ)是一类含有十氢萘环和不饱和呋喃内酯结构单元的聚酮类抗生素，最早由日本科学家分离自陆地链霉菌Streptomyces sp.MJ885-mF8，对耐药细菌methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)和水产病原菌Pasteurella piscicida具有潜在的抑制活(J.Antibiot.1994,47,386-388；J.Antibiot.1995,48,1330-1335；J.Antibiot.1995,48,1110-1114)。目前，关于该类化合物及其结构单位的化学合成技术先后被报道(Bioorg.Med.Chem.2003,11,2823-2833；Org.Lett.2005,7,4589-4592；2006,6,217-233)。寻找该类化合物有效的制备方法，对于以此化合物为基础，进行新型抗生素的开发具有重要作用。
发明内容：
本发明的目的是提供一种利用深海链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604制备抗生素dihydrotetrodecamycin的方法。
本发明的制备抗生素dihydrotetrodecamycin的方法，其特征在于，所述的抗生素dihydrotetrodecamycin是从深海链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604的发酵培养物中分离得到的。
具体优选步骤如下：
a、制备海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604的发酵培养物，离心得到发酵液和菌体；
b、发酵液用丁酮萃取，萃取液浓缩得发酵液浸膏；菌体用丙酮浸提，浸提液浓缩得菌体浸膏，发酵液浸膏和菌体浸膏合并得到总浸膏，总浸膏经正相硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为洗脱剂按照体积比100/0、98/2、96/4、94/6、92/8、90/10、80/20、50/50进行梯度洗脱，依次得到组分A1-A8；合并氯仿/甲醇体积比98/2、96/4、94/6洗脱的组分A2-A4，对该组分进行反相中亚层析分离，以乙腈/水为洗脱剂，从体积比10/90-80/20进行线性梯度洗脱，乙腈含量每增加10个体积比收集一个组分，共收集到7个组分B1-B7；将乙腈/水体积比30/70-50/50洗脱的组分B3-B4合并，再次用氯仿/甲醇进行正相硅胶色谱层析分离，按照体积比100/0、99.5/0.5、99/1、98.5/1.5、98/2、97.5/2.5、97/3、96.5/3.5、96/4进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比98.5/1.5洗脱的组分，将该组份重复用氯仿/甲醇进行正相硅胶色谱层析分离，按照体积比100/0、99.5/0.5、99/1、98.5/1.5、98/2、97.5/2.5、97/3、96.5/3.5、96/4进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比98.5/1.5洗脱的组分，即为抗生素dihydrotetrodecamycin。
所述的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604的发酵培养物优选通过以下方法制备：将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604接入种子培养基中，放入恒温摇床以28℃,200rpm,培养36h得种子发酵液，将种子发酵液转接放大发酵培养基中，然后放入恒温摇床以28℃，200rpm，培养7-8天，获得海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604的发酵培养物，所述放大发酵培养基和种子培养基均为MAM2ab培养基，其配方为：按质量分数100％计，包括大豆粉0.5％，淀粉0.5％，葡萄糖2％，蛋白胨0.2％，酵母粉0.2％，K2HPO4 0.05％，MgSO4·7H2O0.05％，粗海盐3％，碳酸钙0.2％，余量为水，pH 7.2-7.5。
本发明的第二个目的是提供海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604在制备抗生素dihydrotetrodecamycin中的应用。
本发明的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604能够产生对耐药细菌MRSA和水产病原菌具有抑制潜力的抗生素dihydrotetrodecamycin，这是首次从深海放线菌中发酵提取分离得到dihydrotetrodecamycin，为先导化合物提供了更多的制备源泉。
本发明提供了最佳成份和配比的种子培养基和发酵培养基，利用该培养基，按照本发明的培养条件和分离纯化工艺，可以得到最高产量的dihydrotetrodecamycin，从而可以生产足量的dihydrotetrodecamycin。
本发明的生产菌株海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604分离自南海北部东经E120°0.250、北纬N 20°22.971、-3536m深的海底沉积物，其公开于文献：唐桂岭、黄洪波、王博、田新朋、鞠建华、宋永相，南海深海链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 5604次级代谢产物lyngbyatoxin A的研究，天然产物研究与开发，2014，11(26),1767-1770页。该菌株本申请人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
附图说明：
图1是dihydrotetrodecamycin的1H NMR图谱；
图2是dihydrotetrodecamycin的13C NMR图谱；
图3是dihydrotetrodecamycin的晶体结构图；
图4是海洋链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 5604在MAM2ab发酵培养基发酵生产抗生素dihydrotetrodecamycin的HPLC图谱。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步的说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：抗生素dihydrotetrodecamycin的制备：
1、种子培养：
