EP2321335A1 - Verfahren zur aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen oligopeptiden - Google Patents

Verfahren zur aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen oligopeptiden

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Publication number
EP2321335A1
EP2321335A1 EP09781252A EP09781252A EP2321335A1 EP 2321335 A1 EP2321335 A1 EP 2321335A1 EP 09781252 A EP09781252 A EP 09781252A EP 09781252 A EP09781252 A EP 09781252A EP 2321335 A1 EP2321335 A1 EP 2321335A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cyclosporin
ether
weight
butyl ether
extractant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09781252A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stephan Bertel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sandoz AG
Original Assignee
Sandoz AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sandoz AG filed Critical Sandoz AG
Priority to EP09781252A priority Critical patent/EP2321335A1/de
Publication of EP2321335A1 publication Critical patent/EP2321335A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides

Definitions

  • the present invention relates to processes for the processing of microbiologically produced, nonpolar, cyclic oligopeptides comprising the step a) extraction of the resulting in the microbiological production total fermentation pulp with a liquid, water-immiscible, ether-containing extractant, wherein the amount of extractant is sufficient to to form a two-phase system with the whole fermentation pulp, as well as new solvates of cyclosporin A and methyl t-butyl ether.
  • Cyclic oligopeptides in particular undecapeptides have long been u. a. known as microbiological metabolites. Of the undecapeptides cyclosporins in particular have gained importance.
  • Cyclosporins in particular cyclosporin A, are in fact valuable pharmaceutical active substances which can be used as immunosuppressants, in particular in organ transplants.
  • cyclosporins are suitable for the treatment of diseases such. As diabetes and psoriasis, and numerous autoimmune diseases such. Rheumatoid arthritis and chronic inflammation.
  • Cyclosporins, in particular cyclosporin A are also suitable for controlling diseases caused as a result of their inhibitory action against the human immunodeficiency virus (HIV).
  • HAV human immunodeficiency virus
  • a pharmacological effect of cyclosporins, in particular cyclosporin A for the sensitization of cancer cells to chemotherapeutic agents such.
  • B Vincistin or Daunorubicin be detected.
  • the neuroprotective or regenerative properties of cyclosporins, in particular cyclosporin A in various neurological indications such. As Alzheimer's, amyotrophic lateral sclerosis or Parkinson's
  • cyclic undecapeptides such as cyclosporins
  • cyclosporin A can be produced by means of a strain of the fungus species Cylindrocarpon lucidum Booth or a strain of the fungus species Tolypocladium inflatum Garns.
  • This strain of the fungus species Tolypocladium was originally referred to as a strain of the fungal species Trichoderma polysporum, which was deposited with the United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, IL, USA under the number NRRL 8044.
  • strains for the microbiological production of cyclosporins are strains of the fungus species Tolypocladium geodes, Tolypocladium cylindrosporum and Tolypocladium sp. LeA3, the latter being deposited under the Budapest Treaty at the Custodian of the Central Bureau of Meat Cultures in Holland under number CBS 630.92.
  • DOS 2455859 or DD-B-298276 known methods for the isolation of cyclosporins, in particular cyclosporin A, from the total fermentation pulp, d. H. from the culture broth, either the biomass with product can be separated from the culture broth by filtration or centrifugation or the whole fermentation broth, i. H. without separation of the biomass, be worked up.
  • the separated biomass is subjected to the metabolic products of a preferably repeated extraction with methanol or acetone and the separated extract is preferably concentrated to an aqueous residue to z. With ethylene chloride or chloroform, preferably to be extracted several times.
  • the culture filtrate separated from the biomass is preferably likewise extracted accordingly.
  • the culture broth i. H. the total fermentation porridge, u. a. extracted with the abovementioned solvents, ethylene chloride or chloroform and the separated organic phase after concentration several times at different, stationary column fillings with different eluents for further work-up.
  • Sephadex LH-20 as a stationary column material with methanol as the eluent or alumina as a column material with toluene / ethyl acetate as the eluent in question.
  • a corresponding chromatographic work-up can also be carried out in the first-mentioned work-up variant, wherein the residue obtained from the ethylene chloride or chloroform extracts using the column material silica gel in combination with the eluent chloroform and the column material Sephadex LH-20 in combination with the eluent purified methanol and in the desired products, preferably cyclosporin A, further separated.
  • the object was to provide technologically advantageous, environmentally compatible and efficient work-up procedures for microbiologically produced, cyclic oligopeptides, in particular undecapeptides such as cyclosporins, with a very good exploitation and purity of the products.
  • the task was to reduce the number of organic solvents used and to achieve their recyclability, so u. a. to make the reprocessing process ecologically more efficient.
  • This object is achieved by providing the method according to the invention for the processing of microbiologically produced, nonpolar, cyclic oligopeptides, comprising the step a) extraction of the resulting in the microbiological production total fermentation broth with a liquid, water-immiscible, ether-containing extractant, wherein the Extract of the extractant is sufficient to form a two-phase system with the total fermentation pulp.
  • microbiologically prepared, non-polar, cyclic oligopeptides having preferably 5 to 15 peptide bonds can be worked up.
  • oligopeptide according to the invention is to be understood as an organic compound comprising a certain number of peptide bonds, wherein only two consecutive nitrogen atoms of the ring system are preferably separated by two intervening carbon atoms.
  • nonpolar, cyclic oligopeptides of 8 to 13 amino acids, particularly preferably undecapeptides can be isolated with the aid of the workup process according to the invention. This process is very particularly preferably suitable for working up the microbiologically produced, nonpolar undecapeptides, such as cyclosporins, very particularly preferably cyclosporin A.
  • non-polar cyclic oligopeptides in particular undecapeptides as cyclosporins are to be understood according to the invention, which, as lipophilic compounds have a water solubility of ⁇ 0.1 g / l of water at 25 0 C.
  • the desired products can be obtained by extraction.
  • the total fermentation broth is mixed with a liquid, water-immiscible, ether-containing extractant, wherein the amount of the extractant is sufficient to form a two-phase system with the total fermentation pulp.
  • Particles from the fermentation process in the aforementioned system are present, which are present in the aqueous phase.
  • a liquid extractant immiscible with water is understood to mean an extractant which has at least one miscibility gap at 20 ° C. with water at which the liquid extractant is at least incompletely miscible or incompletely soluble with the water such that a phase separation occurs.
  • ether-containing, water-immiscible extractants used according to the invention preferably have a density of at most 0.9 g / cm 3 , preferably a density of from 0.6 to 0.85 g / cm 3 , particularly preferably from 0.7 to 0.8 g / cm 3 , each measured at 20 0 C, on.
  • the ether-containing extractant consists essentially of one or more ethers, most preferably at least one ether of the general formula
  • R 1 and R 2 independently of one another, is a linear or branched alkyl radical having Ci to C 5 and at least one of the radicals Ri and R 2 has at least 3 C-atoms, preferably at least 4 C-atoms.
  • Particularly preferred ethers which can be used for the extraction, at least one ether selected from the group comprising di-isopropyl ether, di-n-propyl ether, di-t-butyl ether, di-iso-butyl ether, methyl t-butyl ether, ethyl t-butyl ether, propyl t-butyl ether and n-butyl t-butyl ether, with the use of methyl t-butyl ether being particularly preferred.
  • Another object of the present invention is therefore also the use of liquid, water-immiscible, ether-containing extractant, preferably having a density of at most 0.9 g / cm 3 , measured at 20 0 C, as a means for extraction of microbiologically produced, nonpolar cyclic oligopeptides, preferably undecapeptides, more preferably cyclosporins, most preferably cyclosporin A from the total fermentation broth obtained in the microbiological production.
