CN114230638A - 一种Aureobasidin A发酵液的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种Aureobasidin A发酵液的纯化方法。本发明提供的分离纯化技术工艺路线降低生产成本更具备产业化的可能同时能稳定获得高质量产品。
Description
技术领域
本发明涉及微生物制药技术领域，具体涉及一种Aureobasidin A发酵液的纯化方法。特别是适用于Aureobasidin A高产菌株CGMCC NO.20887发酵液的纯化。
背景技术
巴西芬净(Aureobasidin A，AbA)是一种由9个氨基酸分子组成的环脂肽类抗生素，最早在1991年由日本Kazutoh Takesako团队从黑酵母Aureobasidiumpullulans的培养液中分离获得。巴西芬净具有很强的抗真菌能力，对其敏感的真菌种类包括：出牙酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)和黑曲霉(A.niger.)。其作用机制是，巴西芬净抑制了真菌生长所依赖的肌醇磷酰胺(inositolphosphorylceramide，IPC)合成酶的活性，干扰鞘脂合成，从而进一步杀死菌株。并且，巴西芬净不会破坏DNA，RNA和蛋白质的合成。
分离纯化Aureobasidin A最早是由Kazutoh Tkaesako等于1991年在《TheJournal Of Antibiotics》发表的一篇名为《AUREOBASIDINS,NEW ANTIFUNGALANTIBIOTICS,TAXONOMY,FERMENTATION,ISOLATION,AND PROPERTIES》的文献中介绍了Aureobasidin A的发酵，纯化及其相关性质。其纯化方法主要包括：离心分离得到菌渣，乙醇浸提，浓缩后乙酸乙酯萃取，硅胶层析及液相制备分离得到各个组分，但是该方法不仅采用离心分离导致生产效率较低、增加生产成本，而且收率偏低。
Ahmed Abdel-Lateff等于2009年在《Natural Product Communications》发表了一篇名为《Aureobasidin,New Antifouling Metabolite from Marine-Derived FungusAureobasidium sp.》的文献介绍了题述菌株所产的一系列Aureobasidin化合物的性质及鉴定，也简单提到了他们所使用的分离纯化方法，即：离心分离得到菌渣，乙酸乙酯浸提，硅胶层析及半制备分离得到各个组分。但是该方法并不能稳定的获得高质量的成品。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种Aureobasidin A的纯化方法。具体地，上述方法包括如下步骤：
(1)溶剂浸提
(2)硅胶洗脱
(3)高压制备
(4)粗品结晶
具体的，上述步骤(1)包括：取产Aureobasidin A菌种发酵的得到的发酵液，通过过滤装置固液分离得到湿菌渣，烘干后得干菌渣。使用有机溶剂浸提所述的干菌渣，将所得的浸提液在一定温度下，减压真空浓缩至不再滴出液体，得浓缩液。
根据本发明的实施例，上述Aureobasidin A发酵液生产菌株为菌株CGMCCNO.20887。
根据本发明的实施例，步骤(1)中的烘干温度为30～60℃。
根据本发明的实施例，步骤(1)中浸提使用的有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、己烷，优选二氯甲烷、乙酸乙酯，更优选乙酸乙酯。
根据本发明的实施例，步骤(1)中减压真空浓缩的温度为20℃～50℃，优选30℃～50℃。
根据本发明的实施例，上述步骤(1)包括：接收32L发酵液，效价总亿43.9g；将发酵液用物料泵，泵入板框内进行过滤；过滤结束后，用自来水顶洗板框滤饼；顶洗结束后，用空气将滤饼吹干至无液体流出；气吹结束后，拆卸板框，收集板框滤饼并称重，得湿滤渣7.5kg；在50℃条件下烘干，即得干菌渣3.4kg。将所述的3.4kg干菌渣；使用乙酸乙酯13.6L浸提干菌渣，将所得的浸提液在40℃下，减压真空浓缩至不再滴出液体，得浓缩液。