(1)MAM2ab种子培养基配制：按质量分数计，包括大豆粉0.5％，淀粉0.5％，葡萄糖2％，蛋白胨0.2％，酵母粉0.2％，K2HPO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，粗海盐3％，碳酸钙0.2％，余量为自来水，pH 7.2-7.5。将上述成分按其质量比例混合均匀，配置种子培养基4L，分装80个250mL三角瓶，每瓶装50mL，115℃灭菌30分钟；
(2)种子培养：将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604接入种子培养基中，置于恒温摇床28℃，200rpm，培养约36小时制得种子发酵液。
2、发酵培养：
(1)发酵培养基的配置
按照种子培养基的配方配置放大发酵培养基MAM2ab 16L，用1L的三角瓶每瓶装发酵液200mL，于115℃灭菌30分钟；
(2)发酵培养：
将种子发酵液接入灭菌后的放大发酵培养基中，每瓶放大发酵培养基转接一瓶已经培养好的种子发酵液，于恒温摇床于28℃，200rpm，培养7天后停止发酵，获得海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604的发酵培养物。
4、dihydrotetrodecamycin的检测与制备
用标准品做对照，发酵过程中以HPLC-DAD指纹图谱分析进行监测(图4)，在发酵的生产曲线拐点时停止发酵。
对获得的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604的发酵培养物，3600rpm离心10分钟，将菌体和发酵液分离，菌体用丙酮浸提三次，合并浸提液，减压浓缩(120mBar以下，40℃以下)得到菌体浸膏，发酵液用丁酮萃取三次，合并萃取液，减压浓缩(120mBar以下，40℃以下)得到发酵液浸膏，将菌体浸膏和发酵液浸膏后合并后，用100-200目正相硅胶进行拌样、干燥后，以干法装柱和上样，以氯仿/甲醇为洗脱剂，按照体积比100/0、98/2、96/4、94/6、92/8、90/10、80/20、50/50进行梯度洗脱过A柱，每个组分的洗脱体积为200mL，依次得组分A1-A8；合并组分A2-A4(即合并氯仿/甲醇体积比98/2、96/4、94/6洗脱的组分)，对该组分进行反相中亚层析(MPLC)分离，以乙腈/水为洗脱剂，从体积比10/90-80/20进行线性梯度洗脱过B柱，以10mL/min的流速洗脱，乙腈含量每增加10个体积比收集一个组分，共收集到7组分B1-B7；将组分B3-B4(乙腈/水体积比30/70-50/50洗脱的组分)合并，再次用氯仿/甲醇进行正相硅胶色谱层析分离过C柱，按照体积比100/0、99.5/0.5、99/1、98.5/1.5、98/2、97.5/2.5、97/3、96.5/3.5、96/4进行洗脱，每个极性洗脱体积为60mL，得组分C1-C27，收集氯仿/甲醇体积比98.5/1.5的组分，再用氯仿/甲醇重复C柱程序过D柱，按照体积比100/0、99.5/0.5、99/1、98.5/1.5、98/2、97.5/2.5、97/3、96.5/3.5、96/4进行洗脱，每个极性洗脱体积为60mL，收集氯仿/甲醇体积比98.5/1.5的组分，即得到化合物1(抗生素dihydrotetrodecamycin)。
化合物1的1H NMR图谱如图1所示，13C NMR图谱如图2所示，晶体结构图如图3所示。
经结构鉴定，鉴定化合物1为抗生素dihydrotetrodecamycin，其结构式如式(Ⅰ)所示

Claims (4)

1.一种制备抗生素dihydrotetrodecamycin的方法，其特征在于，所述的抗生素dihydrotetrodecamycin是从深海链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604的发酵培养物中分离得到的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：
a、制备海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604的发酵培养物，离心得到发酵液和菌体；
b、发酵液用丁酮萃取，萃取液浓缩得发酵液浸膏；菌体用丙酮浸提，浸提液浓缩得菌体浸膏，发酵液浸膏和菌体浸膏合并得到总浸膏，总浸膏经正相硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为洗脱剂按照体积比100/0、98/2、96/4、94/6、92/8、90/10、80/20、50/50进行梯度洗脱，依次得到组分A1-A8；合并氯仿/甲醇体积比98/2、96/4、94/6洗脱的组分A2-A4，对该组分进行反相中亚层析分离，以乙腈/水为洗脱剂，从体积比10/90-80/20进行线性梯度洗脱，乙腈含量每增加10个体积比收集一个组分，共收集到7个组分B1-B7；将乙腈/水体积比30/70-50/50洗脱的组分B3-B4合并，再次用氯仿/甲醇进行正相硅胶色谱层析分离，按照体积比100/0、99.5/0.5、99/1、98.5/1.5、98/2、97.5/2.5、97/3、96.5/3.5、96/4进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比98.5/1.5洗脱的组分，将该组份重复用氯仿/甲醇进行正相硅胶色谱层析分离，按照体积比100/0、99.5/0.5、99/1、98.5/1.5、98/2、97.5/2.5、97/3、96.5/3.5、96/4进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比98.5/1.5洗脱的组分，即为抗生素dihydrotetrodecamycin。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604的发酵培养物是通过以下方法制备的：将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604接入种子培养基中，放入恒温摇床以28℃,200rpm,培养36h得种子发酵液，将种子发酵液转接放大发酵培养基中，然后放入恒温摇床以28℃，200rpm，培养7-8天，获得海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604的发酵培养物，所述放大发酵培养基和种子培养基均为MAM2ab培养基，其配方为：按质量分数100％计，包括大豆粉0.5％，淀粉0.5％，葡萄糖2％，蛋白胨0.2％，酵母粉0.2％，K2HPO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，粗海盐3％，碳酸钙0.2％，余量为水，pH 7.2-7.5。
4.海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 5604在制备抗生素dihydrotetrodecamycin中的应用。
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