  • the ethers listed above preferably come in such quantities used to form a 2-phase system with the total fermentation pulp.
  • the extraction of the total fermentation broth in particular in the isolation and workup of cyclosporins, more preferably cyclosporin A, at a pH of 7 to 9, preferably 7.5 to 8.5.
  • water-soluble wetting agents e.g. Polyacrylate-based
  • water-soluble wetting agents e.g. Polyacrylate-based
  • the extraction is carried out several times. Most preferably, the total extraction pulp is extracted twice with the ethereal extractant.
  • the extraction of the total fermentation paste is preferably carried out with the ether-containing, water-immiscible extractant at room temperature, more preferably at 20 to 30 0 C.
  • the extraction of the total fermentation pulp can be carried out in customary apparatuses, the extracts obtained during the extraction being combined after separation of the aqueous phase with the biomass for further work-up.
  • the process step a) is followed by a further process step b) according to which the residual water content present in the extract is reduced to less than 1% by weight, preferably to less than 0.3% by weight.
  • the extract is preferably washed with an aqueous solution, preferably with water, in order to remove any residues of biomass which may be present.
  • an azeotropic distillation can be carried out. Not only is the residual water content reduced to the desired level in the extract, but also the concentration of the microbiologically produced products, preferably the cyclosporins, particularly preferably the cyclosporin A, is increased.
  • a Cyclosporingehalt is preferably adjusted from 10 to 35 wt.%.
  • the azeotropic distillation in step b) makes it possible not only to adjust the residual water content in the extract to the desired, low water content, but also to set a concentration of the extract which is advantageous for the subsequent crystallization of the worked-up product, the product preferably being used as cyclosporin ether. Solvate is crystallized.
  • the inventive method for working up of microbiologically produced products preferably cyclosporins, more preferably cyclosporin A, a further step c), according to the concentrated in step b), the residual water content largely freed extract by cooling to temperatures of -10 0 C. to 15 0 C, preferably to temperatures of -5 0 C to 10 0 C, for crystallization as an ether solvate product, preferably cyclosporin ether solvate is cooled.
  • the crystals preferably the cyclosporin ether solvate crystals, may be washed with an organic solvent in which the crystals dissolve only slowly, for further purification.
  • the cyclosporin ether solvate crystals can be separated by known chromatographic purification and crystallization in suitable known solvents in the cyclosporins A-Z (see also WO97 / 46575, EP0725076, EP0888382).
  • Another object of the present invention is the use of crystalline cyclosporin ether solvates in the industrial scale Production of Cyclosporines, preferably Cyclosporin A.
  • Cyclosporines preferably Cyclosporin A.
  • the crystalline cyclosporin-ether-solvate crystals obtained according to the invention are suitable.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention is a process for working up microbiologically produced non-polar cyclosporins, preferably cyclosporin A, comprising the steps of a) extraction of the total fermentation pulp obtained in the microbiological production of cyclosporines with a liquid, water-immiscible ether-containing Extracting agent, wherein the amount of the extractant is sufficient to form a two-phase system with the total fermentation pulp, b) reducing the residual water content dissolved in the extract to less than
  • step a) may optionally be washed with an aqueous solution prior to this lowering of the residual water content, and c) crystallizing the cyclosporins as cyclosporin ether Solvates, wherein preferably before the crystallization of the extract obtained in step b) to a Cyclosporingehalt of 10 to 25 wt.%, Based on the total extract, and for crystallization of the concentrated extract to temperatures of -10 0 C to 15 0 C, preferably -5 0 C to 10 0 C, is cooled.
  • reaction conditions for the individual process steps likewise apply to the workup of nonpolar cyclosporins which has been preferred according to the invention and which have been prepared microbiologically, in particular for the workup and isolation of cyclosporin A.
  • ether-containing extraction agent used preferably ethers of the general formula given above.
  • crystals are also particularly suitable for being separated into the cyclosporins A-Z by further recrystallization in a known manner and / or by chromatographic work-up with known columnar materials in combination with known, suitable eluents.
  • cyclosporin A with a content of less than 0.05% by weight of isocyclosporin A, preferably with a content of 0.04 to 0.05% by weight of isocyclosporin A.
  • the cyclosporin A which is obtainable by the work-up method according to the invention, is also distinguished by a lower content of cyclosporin H and cyclosporin T.
  • Another object of the present invention is therefore also cyclosporin A, wherein the total content of cyclosporin H and cyclosporin T less than 0.5 wt.%, Preferably from 0.1 to 0.4 wt.% Is.
  • cyclosporin A having a content of 0.04 to 0.005 wt.% Isocyclosporin A, wherein the additional total content of cyclosporin H and cyclosporin T from 0.01 to 4 wt.% Is.
  • This cyclosporin A with the low contents of by-products is preferably obtainable by the work-up and further treatment of cyclosporin A-methyl-t-butyl-ether-solvate crystals obtained according to the invention.
  • the cyclosporin ether solvate crystals not only with an excellent purity and with yields of more than 90%, preferably> 95%, with the aid of the preferred work-up method of nonpolar, microbiologically produced cyclosporines according to the invention, but also with a very good handling of the crystals, since at least 90% of the crystals have a crystal size> 10 microns and the median particle size distribution is about 60 microns.
  • 3 ⁇ 1 g of the sample were dispersed in 60 ml of water and measured after addition of the dispersing unit Hydro 2000S at a stirring speed of 2000 rpm using the "Mastersizer 2000" measuring instrument from Malvern. used by the device manufacturer. The above values are average values over 3 such measurements.
  • Another object of the present invention is therefore crystalline cyclosporin A-methyl-t-butyl ether solvate, of which at least 90% of the crystals have a crystal size> 10 microns, preferably the median size distribution is between 30 .mu.m and 100 .mu.m, preferably between 40 .mu.m and 80 .mu.m.
  • the process according to the invention is particularly suitable for working up microbiologically produced cyclosporin A as crystalline cyclosporin A-methyl-t-butyl ether solvate.
  • Such crystals could be clearly determined by means of X-ray powder diffractograms.
  • X-ray powder diffractograms were obtained on an AXS Bruker X-ray powder diffractometer D-8 using the following environmental sampling parameters: tube anode: Cu; Generator voltage: 4OkV; Generator current: 40 mA; Initial angle: 2 ° 2-theta; Final angle: 40 ° 2-theta; Step size: 0.01 ° 2-theta; Time per step: 2 seconds.
  • the typical accuracy of the 2-theta values is in the range of ⁇ 0.1 ° 2-theta. Therefore, a diffraction peak (vertex) recorded at 5.0 ° 2-theta may appear between 4.9 and 5.1 ° 2-theta on most X-ray diffractometers at standard conditions.
  • Another object of the present invention is therefore crystalline cyclosporin A-methyl-t-butyl ether solvate containing an X-ray powder diffractogram comprising peaks at 2 theta angles of 7.0 ° +/- 0.1 °, 8.2 ° + / - 0.1 °, 11, 0 ° +/- 0.1 ° and 20.5 ° +/- 0.1 °, in particular additionally comprising vertices at 2 theta angles of 7.3 ° +/- 0, 1 M 1, 8 ° +/- 0.1 M 3.3 ° +/- 0.1 ° and 16.5 ° +/- 0.1 °.
  • the invention also relates to the following items:
  • a process for the processing of microbiologically produced, non-polar, cyclic oligopeptides comprising the step a) extraction of the resulting in microbiological production total fermentation pulp with a liquid, water-immiscible at 25 0 C, ether-containing extractant, wherein the amount of the extractant sufficient to form a two-phase system with the total fermentation pulp.
  • step b) is carried out by azeotropic distillation.