具体地，上述步骤(2)包括：将步骤(1)所得的浓缩液用正己烷混匀上样于硅胶柱，上样结束后，以流动相洗脱至结束样单位低于10μg/mL，合并组分后浓缩至干，即得干组分。
根据本发明的实施例，上述步骤(2)使用的流动相为正己烷：异丙醇，二者体积比例选自2:1、3:1、4:1、5:1、6:1，优选3:1、4:1、5:1，更优选4:1。
根据本发明的实施例，上述步骤(2)包括：将步骤(1)所得的浓缩液用正己烷混匀按7g/L上样于正相硅胶柱(青岛邦凯100-200目硅胶)，上样结束后，再用正己烷以1BV/h流速平衡正相硅胶柱2BV；样品上柱后，再以正己烷：异丙醇(5L:1L)作为流动相以1BV/h流速洗脱至结束样单位低于10μg/mL，根据液相结果合并组分，浓缩至干，即得干组分。
具体地，上述步骤(3)包括：使用高压液相制备色谱仪进行分离，将步骤(2)获得的干组分上柱后再以流动相洗脱，根据液相结果合并色谱纯度＞98％的组分，即得Aureobasidin A粗品液；将所述的Aureobasidin A粗品液浓缩至白色固体析出，加入乙酸乙酯搅拌后静置分液，干燥脱水后过滤，取滤液；将上述滤液浓缩至干，即得AureobasidinA粗品。
根据本发明的实施例，上述步骤(3)液相制备色谱仪的制备柱为DAC50，填料柱为华谱C18。
根据本发明的实施例，上述步骤(3)中平衡柱子使用的流动相为乙腈：水，体积比例选自5:2、2:1、3:2、1:1、1:2，优选2:1、3:2、1:1，更优选3:2。
根据本发明的实施例，上述步骤(3)中洗脱使用的流动相为乙腈：水，体积比选自7:1、7:2、7:3、7:4、7:5、7:6，优选7:2、7:3、7:4，更优选7:3。
更具体地，上述步骤(3)包括：将步骤(2)得到的干组分使用液相制备色谱仪进行分离，其中制备柱为DAC50，填料柱为华谱C18；使用乙腈：水＝(6L:4L)平衡柱子2BV，再按4.7g/L上柱，最后使用乙腈：水＝(7L:3L)进行洗脱，根据液相结果合并色谱纯度＞98％的组分，即得Aureobasidin A粗品液；将得到的Aureobasidin A粗品液在40℃下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入乙酸乙酯3.3L后搅拌0.5小时，静置分液；加入无水硫酸镁脱水，搅拌、过滤得滤液；在40℃下，将上述滤液减压真空浓缩至干，得Aureobasidin A粗品；
具体地，上述步骤(4)包括：将步骤(3)得到的Aureobasidin A粗品加入有机溶剂溶解配制成结晶前液，缓慢滴加正己烷，析出晶体后过滤得到结晶湿品，将所述结晶湿品干燥后即得Aureobasidin A成品。
根据本发明的实施例，上述步骤(4)中使用的有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、己烷，优选二氯甲烷、乙酸乙酯，更优选乙酸乙酯
更具体地，上述步骤(4)包括：在40℃下，将步骤(3)得到的Aureobasidin A粗品加入乙酸乙酯溶解配制成0.3g/mL的结晶前液；缓慢滴加正己烷，析出晶体后过滤得到结晶湿品，采用40℃真空干燥6小时，得到Aureobasidin A成品。
本发明中所涉及的Aureobasidin A生产菌株CGMCC NO.20887，其为发明人经过筛选、突变得到的Aureobasidin A生产菌株，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，并已于2020年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为：CGMCC NO.20887，在本文中有时简称为菌株CGMCC NO.20887。
相对于现有技术，本发明的分离纯化技术工艺路线降低生产成本更具备产业化的可能同时能稳定获得高质量产品。在本发明提供的优选实施例中，获得的Aureobasidin A成品色谱纯度大于98.3％，且收率大于53.0％。在本发明最优选实施例中，获得的Aureobasidin A成品色谱纯度达到98.8％，且收率达到56.8％。
附图说明
图1为Aureobasidin A发酵液图谱
图2为实施例4的成品图谱
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