  • step b) A method according to item 5 or 6, wherein the extract obtained in step a) is washed with an aqueous solution prior to further processing in step b).
  • Ri and R 2 independently of one another, is a linear or branched alkyl radical having Ci to C 5 and at least one of the radicals Ri or R 2 has at least 3 C-atoms, preferably at least 4 C-atoms.
  • at least one ether selected from the group consisting of di-isopropyl ether, di-n-propyl ether, di-t-butyl ether, diisobutyl ether, methyl t-butyl ether, ethyl t- butyl ether, propyl t-butyl ether and n-butyl t-butyl ether is used.
  • step c) the concentrated extract to a temperature of -10 0 C to 15 ° C is cooled.
  • step c) cyclosporin ether solvate crystals with organic solvents in which the cyclosporin ether solvate crystals dissolve only slowly, are washed.
  • a method according to any one of items 1 to 16 characterized in that the extraction with the ether-containing extractant at room temperature, preferably at 20 to 30 0 C, is performed. 18.
  • Cyclosporin A with a content of less than 0.05% by weight of isocyclosporin A, preferably with a content of 0.04-0.005% by weight of isocyclosporin A.
  • Cyclosporin A wherein the total content of cyclosporin H and cyclosporin T is less than 0.5% by weight, preferably from 0.1 to 0.4% by weight.
  • Cyclosporin A with a content of 0.04-0.005% by weight of isocyclosporin A, the additional total content of cyclosporin H and cyclosporin T being from 0.1-0.4% by weight.
  • FIG. 1 X-ray powder diffractogram of crystalline cyclosporin A-methyl-t-butyl ether solvate
  • FIG. 2 Infrared spectrum of crystalline cyclosporin A-methyl-t-butyl ether solvate
  • cyclosporin A-containing fermentation broth as can be obtained, for example, by fermentation of Tolypocladium inflatum, were extracted twice with 2000 ml of methyl tert-butyl ether (MTBE) in the presence of 4000 ppm of the polyacrylate Clahant MD07 / 049.
  • the ether phases were separated in a separatory funnel and combined.
  • the cyclosporin A-containing ether phase was washed once with 200 ml of water having a pH of about 7 in the separating funnel and the ether phase was concentrated after filtration by azeotropic distillation at a temperature of about 53 ° C, so that a cyclosporin concentration of 150g / kg was reached.
  • the temperature was then lowered to a value just below the boiling point and kept at this temperature for 2 hours, with fresh MTBE being discharged through the distillation head. Thereafter, the solution was concentrated under normal pressure at 53 ° C, so that a cyclosporin concentration of 300 g / kg was achieved.
  • the residual water content which before the azeotropic distillation was about 1.4% by weight, was now below 0.1% by weight.
  • the solution was carefully cooled, in 120 minutes from 53 ° C to 45 ° C, in another 60 minutes at 40 0 C, in another 60 minutes at 30 0 C and in another 60 minutes at 0 ° C.
  • White, crystalline cyclosporin A - MTBE solvate was obtained in a total theoretical yield of about 82%.
  • FIG. 2 An infrared spectrum of the crystals obtained is shown in FIG. 2, a powder X-ray diffractogram (XRPD) of the resulting crystals is shown in FIG.
  • the evaluation at the interference microscope showed highly crystalline material with large, birefringent crystals, with an average particle size of about 65 ⁇ m.
  • Example 2 Large-scale extraction of cyclosporin A from fermentation broth
  • 510kg of cyclosporin A-containing fermentation broth were extracted twice with 510 l each of methyl tert-butyl ether (MTBE), to which was added 2.6kg of the polyacrylate Clariant MD07 / 049.
  • the ether phases were separated in a 3001 separator in the run and combined.
  • the cyclosporin A-containing ether phase was washed once with 700 l of pure water having a pH of about 7, the phases were separated again in the separator and the ether phase was concentrated by azeotropic distillation in a 10001 thin-film evaporator at a temperature of about 53 ° C, so a cyclosporin concentration of 100 g / kg was reached.
  • the temperature was then lowered to a value just below the boiling point and kept at this temperature for 2 hours, with fresh MTBE being discharged through the distillation head. Thereafter, the solution was concentrated under normal pressure at 53 ° C, so that a cyclosporin concentration of 300 g / kg was reached.
  • the residual water content which before the azeotropic distillation was about 1.4% by weight, was now below 0.1% by weight.
  • the solution was then carefully cooled, in 120 minutes from 53 ° C to 45 ° C, in another 60 minutes at 40 0 C, in another 60 minutes at 30 0 C and in another 60 minutes at 0 ° C. 8.55 kg of white, crystalline cyclosporin A-MTBE solvate were obtained in a total theoretical yield of about 87%.
  • the content of isocyclosporin A was 0.008% by weight, the total content of cyclosporin H and cyclosporin T was 0.28% by weight, which meant a highly significant reduction in the content of these impurities as compared to a butyl acetate extraction process.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten, unpolaren, zyklischen Oligopeptiden umfassend den Schritt a) Extraktion des bei der mikrobiologischen Herstellung anfallenden Gesamt-Fermentationsbreis mit einem flüssigen, mit Wasser nicht mischbaren, etherhaltigen Extraktionsmittel, wobei die Menge des Extraktionsmittels ausreicht, um mit dem Gesamt-Fermentationsbrei ein Zwei-Phasen System zu bilden, sowie neue Solvate aus Cyclosporin A und Methyl-t-butylether.

Description

Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen
Oligopeptiden
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten, unpolaren, zyklischen Oligopeptiden umfassend den Schritt a) Extraktion des bei der mikrobiologischen Herstellung anfallenden Gesamt- Fermentationsbreis mit einem flüssigen, mit Wasser nicht mischbaren, etherhaltigen Extraktionsmittel, wobei die Menge des Extraktionsmittels ausreicht, um mit dem Gesamt-Fermentationsbrei ein Zwei-Phasen System zu bilden, sowie neue Solvate aus Cyclosporin A und Methyl-t-butylether.
Zyklische Oligopeptide, insbesondere Undekapeptide sind seit langem u. a. als mikrobiologische Stoffwechselprodukte bekannt. Von den Undekapeptiden haben insbesondere Cyclosporine Bedeutung erlangt.
Cyclosporine, insbesondere Cyclosporin A, sind nämlich wertvolle, pharmazeutische Wirkstoffe, die als Immunosuppressiva, insbesondere bei Organtransplantationen eingesetzt werden können. Darüber hinaus eignen sich Cyclosporine zur Behandlung von Erkrankungen, wie z. B. Diabetes und Psoriasis, sowie zahlreichen Autoimmunerkrankungen, wie z. B. rheumatischer Arthritis und chronischen Entzündungen. Cyclosporine, insbesondere Cyclosporin A, eignen sich auch aufgrund ihrer Hemmwirkung gegen das Humane-Immundefizienz-Virus (HIV) zur Bekämpfung von dadurch verursachten Erkrankungen. Außerdem konnte eine pharmakologische Wirkung von Cyclosporinen, insbesondere Cyclosporin A, zur Sensibilisierung von Krebszellen gegenüber Chemotherapeutika wie z. B Vincistin oder Daunorubicin festgestellt werden. Weiterhin können die neuroprotektiven bzw. regenerativen Eigenschaften von Cyclosporinen, insbesondere Cyclosporin A, bei verschiedenen neurologischen Indikationen, wie z. B. Alzheimer, Amyotropher Lateralsclerose oder Parkinson, eingesetzt werden.
Wie bereits erwähnt, können zyklische Undekapeptide, wie Cyclosporine, durch mikrobiologische Prozesse hergestellt werden. Insbesondere kann Cyclosporin A mit Hilfe eines Stammes der Pilzspezies Cylindrocarpon lucidum Booth bzw. eines Stammes der Pilzspezies Tolypocladium inflatum Garns produziert werden. Dieser Stamm der Pilzspezies Tolypocladium wurde ursprünglich als ein Stamm der Pilzspezies Trichoderma polysporum bezeichnet, der beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, IL, USA unter der Nummer NRRL 8044, deponiert wurde. Der erstgenannte Stamm der Pilzspezies Cylindrocarpon lucidum Booth wurde ebenfalls beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, IL, USA unter der Nr. NRRL 5760 deponiert. Weitere Stämme zur mikrobiologischen Herstellung von Cyclosporinen, insbesondere Cyclosporin A, sind Stämme der Pilzspezies Tolypocladium geodes, Tolypocladium cylindrosporum und Tolypocladium sp. LeA3, wobei der letztgenannte Stamm gemäß dem Budapester Abkommen in der Depotstelle des Zentralbüros für Schimmelkulturen in Holland unter der Nummer CBS 630.92 deponiert ist.
Die großtechnische Herstellung von Cyclosporinen durch mikrobiologische Prozesse ist von großer Bedeutung. Aus diesem Grund hat es auch nicht an Versuchen gefehlt, die mikrobiologische Herstellung durch Auffindung und Züchtung effizienter Stämme der genannten Pilzspezia oder neuer Pilzspezia zu verbessern. Die vorstehend genannten Stämme sind Beispiele für diese Bemühungen.
Bei einer großtechnischen, mikrobiologischen Herstellung von Cyclosporinen ist aber nicht nur ein effektiver Fermentationsprozess wichtig, sondern auch eine effektive Aufarbeitung der damit gewonnenen Stoffwechselprodukten.
Gemäß den aus z. B. DOS 2455859 bzw. DD-B-298276 bekannten Verfahren zur Isolierung von Cyclosporinen, insbesondere von Cyclosporin A, aus dem Gesamt- Fermentationsbrei, d. h. aus der Kulturbrühe, kann entweder die Biomasse mit Produkt von der Kulturflüssigkeit durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt oder der Gesamt-Fermentationsbrei, d. h. ohne Abtrennung der Biomasse, aufgearbeitet werden.
Gemäß der ersten Verfahrensvariante wird die abgetrennte Biomasse mit den Stoffwechselprodukten einer vorzugsweise mehrmaligen Extraktion mit Methanol oder Aceton unterworfen und der abgetrennte Extrakt vorzugsweise bis zu einem wässrigen Rückstand eingeengt, um z. B. mit Ethylenchlorid oder Chloroform, vorzugsweise mehrmals extrahiert zu werden. Das von der Biomasse abgetrennte Kulturfiltrat wird vorzugsweise ebenfalls entsprechend extrahiert.
Gemäß der zweiten Verfahrensvariante, bei der die Biomasse nicht abgetrennt wird, wird die Kulturbrühe, d. h. der Gesamt-Fermentationsbrei, u. a. mit den vorstehend genannten Lösungsmitteln Ethylenchlorid oder Chloroform extrahiert und die abgetrennte, organische Phase nach Einengung mehrmals an unterschiedlichen, stationären Säulenfüllungen mit unterschiedlichen Elutionsmitteln zur weiteren Aufarbeitung chromatographiert. Dabei kommen Sephadex LH-20 als stationäres Säulenmaterial mit Methanol als Elutionsmittel bzw. Aluminiumoxid als Säulenmaterial mit Toluol/Ethylacetat als Elutionsmittel in Frage.
Eine entsprechende chromatographische Aufarbeitung kann auch bei der erstgenannten Aufarbeitungsvariante erfolgen, wobei der aus den Ethylenchlorid- oder Chloroform- Extrakten gewonnene Rückstand mit Hilfe des Säulenmaterials Kieselgel in Kombination mit dem Elutionsmittel Chloroform und des Säulenmaterials Sephadex LH-20 in Kombination mit dem Elutionsmittel Methanol gereinigt und in die gewünschten Produkte, vorzugsweise Cyclosporin A, weiter aufgetrennt wird.
Gegenüber diesen vorbekannten Aufarbeitungsverfahren bestand die Aufgabe, technologisch vorteilhafte, umweltverträgliche und effiziente Aufarbeitungsverfahren für mikrobiologisch produzierte, zyklische Oligopeptide, insbesondere Undekapeptide wie Cyclosporine, mit einer sehr guten Ausbeutung und Reinheit der Produkte zur Verfügung zu stellen. Insbesondere bestand die Aufgabe daran, die Zahl der zum Einsatz kommenden organischen Lösungsmittel zu vermindern sowie deren Recyclierbarkeit zu erreichen, um so u. a. das Aufarbeitungsverfahren ökologisch effizienter zu gestalten.
Diese Aufgabe wird durch das Zurverfügungstellen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten, unpolaren, zyklischen Oligopeptiden gelöst, umfassend den Schritt a) Extraktion des bei der mikrobiologischen Herstellung anfallenden Gesamt- Fermentationsbreis mit einem flüssigen, mit Wasser nicht mischbaren, etherhaltigen Extraktionsmittel, wobei die Menge des Extraktionsmittels ausreicht, um mit dem Gesamt-Fermentationsbrei ein Zwei-Phasen System zu bilden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können mikrobiologisch hergestellte, unpolare, zyklische Oligopeptide mit vorzugsweise 5 bis 15 Peptidbindungen aufgearbeitet werden. Der Begriff Oligopeptid ist erfindungsgemäß als organische Verbindung umfassend eine bestimmte Anzahl von Peptidbindungen zu verstehen, wobei lediglich vorzugsweise zwei aufeinander folgende Stickstoffatome des Ringsystems durch zwei dazwischen liegende Kohlenstoffatome getrennt sind. Bevorzugt können unpolare, zyklische Oligopeptide aus 8 bis 13 Aminosäuren, besonders bevorzugt Undekapeptide, mit Hilfe des erfindungsgemäßen Aufarbeitungsverfahrens isoliert werden. Dieses Verfahren eignet sich ganz besonders bevorzugt zur Aufarbeitung der mikrobiologisch hergestellten, unpolaren Undekapeptiden wie Cyclosporinen, ganz besonders bevorzugt Cyclosporin A.
Als unpolar sind erfindungsgemäß solche zyklische Oligopeptide, insbesondere Undekapeptide wie Cyclosporine zu verstehen, die als lipophile Verbindungen eine Wasserlöslichkeit von < 0,1 g/l Wasser bei 25 0C aufweisen.
Die mikrobiologische Herstellung der genannten Produkte mit Hilfe der vorstehend genannten Stämme bestimmter Pilzspezies sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Bereits in der deutschen Offenlegungsschrift 2455859 wird nicht nur die Kultivierung der Pilzstämme NRRL 5760 bzw. NRRL 8044 auf den Seiten 3-4 offenbart, sondern es geht auch der Fermentationsprozess zur Herstellung von Cyclosporinen aus den Seiten 4-5 bzw. aus Beispiel 1 hervor.
Dies gilt auch für die Kultivierung des Stamms Tolypocladium sp.LeA3, die aus den Seiten 3-5 von WO 94/16091 zu entnehmen ist, sowie für den Fermentationsprozess unter Einsatz dieses Pilzes zur Herstellung von Cyclosporinen, der den Beispielen 1 und 2 von WO 94/16091 zu entnehmen ist. Weitere mikrobiologische Verfahren sind in DD-B-298276, EP-A-0507968, US 5156960 u. a. offenbart.