“菌苔”是指在菌种在固体培养基上由母细胞繁殖长成的一片密集的、具有一定形态结构特征的菌落，一般为大批菌落聚集而成。
“发酵液”是指液体培养基接入微生物菌种，经过一段时间培养后所得混合物，其中包含微生物菌体及其代谢产物、未利用的培养基成分(可能的话)等。
本发明所使用的Aureobasidin A发酵液为采用本申请人于2021年5月18日公开的公开号为CN112813122的发明专利申请中所述的方法制备。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例按以下步骤分离纯化：
步骤(1)：取产巴西芬净菌种发酵的得到的发酵液12L，效价总亿16.2g；通过板框过滤装置固液分离得到湿菌渣2.9kg，烘干后得干菌渣1.3kg；使用乙酸乙酯4.0L浸提干菌渣，将所得的浸提液在41℃下，减压真空浓缩至不再滴出液体，得浓缩液；
步骤(2)：将步骤(1)所得的浓缩液用正己烷混匀按7g/L上样于正相硅胶柱(青岛邦凯100-200目硅胶)；上样结束后，再用正己烷以1BV/h流速平衡正相硅胶柱2BV；样品上柱后，再以正己烷：异丙醇(3L:1L)作为流动相以1BV/h流速洗脱至结束样单位低于10μg/mL，根据液相结果合并组分，浓缩至干，得干组分；
步骤(3)：将步骤(2)得到的干组分使用液相制备色谱仪进行分离，其中制备柱为DAC50，填料柱为华谱C18；使用乙腈：水＝(6L:4L)平衡柱子2BV，再按0.8g/L上柱，最后使用乙腈：水＝(7L:3L)进行洗脱，根据液相结果合并色谱纯度＞98％的组分，即得Aureobasidin A粗品液；将得到的Aureobasidin A粗品液在41℃下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入乙酸乙酯1L后搅拌0.5小时，静置分液；加入无水硫酸镁脱水，搅拌、过滤得滤液；在41℃下，将上述滤液减压真空浓缩至干，得Aureobasidin A粗品；
步骤(4)：步骤(3)得到的Aureobasidin A粗品加入至35mL乙酸乙酯溶解配制成0.25g/mL的结晶前液，缓慢滴加正己烷，析出晶体后过滤得到结晶湿品，在41℃下将所述结晶湿品真空干燥6小时，即得Aureobasidin A成品。巴西芬净主峰色谱纯度＝98.3％，总收率53.4％。
实施例2
本实施例按以下步骤分离纯化：
步骤(1)：取产巴西芬净菌种发酵的得到的发酵液20L，效价总亿25.2g；通过板框过滤装置固液分离得到湿菌渣4.7kg，烘干得干菌渣2.2kg；使用乙酸乙酯9.0L浸提干菌渣，将所得的浸提液在42℃下，减压真空浓缩至不再滴出液体，得浓缩液；
步骤(2)：将步骤(1)所得的浓缩液用正己烷混匀按9g/L上样于正相硅胶柱(青岛邦凯100-200目硅胶)，上样结束后，再用正己烷以1BV/h流速平衡正相硅胶柱2BV；样品上柱后，再以正己烷：异丙醇(5L:1L)作为流动相以1BV/h流速洗脱至结束样单位低于10μg/mL，根据液相结果合并组分，浓缩至干，得干组分；
步骤(3)：将步骤(2)得到的干组分使用液相制备色谱仪进行分离，其中制备柱为DAC50，填料柱为华谱C18；使用乙腈：水＝(6L:4L)平衡柱子2BV，再按3.2g/L上柱，最后使用乙腈：水＝(8L:2L)进行洗脱，根据液相结果合并色谱纯度＞98％的组分，即得Aureobasidin A粗品液；将得到的Aureobasidin A粗品液在42℃下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入乙酸乙酯1.8L后搅拌0.5小时，静置分液；加入无水硫酸镁脱水，搅拌、过滤得滤液；在42℃下，将上述滤液减压真空浓缩至干，得Aureobasidin A粗品；
步骤(4)：步骤(3)得到的Aureobasidin A粗品加入至115mL乙酸乙酯溶解配制成0.12g/mL的结晶前液，缓慢滴加正己烷，析出晶体后过滤得到结晶湿品，在42℃下将所述结晶湿品真空干燥6小时，即得Aureobasidin A成品。巴西芬净主峰色谱纯度＝98.5％，总收率53.8％。
实施例3
本实施例按以下步骤分离纯化：
步骤(1)：取产巴西芬净菌种发酵的得到的发酵液26L，效价总亿35.0g；通过板框过滤装置固液分离得到湿菌渣5.5kg，烘干得干菌渣2.5kg；使用乙酸乙酯12L浸提干菌渣，将所得的浸提液在42℃下，减压真空浓缩至不再滴出液体，得浓缩液；