Aus dem Kulturbrei, d. h. aus dem Gesamt-Fermentationsbrei, der bei der mikrobiologischen Herstellung anfällt, können erfindungsgemäß die gewünschten Produkte durch Extraktion gewonnen werden. Dazu wird der Gesamt- Fermentationsbrei mit einem flüssigen, mit Wasser nicht mischbaren, etherhaltigen Extraktionsmittel versetzt, wobei die Menge des Extraktionsmittels ausreicht, um mit dem Gesamt-Fermentationsbrei ein 2-Phasen System zu bilden. Der Fachmann weiß, dass neben den zwei nebeneinander vorliegenden flüssigen Phasen auch Feststoffteilchen aus dem Fermentationsprozess im vorstehend genannten System vorhanden sind, welche in der wässrigen Phase vorliegen.
Erfindungsgemäß wird unter einem flüssigen, mit Wasser nicht mischbaren Extraktionsmittel ein Extraktionsmittel verstanden, das bei 20 0C mit Wasser zumindest eine Mischungslücke aufweist, bei der das flüssige Extraktionsmittel mit dem Wasser zumindest so unvollständig mischbar bzw. unvollständig löslich ist, dass eine Phasentrennung auftritt.
Vorzugsweise weisen diese erfindungsgemäß zum Einsatz kommenden, etherhaltigen, mit Wasser nicht mischbare Extraktionsmittel eine Dichte von höchstens 0,9 g/cm3, vorzugsweise eine Dichte von 0,6 bis 0,85 g/cm3, besonders bevorzugt von 0,7 bis 0,8 g/cm3, jeweils gemessen bei 20 0C, auf.
Vorzugsweise besteht das etherhaltige Extraktionsmittel im wesentlichen aus einem oder mehreren Ethern, ganz besonders bevorzugt aus wenigstens einem Ether der allgemeinen Formel
R1-O-R2
in der R1 und R2 unabhängig voneinander, für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit Ci bis C5 steht und mindestens einer der Reste Ri und R2 wenigstens 3 C-Atome, vorzugsweise wenigstens 4 C-Atome, aufweist.
Besonders bevorzugte Ether, die zur Extraktion verwendet werden können, ist wenigstens ein Ether ausgewählt aus der Gruppe umfassend Di-isopropylether, Di-n- propylether, Di-t-butylether, Di-iso-butylether, Methyl-t-butylether, Ethyl-t-butylether, Propyl-t-butylether und n-Butyl-t-butylether, wobei der Einsatz von Methyl-t-butylether besonders bevorzugt ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung von flüssigen, mit Wasser nicht mischbaren, etherhaltigen Extraktionsmittel, vorzugsweise mit einer Dichte von höchstens 0,9 g/cm3, gemessen bei 20 0C, als Mittel zur Extraktion von mikrobiologisch hergestellten, unpolaren, zyklischen Oligopeptiden, vorzugsweise Undekapeptiden, besonders bevorzugt Cyclosporinen, ganz besonders bevorzugt von Cyclosporin A aus dem bei der mikrobiologischen Herstellung anfallenden Gesamt-Fermentationsbrei. Bei dieser erfindungsgemäßen Verwendung kommen vorzugsweise die vorstehend aufgeführten Ether in solchen angegebenen Mengen zum Einsatz, dass sie mit dem Gesamt-Fermentationsbrei ein 2-Phasen-System bilden.
Vorzugsweise erfolgt die Extraktion des Gesamt-Fermentationsbreis, insbesondere bei der Isolierung und Aufarbeitung von Cyclosporinen, besonders bevorzugt von Cyclosporin A, bei einem pH-Wert von 7 bis 9, vorzugsweise 7,5 bis 8,5.
Zur Beschleunigung der Phasentrennung können bekannte wasserlösliche Netzmittel, z.B. auf Polyacrylatbasis, in einer ausreichenden Menge dem Gesamt- Fermentationsbrei zugesetzt werden.
Vorzugsweise wird die Extraktion mehrmals durchgeführt. Besonders bevorzugt wird der Gesamt-Extraktionsbrei zweimal mit dem etherhaltigen Extraktionsmittel extrahiert.
Die Extraktion des Gesamt-Fermentationsbreis erfolgt vorzugsweise mit dem etherhaltigen, mit Wasser nicht mischbaren Extraktionsmittel bei Raumtemperatur, besonders bevorzugt bei 20 bis 30 0C.
Die Extraktion des Gesamt-Fermentationsbreis kann in üblichen Apparaturen durchgeführt werden, wobei die bei der Extraktion gewonnenen Extrakte nach Abtrennung der wässrigen Phase mit der Biomasse zur weiteren Aufarbeitung vereinigt werden.
Vorzugsweise schließt sich daher an den Verfahrensschritt a) ein weiterer Verfahrensschritt b) an, gemäß dem der im Extrakt vorliegende Restwassergehalt auf weniger als 1 Gew.%, vorzugsweise auf weniger als 0,3 Gew.% erniedrigt wird. Bevor diese Erniedrigung des Restwassergehaltes durchgeführt wird, wird vorzugsweise der Extrakt mit einer wässrigen Lösung, vorzugsweise mit Wasser, gewaschen, um ggfs. vorhandene Reste an Biomasse zu entfernen. Zur Erniedrigung des Restwassersgehaltes eines so ggfs. gereinigten Extraktes kann eine azeotrope Destillation durchgeführt werden. Dabei wird nicht nur der Restwassergehalt auf das gewünschte Maß in dem Extrakt erniedrigt, sondern auch die Konzentration der mikrobiologisch hergestellten Produkte, vorzugsweise der Cyclosporine, besonders bevorzugt des Cyclosporin A, erhöht. Bei dieser Konzentrierung wird vorzugsweise ein Cyclosporingehalt von 10 bis 35 Gew.% eingestellt. Durch die azeotrope Destillation in Schritt b) gelingt es, nicht nur den Restwassergehalt im Extrakt auf den gewünschten, niedrigen Wassergehalt einzustellen, sondern auch eine für die anschließende Kristallisation des aufgearbeiteten Produktes vorteilhafte Konzentration des Extraktes einzustellen, wobei das Produkt vorzugsweise als Cyclosporin-Ether-Solvat kristallisiert wird. Es wurde nämlich gefunden, dass die Kristallisation von Cyclosporinen als Cyclosporin- Ether-Solvat, und insbesondere die Kristallisation von Cyclosporin A als Cyclosporin A-Ether-Solvat, bei einem Restwassergehalt von weniger als 1 Gew.%, insbesondere von weniger als 0,3 Gew.%, deutlich besser vonstatten geht und leicht filtrierbare, praktisch farblose, weiße Cyclosporin-Ether-Solvat-Kristalle zugänglich macht. Die leichte Filtrierbarkeit der bereits sehr reinen Cyclospohn-Ether-Solvat-Kristalle erleichtert und verkürzt das Gesamtaufarbeitungsverfahren zusätzlich.
Dementsprechend umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten Produkten, vorzugsweise Cyclosporinen, besonders bevorzugt von Cyclosporin A, einen weiteren Verfahrensschritt c), gemäß dem der im Schritt b) aufkonzentrierte, von Restwassergehalt weitgehend befreite Extrakt durch Abkühlen auf Temperaturen von -10 0C bis 15 0C, vorzugsweise auf Temperaturen von -5 0C bis 10 0C, zur Kristallisation als Ethersolvatprodukt, vorzugsweise Cyclosporin-Ether-Solvat, abgekühlt wird. Vorzugsweise ist für das Auskristallisieren der Cyclospohn-Ether-Solvat-Kristalle keine Zugabe eines organischen Lösungsmittels, in dem die Kristalle nicht löslich sind, zu dem konzentrierten, vom Restwassergehalt weitgehend befreiten Extrakt notwendig, da gut filtrierbare, praktisch farblose, weiße Kristalle bereits durch das Abkühlen des konzentrierten Extraktes erhalten werden. Gegebenenfalls können die Kristalle, vorzugsweise die Cyclosporin-Ether-Solvat-Kristalle mit einem organischen Lösungsmittel, in dem sich die Kristalle nur langsam lösen, zur weiteren Reinigung gewaschen werden.
Gegebenenfalls können die Cyclosporin-Ether-Solvat-Kristalle durch bekannte chromatographische Aufreinigung und Kristallisation in geeigneten, bekannten Lösungsmitteln in die Cyclosporine A-Z aufgetrennt werden (siehe dazu auch WO97/46575, EP0725076, EP0888382).
Dementsprechend ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung von kristallinen Cyclosporin-Ether-Solvaten bei der großtechnischen Herstellung von Cyclosporinen, vorzugsweise von Cyclosporin A. Für diese großtechnische Herstellung von Cyclosporinen eignen sich insbesondere die erfindungsgemäß erhaltenen, kristallinen Cyclosporin-Ether-Solvat-Kristalle.
Überaschenderweise ermöglicht die Extraktion des Gesamtfermentationsbreis mit dem erfindungsgemäßen etherhaltigen Extraktionsmittel, insbesondere in Verbindung mit dem Schritt der Erniedrigung des Restwassergehaltes, die Kristallisation von Cyclospohn-Ether-Solvat-Kristallen, die gute Filtherbarkeit und hohe Reinheit aufweisen. Dadurch wird das Gesamtaufarbeitungsverfahren deutlich vereinfacht.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten, unpolaren Cyclosporinen, vorzugsweise von Cyclosporin A, umfassend die Schritte a) Extraktion des bei der mikrobiologischen Herstellung von Cyclosporinen anfallenden Gesamt-Fermentationsbreis mit einem flüssigen, mit Wasser nicht mischbaren etherhaltigen Extraktionsmittel, wobei die Menge des Extraktionsmittels ausreicht, um mit dem Gesamt-Fermentationsbrei ein 2- Phasen System zu bilden, b) Erniedrigen des im Extrakt gelösten Restwassergehaltes auf weniger als
1 Gew.%, vorzugsweise auf weniger als 0,3 Gew.%, wobei der im Schritt a) erhaltene Extrakt ggfs. vor dieser Erniedrigung des Restwassergehalts mit einer wässrigen Lösung gewaschen werden kann, und c) Kristallisieren der Cyclosporine als Cyclosporin-Ether-Solvate, wobei vorzugsweise vor der Kristallisation der im Schritt b) erhaltene Extrakt auf einen Cyclosporingehalt von 10 bis 25 Gew.%, bezogen auf den Gesamt-Extrakt, aufkonzentriert wird und zur Kristallisation der aufkonzentrierte Extrakt auf Temperaturen von -10 0C bis 15 0C, vorzugsweise -5 0C bis 10 0C, abgekühlt wird.
Die vorstehend angegebenen Reaktionsbedingungen für die einzelnen Verfahrensschritte gelten ebenso für die erfindungsgemäß bevorzugte Aufarbeitung von unpolaren Cyclosporinen, die mikrobiologisch hergestellt worden sind, insbesondere zur der Aufarbeitung und Isolierung von Cyclosporin A. Dies gilt auch für die zum Einsatz kommenden etherhaltigen Extraktionsmittel, vorzugsweise Ether der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel.
Dementsprechend können mit dem bevorzugten erfindungsgemäßen Aufarbeitungsverfahren leicht filtrierbare, praktisch farblose, weiße Cyclosporin- Ether-Solvat-Kristalle erhalten werden.
Diese Kristalle eignen sich insbesondere auch, um durch weiteres Umkristallisieren in bekannter weise und/oder durch chromatographische Aufarbeitung mit bekannten Säulenmaterialien in Kombination mit bekannten, geeigneten Eluierungsmittel in die Cyclosporine A-Z aufgetrennt zu werden.
Es wurde beobachtet, dass in Cyclosporin A-Ether-Solvat-Kristallen das ansonsten schwer abtrennbare Isocyclosporin A deutlich abgereichert ist.
Dementsprechend ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung Cyclosporin A mit einem Gehalt von weniger als 0,05 Gew.% Isocyclosporin A, vorzugsweise mit einem Gehalt von 0,04 bis 0,05 Gew.% Isocyclosporin A.
Das Cyclosporin A, das nach dem erfindungsgemäßen Aufarbeitungsverfahren erhältlich ist, zeichnet sich auch durch einen geringeren Gehalt an Cyclosporin H und Cyclosporin T aus.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch Cyclosporin A, wobei dessen Gesamtgehalt an Cyclosporin H und Cyclosporin T weniger als 0,5 Gew.%, vorzugsweise von 0,1 bis 0,4 Gew.% beträgt.
Ebenso ist ein weiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung Cyclosporin A mit einem Gehalt von 0,04 bis 0,005 Gew.% Isocyclosporin A, wobei der zusätzliche Gesamtgehalt an Cyclosporin H und Cyclosporin T von 0,01 bis 4 Gew.% beträgt.
Vorzugsweise ist dieses Cyclosporin A mit den geringen Gehalten an Nebenprodukten durch die erfindungsgemäße Aufarbeitung und Weiterbehandlung von erfindungsgemäß erhaltenen Cyclosporin A-Methyl-t-Butyl-Ether-Solvat- Kristallen erhältlich.
Darüberhinaus gelingt es, mit Hilfe des erfindungsgemäßen, bevorzugten Aufarbeitungsverfahren von unpolaren, mikrobiologisch hergestellten Cyclosporinen, die Cyclosporin-Ether-Solvat-Kristalle nicht nur mit einer ausgezeichneten Reinheit und mit Ausbeuten über 90 %, vorzugsweise > 95 %, zu erhalten, sondern auch mit einer sehr guten Handhabbarkeit der Kristalle, da wenigstens 90 % der Kristalle eine Kristallgröße > 10 μm aufweisen und der Median der Korngrößenverteilung bei etwa 60 μm liegt. Zur Messung der Korngrößenverteilung wurden 3 x 1 g der Probe in 60 ml_ Wasser dispergiert und nach Zugabe der Dispergiereinheit Hydro 2000S bei einer Rührgeschwindigkeit von 2000 rpm mit dem Messgerät „Mastersizer 2000" der Fa. Malvern gemessen. Zur Auswertung wurde das Modell „Fraunhofer" des Geräteherstellers verwendet. Die oben angeführten Werte verstehen sich als Mittelwerte über 3 solcher Messungen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher kristallines Cyclosporin A-Methyl-t-Butylether-Solvat, von dem wenigstens 90 % der Kristalle eine Kristallgröße > 10 μm aufweisen, wobei vorzugsweise der Median der Größenverteilung zwischen 30μm und 100μm liegt, vorzugsweise zwischen 40μm und 80μm.
Wie bereits ausgeführt eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestelltem Cyclosporin A als kristallines Cyclosporin A-Methy-t-Butylether-Solvat. Solche Kristalle konnten mit Hilfe von Röntgenpulverdiffraktogrammen eindeutig bestimmt werden.