步骤(2)：将步骤(1)所得的浓缩液用正己烷混匀按8g/L上样于正相硅胶柱(青岛邦凯100-200目硅胶)，上样结束后，再用正己烷以1BV/h流速平衡正相硅胶柱2BV；样品上柱后，再以正己烷：异丙醇(6L:1L)作为流动相以1BV/h流速洗脱至结束样单位低于10μg/mL，根据液相结果合并组分，浓缩至干，得干组分；
步骤(3)：将步骤(2)得到的干组分使用液相制备色谱仪进行分离，其中制备柱为DAC50，填料柱为华谱C18；使用乙腈：水＝(6L:4L)平衡柱子2BV，再按4g/L上柱，最后使用乙腈：水＝(6L:4L)进行洗脱，根据液相结果合并色谱纯度＞98％的组分，即得AureobasidinA粗品液；将得到的Aureobasidin A粗品液在42℃下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入乙酸乙酯2.2L后搅拌0.5小时，静置分液；加入无水硫酸镁脱水，搅拌、过滤得滤液；在40℃下，将上述滤液减压真空浓缩至干，得Aureobasidin A粗品；
步骤(4)：步骤(3)得到的Aureobasidin A粗品加入至40mL乙酸乙酯溶解配制成0.43g/mL的结晶前液，缓慢滴加正己烷，析出晶体后过滤得到结晶湿品，在42℃下将所述结晶湿品真空干燥6小时，即得Aureobasidin A成品。巴西芬净主峰色谱纯度＝98.6％，总收率49.5％。
实施例4
本实施例按以下步骤分离纯化：
步骤(1)：取产巴西芬净菌种发酵的得到的发酵液32L，效价总亿43.9g；通过板框过滤装置固液分离得到湿菌渣7.5kg，烘干得干菌渣3.4kg；使用乙酸乙酯13.6L浸提干菌渣，将所得的浸提液在40℃下，减压真空浓缩至不再滴出液体，得浓缩液；
步骤(2)：将步骤(1)所得的浓缩液用正己烷混匀按7g/L上样于正相硅胶柱(青岛邦凯100-200目硅胶)，上样结束后，再用正己烷以1BV/h流速平衡正相硅胶柱2BV；样品上柱后，再以正己烷：异丙醇(5L:1L)作为流动相以1BV/h流速洗脱至结束样单位低于10μg/mL，根据液相结果合并组分，浓缩至干，得干组分；
步骤(3)：将步骤(2)得到的干组分使用液相制备色谱仪进行分离，其中制备柱为DAC50，填料柱为华谱C18；使用乙腈：水＝(6L:4L)平衡柱子2BV，再按4.7g/L上柱，最后使用乙腈：水＝(7L:3L)进行洗脱，根据液相结果合并色谱纯度＞98％的组分，即得Aureobasidin A粗品液；将得到的Aureobasidin A粗品液在40℃下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入乙酸乙酯3.3L后搅拌0.5小时，静置分液；加入无水硫酸镁脱水，搅拌、过滤得滤液；在40℃下，将上述滤液减压真空浓缩至干，得Aureobasidin A粗品；
步骤(4)：步骤(3)得到的Aureobasidin A粗品加入至65mL乙酸乙酯溶解配制成0.4g/mL的结晶前液，缓慢滴加正己烷，析出晶体后过滤得到结晶湿品，在40℃下将所述结晶湿品真空干燥6小时，即得Aureobasidin A成品。巴西芬净主峰色谱纯度＝98.8％，总收率56.8％。
实施例5
本实施例为采用文献《AUREOBASIDINS,NEW ANTIFUNGAL ANTIBIOTICS,TAXON-OMY,FERMENTATION,ISOLATION,AND PROPERTIES》描述的方法制备。
步骤(1)：将产巴西芬净菌种发酵得到的发酵液30L通过离心固液分离得到湿菌渣7kg，湿菌渣直接使用20L的乙醇直接对湿菌渣浸提，减压浓缩浸提液至不再滴出液体，得浓缩液；
步骤(2)：将步骤(1)所得的浓缩液使用12L乙酸乙酯萃取两次，静置分液得到有机相，将有机相减压浓缩至干后用55mL氯仿溶解，氯仿溶解液按7g/L上样于硅胶柱，使用2BV的正己烷以1BV/h流速预洗，再使用4BV的正己烷:异丙醇(7L:3L)的混合溶剂以1BV/h流速进行洗脱，合并洗脱液并减压浓缩至干，得干组分；