Röntgenpulverdiffraktogramme (XRPD) wurden auf einem AXS-Bruker Röntgenpulverdiffraktometer D-8 unter Verwendung der folgenden Aufnahmeparameter bei Umgebungsbedingungen gewonnen: Röhrenanode: Cu; Generatorspannung: 4OkV; Generatorstrom: 40 mA; Anfangswinkel: 2° 2-Theta; Endwinkel: 40° 2-Theta; Schrittgröße: 0.01 ° 2-Theta; Zeit pro Schritt: 2 Sekunden. Die typische Genauigkeit der 2-theta Werte liegt im Bereich von ± 0.1 ° 2-Theta. Daher kann ein Diffraktionspeak (Scheitelpunkt) der bei 5.0° 2-Theta verzeichnet ist, zwischen 4.9 and 5.1 ° 2-Theta auf den meisten Röntgendiffraktometern bei Standardbedingungen erscheinen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher kristallines Cyclosporin A-Methyl-t-Butylether-Solvat, das ein Röntgenpulverdiffraktogramm umfassend Scheitelpunkte (peaks) bei 2 Theta Winkeln von 7,0° +/- 0,1 °, 8,2° +/- 0,1 °, 11 ,0° +/- 0,1 ° und 20,5° +/- 0,1 ° aufweist, insbesondere zusätzlich umfassend Scheitelpunkte bei 2 Theta Winkeln von 7,3° +/- 0,1 M 1 ,8° +/- 0,1 M 3,3° +/- 0,1 ° und 16,5° +/- 0,1 °. Die Erfindung bezieht sich auch auf folgende Gegenstände:
1. Ein Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten, unpolaren, zyklischen Oligopeptiden umfassend den Schritt a) Extraktion des bei der mikrobiologischen Herstellung anfallenden Gesamt- Fermentationsbreis mit einem flüssigen, mit Wasser bei 25 0C nicht mischbaren, etherhaltigen Extraktionsmittel, wobei die Menge des Extraktionsmittels ausreicht, um mit dem Gesamt-Fermentationsbrei ein Zwei-Phasen System zu bilden.
2. Ein Verfahren nach Gegenstand 1 , wobei die unpolaren, zyklischen Oligopeptide unpolare Undekapeptide sind.
3. Ein Verfahren nach Gegenstand 2, wobei die unpolaren Undekapeptide Cyclosporine, vorzugsweise Cyclosporin A, sind.
4. Ein Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 3, wobei das etherhaltige Extraktionsmittel im wesentlichen aus einem oder mehreren Ether(n) besteht.
5. Ein Verfahren nach Gegenstand 3 oder 4, wobei das etherhaltige Extraktionsmittel im wesentlichen aus einem oder mehreren Ether(n) besteht und das Verfahren den weiteren Schritt umfasst: b) Erniedrigen des im Extrakt gelösten Restwassergehaltes auf weniger als 1 Gew.%, vorzugsweise auf weniger als 0,3 Gew.%.
6. Ein Verfahren nach Gegenstand 5, wobei Schritt b) durch azeotrope Destillation erfolgt.
7. Ein Verfahren nach Gegenstand 5 oder 6, wobei der in Schritt a) erhaltene Extrakt vor der Weiterverarbeitung in Schritt b) mit einer wässrigen Lösung gewaschen wird.
8. Ein Verfahren nach einem der Gegenstände 5 bis 7, wobei der cyclosporinhaltige Extrakt auf einen Cyclosporingehalt von 10 Gew.% - 35 Gew.%, bezogen auf die Gesamt-Extraktmasse, auf konzentriert wird.
9. Ein Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 8, wobei als Ether wenigstens ein Ether der allgemeinen Formel R1-O-R2
eingesetzt wird, in dem Ri und R2, unabhängig voneinander, für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit Ci bis C5 steht und mindestens einer der Reste Ri oder R2 wenigstens 3 C-Atome, vorzugsweise wenigstens 4 C-Atome aufweist.
10. Ein Verfahren nach Gegenstand 9 wobei als Ether wenigstens ein Ether ausgewählt aus der Gruppe umfassend Di-isopropylether, Di-n-propylether, Di-t-butylether, Di-iso-butylether, Methyl-t-butylether, Ethyl-t-butylether, Propyl- t-butylether und n-Butyl-t-butylether verwendet wird.
11. Ein Verfahren nach einem der Gegenstände 5 bis 10, wobei das Verfahren den weiteren Schritt umfasst: c) Kristallisieren des unpolaren, zyklischen Oligopeptids als Ethersolvatprodukt.
12. Ein Verfahren nach einem der Gegenstände 5 bis 10, wobei das Verfahren den weiteren Schritt umfasst: c) Kristallisieren des Cyclosporins als Cyclosporin-Ether-Solvat.
13. Ein Verfahren nach Gegenstand 11 oder 12, wobei man für Schritt c) den aufkonzentrierten Extrakt auf eine Temperatur von -100C bis 15°C abkühlt.
14. Ein Verfahren nach Gegenstand 12 oder 13, wobei die nach Schritt c) erhaltenen Cyclosporin-Ether-Solvat-Kristalle mit organischen Lösungsmitteln, in denen sich die Cyclosporin-Ether-Solvat-Kristalle nur langsam lösen, gewaschen werden.
15. Ein Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 14, wobei der Gesamt- Fermentationsbrei mehrmals, vorzugsweise zweimal, mit dem etherhaltigen Extraktionsmittel extrahiert wird.
16. Ein Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 15, wobei der Gesamt- Fermentationsbrei bei der Extraktion einen pH-Wert von 7 bis 9, vorzugsweise 7,5 bis 8,5 aufweist.
17. Ein Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion mit dem etherhaltigen Extraktionsmittel bei Raumtemperatur, vorzugsweise bei 20 bis 30 0C, durchgeführt wird. 18. Ein Verfahren nach einem der Gegenstände 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Cyclosporin-Ether-Solvat durch Umkristallisieren und/oder chromatographische Aufarbeitung jeweils in Cyclosporin A - Z aufgetrennt wird.
19. Kristallines Cyclosporin A - Methyl-t-butylether - Solvat, das ein Röntgenpulverdiffraktogramm umfassend Scheitelpunkte (peaks) bei 2 Theta Winkeln von 7,0° +/- 0,1 °, 8,2° +/- 0,1 M 1 ,0° +/- 0,1 ° und 20,5° +/- 0,1 ° aufweist, insbesondere zusätzlich umfassend Scheitelpunkte bei 2 Theta Winkeln von 7,3° +/- 0,1 °, 11 ,8° +/- 0,1 °, 13,3° +/- 0,1 ° und 16,5° +/- 0,1 °.
20. Kristallines Cyclosporin A - Methyl-t-butylether - Solvat, worin wenigstens 90% der Kristalle eine Kristallgröße größer als 10 μm haben (gemessen mittels Laserbeugung, Malvern Mastersizer 2000).
21. Cyclosporin A mit einem Gehalt von weniger als 0,05 Gew.% Isocyclosporin A, vorzugsweise mit einem Gehalt von 0,04 - 0,005 Gew.% Isocyclosporin A.
22. Cyclosporin A, wobei dessen Gesamtgehalt an Cyclosporin H und Cyclosporin T weniger als 0,5 Gew.%, vorzugsweise von 0,1 - 0,4 Gew.% beträgt.
23. Cyclosporin A mit einem Gehalt von 0,04 - 0,005 Gew.% Isocyclosporin A, wobei der zusätzliche Gesamtgehalt an Cyclosporin H und Cyclosporin T von 0,1 - 0,4 Gew.% beträgt.
24. Verwendung von kristallinem Cyclosporin-Ether-Solvat bei der großtechnischen Herstellung von Cyclosporinen.
25. Verwendung nach Gegenstand 24, um die Nebenprodukte Isocyclosporin A, Cyclosporin H und Cyclosporin T abzureichern.
26. Verwendung eines flüssigen, mit Wasser bei 25 0C nicht mischbaren, etherhaltigen Extraktionsmittels zur Extraktion von bei der mikrobiologischen Herstellung anfallenden, unpolaren, zyklischen Oligopeptiden, vorzugsweise Cyclosporinen, besonders bevorzugt von Cyclosporin A, aus dem Gesamt- Fermentationsbrei. Beschreibung der Figuren:
Figur 1 : Röntgenpulverdiffraktogramm von kristallinem Cyclosporin A-Methyl-t- Butylether-Solvat
Figur 2: Infrarotspektrum von kristallinem Cyclosporin A-Methyl-t-Butylether-Solvat
Beispiele
Die folgenden Beispiele beschreiben besondere Ausführungsformen der Erfindung detailliert, sie sind aber nicht als Beschränkung der Erfindung auszulegen.
Beispiel 1 : Extraktion von Cyclosporin A aus Fermentationsbrei
2000g Cyclosporin A-haltiger Fermentationsbrei, wie er z.B. auch durch Fermentation von Tolypocladium inflatum erhalten werden kann, wurden zweimal mit je 2000ml Methyl-tert.-butylether (MTBE) in Gegenwart von 4000 ppm des Polyacrylats Clahant MD07/049 extrahiert. Die Etherphasen wurden im Scheidetrichter abgetrennt und vereinigt. Die Cyclosporin A-haltige Etherphase wurde einmal mit 200 ml Wasser, das einen pH von etwa 7 aufwies, im Scheidetrichter gewaschen und die Etherphase wurde nach Filtration durch azeotrope Destillation bei einer Temperatur von etwa 53°C eingeengt, sodass eine Cyclosporin konzentration von 150g/kg erreicht wurde. Die Temperatur wurde dann auf einen Wert knapp unter dem Siedepunkt abgesenkt und 2 Stunden lange bei dieser Temperatur gehalten, wobei über den Destillationskopf entweichendes MTBE durch frisches ersetzt wurde. Danach wurde die Lösung unter Normaldruck bei 53°C aufkonzentriert, sodass eine Cyclosporinkonzentration von 300 g/kg erreicht wurde. Der Restwassergehalt, der vor der azeotropen Destillation bei etwa 1 ,4 Gew.% lag, lag nun unter 0,1 Gew.%. Die Lösung wurde vorsichtig abgekühlt, und zwar in 120 Minuten von 53°C auf 45°C, in weiteren 60 Minuten auf 400C, in weiteren 60 Minuten auf 300C und in weiteren 60 Minuten auf 0°C. Man erhielt weißes, kristallines Cyclosporin A - MTBE Solvat in einer theoretischen Gesamtausbeute von etwa 82%. Ein Infrarotspektrum der erhaltenen Kristalle ist in Figur 2, ein Pulverröntgendiffraktogramm (XRPD) der erhaltenen Kristalle ist in Figur 1 gezeigt. Die Auswertung am Interferenzmikroskop ergab hochkristallines Material mit großen, doppelbrechenden Kristallen, mit einer mittleren Korngröße von etwa 65 μm.
Beispiel 2: Großtechnische Extraktion von Cyclosporin A aus Fermentationsbrei
510kg Cyclosporin A-haltiger Fermentationsbrei wurden zweimal mit je 5101 Methyl- tert.-butylether (MTBE) extrahiert, wobei 2,6kg des Polyacrylats Clariant MD07/049 zugegeben wurden. Die Etherphasen wurden in einem 3001 Separator im Durchlauf abgetrennt und vereinigt. Die Cyclosporin A-haltige Etherphase wurde einmal mit 7001 Reinwasser, das einen pH von etwa 7 aufwies, gewaschen, die Phasen im Separator wieder getrennt und die Etherphase wurde durch azeotrope Destillation in einem 10001 Dünnschichtverdampfer bei einer Temperatur von etwa 53°C eingeengt, sodass eine Cyclosporin konzentration von 100 g/kg erreicht wurde. Die Temperatur wurde dann auf einen Wert knapp unter dem Siedepunkt abgesenkt und 2 Stunden lange bei dieser Temperatur gehalten, wobei über den Destillationskopf entweichendes MTBE durch frisches ersetzt wurde. Danach wurde die Lösung unter Normaldruck bei 53°C auf konzentriert, sodass eine Cyclosporin konzentration von 300 g/kg erreicht wurde. Der Restwassergehalt, der vor der azeotropen Destillation bei etwa 1 ,4 Gew.% lag, lag nun unter 0,1 Gew.%. Die Lösung wurde nun vorsichtig abgekühlt, und zwar in 120 Minuten von 53°C auf 45°C, in weiteren 60 Minuten auf 400C, in weiteren 60 Minuten auf 300C und in weiteren 60 Minuten auf 0°C. Man erhielt 8,55 kg weißes, kristallines Cyclosporin A - MTBE Solvat in einer theoretischen Gesamtausbeute von etwa 87%. Der Gehalt an Isocyclosporin A betrug 0,008 Gew.%, der Gesamtgehalt an Cyclosporin H und Cyclosporin T betrug 0,28 Gew.%, was gegenüber einem Extraktionsverfahren mit Butylacetat eine hochsignifikante Verringerung des Gehalts an diesen Verunreinigungen bedeutete.

Claims

Patentansprüche
1. Ein Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten, unpolaren, zyklischen Oligopeptiden umfassend den Schritt a) Extraktion des bei der mikrobiologischen Herstellung anfallenden Gesamt- Fermentationsbreis mit einem flüssigen, mit Wasser bei 25 0C nicht mischbaren, etherhaltigen Extraktionsmittel, wobei die Menge des Extraktionsmittels ausreicht, um mit dem Gesamt-Fermentationsbrei ein Zwei- Phasen System zu bilden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das unpolare, zyklische Oligopeptid Cyclosporin A ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das etherhaltige Extraktionsmittel im wesentlichen aus Methyl-tert.-Butylether besteht und das Verfahren den weiteren Schritt umfasst: b) Erniedrigen des im Extrakt gelösten Restwassergehaltes auf weniger als 1 Gew.%, vorzugsweise auf weniger als 0,3 Gew.%, stärker bevorzugt auf weniger als 0,15 Gew.%.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei Schritt b) durch azeotrope Destillation erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 4, wobei das unpolare, zyklische Oligopeptid Cyclosporin A ist und das Verfahren den weiteren Schritt umfasst: c) Kristallisieren des Cyclosporins als Cyclosporin A- Methyl-tert.-Butylether- Solvat.
6. Kristallines Cyclosporin A - Methyl-t-butylether - Solvat, das ein Röntgenpulverdiffraktogramm umfassend Scheitelpunkte (peaks) bei 2 Theta Winkeln von 7,0° +/- 0,1 °, 8,2° +/- 0,1 °, 11 ,0° +/- 0,1 ° und 20,5° +/- 0,1 ° aufweist, insbesondere zusätzlich umfassend Scheitelpunkte bei 2 Theta Winkeln von 7,3° +/- 0,1 °, 11 ,8° +/- 0,1 °, 13,3° +/- 0,1 ° und 16,5° +/- 0,1 °.
7. Kristallines Cyclosporin A - Methyl-t-butylether - Solvat, worin wenigstens 90% der Kristalle eine Kristallgröße größer als 10 μm haben.
8. Cyclosporin A mit einem Gehalt von 0,04 - 0,005 Gew.% Isocyclospohn A, wobei der zusätzliche Gesamtgehalt an Cyclosporin H und Cyclosporin T von 0,1 - 0,4 Gew.% beträgt.
9. Verwendung von kristallinem Cyclosporin-Ether-Solvat bei der großtechnischen Herstellung von Cyclosporinen.
10. Verwendung nach Anspruch 9, um die Nebenprodukte Isocyclospohn A, Cyclosporin H und Cyclosporin T abzureichern.
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