步骤(3)：将步骤(2)得到的干组分用乙腈溶解配制成高压制备上柱液使用液相制备色谱仪进行分离，其中制备柱为DAC50，填料柱为华谱C18；按照3g/L上柱，使用流动相乙腈：水＝(7L:3L)洗脱，根据制备图谱收集组分，液相检测各组分，合并纯度≥98％的组分，即得Aureobasidin A粗品液；将制备Aureobasidin A粗品液浓缩至白色固体析出后，在40℃温度下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入乙酸乙酯后搅拌0.5小时，静置分液；加入无水硫酸镁脱水、搅拌、过滤得滤液；在40℃温度下，将上述滤液减压真空浓缩至干，得Aureobasidin A粗品；
步骤(4)：步骤(3)得到的Aureobasidin A粗品加入60mL乙酸乙酯溶解配制成0.3g/mL的结晶前液，缓慢滴加正己烷，析出晶体后过滤得到结晶湿品，采用40℃真空干燥6小时，即得Aureobasidin A成品。巴西芬净主峰色谱纯度＝98.3％，总收率43.6％。
值得注意的是，该文献在完成步骤(3)得到Aureobasidin A粗品后并无步骤(4)，为说明本发明提供方法的优势增加步骤(4)结晶操作得到Aureobasidin A成品，并计算出纯度和收率，由此可以看出本发明提供的方法在保证纯度的同时能大幅提高收率。
Claims (9)
1.一种Aureobasidin A的纯化方法，其包括如下步骤：
(1)溶剂浸提：对由产Aureobasidin A菌种发酵得到的发酵液过滤得到湿菌渣，将所述湿菌渣使用有机溶剂浸提后，减压真空浓缩至不再滴出液体，得浓缩液；
(2)硅胶洗脱：将步骤(1)的浓缩液上样于硅胶柱，以流动相洗脱至结束，合并组分后经浓缩得到干组分；
(3)高压制备：使用高压液相制备色谱仪进行分离，且经过浓缩得Aureobasidin A粗品；
(4)粗品结晶：对Aureobasidin A粗品进行溶解、析出、干燥得到Aureobasidin A成品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：取产Aureobasidin A菌种发酵得到的发酵液，通过过滤装置固液分离得到湿菌渣，烘干后得干菌渣；使用有机溶剂浸提所述的干菌渣，将所得的浸提液在一定温度下，减压真空浓缩至不再滴出液体，得浓缩液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，浸提使用的有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、己烷，优选二氯甲烷、乙酸乙酯，更优选乙酸乙酯；减压真空浓缩的温度为20℃～50℃，优选30℃～50℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：将步骤(1)所得的浓缩液用正己烷混匀上样于硅胶柱，上样结束后，以流动相洗脱至结束样单位低于10μg/mL，合并组分后浓缩至干。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的流动相为正己烷：异丙醇，其体积比选自3:1～6:1，优选3:1～5:1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：使用高压液相制备色谱仪进行分离，将步骤(2)获得的干组分上柱后再以流动相洗脱，根据液相结果合并组分，即得Aureobasidin A粗品液；将所述的Aureobasidin A粗品液浓缩至白色固体析出，加入乙酸乙酯搅拌后静置分液，干燥脱水后过滤，取滤液；将上述滤液浓缩至干，即得AureobasidinA粗品。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，洗脱使用的流动相为乙腈：水，其体积比选自5:5、6:4、7:3、8:2，优选7:3、8:2。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)包括：将步骤(3)得到的Aureobasidin A粗品加入乙酸乙酯溶解配制成结晶前液，缓慢滴加正己烷，析出晶体后过滤得到结晶湿品，将所述结晶湿品干燥后即得Aureobasidin A成品。
9.如权利要求1～8之一所述的方法，其特征在于，所得的Aureobasidin A成品总收率在49.5％以上，纯度在98.3％以上。
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