CN104877013A - 环孢菌素t及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了环孢菌素T，结构式如式（Ⅰ）所示，并提供了其制备方法和应用。本发明提供的环孢菌素T及其制备方法和应用，其有益效果为：（1）环孢菌素T对牲畜无毒，其来源Epichlo? bromicola是一种有益的内生真菌；（2）环孢菌素T具有广谱杀菌活性，用量低，防病效果优于阳性药物；（3）环孢菌素T是天然产物，可以通过对Epichlo? bromicola内生真菌大量发酵得到，具有可持续性；（4）Epichlo? bromicola内生真菌可接种于其它劣势牧草上，其具有培育抗植物病原真菌的优势牧草的潜质。

Description

环孢菌素 T 及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化合物制备及用途领域，具体涉及环孢菌素T及其制备方法和应用。

背景技术

我国草地农业发展缓慢，最直接的影响就是造成畜牧业发展也减速，因而致使每年我国从国外进口的牧草以及购买婴儿奶制品的数量逐年上升。究其原因主要是因为我国缺少具有抗性的优异牧草品种，尤其是具有抗植物病原真菌的牧草。每年我国牧草由于植物病原真菌的危害，造成大面积减产和生长缓慢，并且还影响奶制品的安全。虽然现阶段化学合成的杀灭植物病原真菌药物在植物病害防治中起着不可代替的作用。但是，大家对农药毒性和农药对环境的污染问题越来越重视，一些毒性高，残留长的杀菌剂品种，如有机氯汞制剂（艾氏剂、六六六）等相继禁用。从微生物中寻找新的无毒、无污染、可持续利用的生物源杀菌剂已成为当现代农药研究开发的一个热点。

微生物源杀菌剂是指利用微生物及其代谢产物来防治植物病原真菌。目前，该类型杀菌剂已成为农药发展的主要趋势。我们知道禾草的很多草已成为具有抗菌活性的优异牧草，如野大麦，中华羊茅等，然而其抗性特点来源于自身的内生真菌Epichloë为其宿主提供的此利益。如果能从Epichloë中找到具有抑制植物病原真菌的代谢物，并且这些代谢物对牲畜无毒，那么将这些内生真菌接种于普通的牧草中，使其成为具有抗性的优良牧草，将解决我国缺乏具有抗植物病原真菌的优良牧草问题。同时这类微生物源杀菌剂不会对生态环境产生污染，还具有可持续性，这将是抗菌药物研制与生产单位重要的工作方向。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了环孢菌素T及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：环孢菌素T，结构式如式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）。

进一步的，上述的环孢菌素T，所述环孢菌素T是由青海的麦宾草（Elymus tangutorum）中分离得到的Epichloë bromicola内生真菌的代谢产物。

本发明所指的内生真菌是从青海的麦宾草（Elymus tangutorum）中分离得到的Epichloë bromicola。根据相关的试验表明，Epichloë bromicola中的代谢产物环孢菌素T（Cyclosporin T），是一种对牲畜正常动物细胞无毒，并且能有效杀灭常见的牧草植物病原真菌的化合物，是一种极有前景的可持续利用的微生物源农药。

上述的环孢菌素T，所述Epichloë bromicola内生真菌的保藏编号为：NI_201216。

Epichloë bromicola内生真菌的来源，在《Origin, Divergence, and Phylogeny of AsexualEpichloë Endophyte in Elymus Species fromWestern China》文献中已经有详细记载，此文献已于2015年5月14日公开，是为现有技术。

本发明的第二个目的是提供了上述的环孢菌素T的制备方法，包括以下步骤：

1）先将Epichloë bromicola内生真菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，置于恒温箱摇床上培养，培养温度为27℃，培养时间为7天，得到Epichloë bromicola内生真菌悬浮液，接种量为从马铃薯葡萄糖琼脂培养基挑取0.5 cm²的琼脂块；

2）将步骤1）得到的摇床培养后Epichloë bromicola内生真菌悬浮液，接种于100个1000 mL的锥形瓶中，每瓶内含有100 g大米培养基，于27℃的恒温箱内培养30天；接种量为每个锥形瓶接3.0 mL悬浮液，悬浮液孢子浓度为1×10⁶个孢子/mL；每瓶大米培养基含水量为160mL蒸馏水；

3）以乙酸乙酯萃取步骤2）得到的培养Epichloë bromicola内生真菌的大米培养基，得到粗浸膏；

4）将步骤3）得到的粗浸膏以氯仿-甲醇作溶剂过硅胶柱子，柱子规格为外径6cm，内径5.3cm，长45.7cm（购买于北京欣微尔玻璃仪器有限公司，货号为C184604），再以葡聚糖凝胶色谱分离得到环孢菌素T。

进一步的，上述的环孢菌素T的制备方法，所述步骤1）中，马铃薯葡萄糖液体培养基的制备方法为：每200g土豆，加入1000ml蒸馏水，煮开后再煮沸30min，将煮液用纱布过滤于烧杯中，在滤汁中补足水分至1000ml，重新倒入锅中，加入20g蔗糖即可。

本发明的第三个目的是提供了上述的环孢菌素T在牧草抗性检测中的应用。

本发明的第四个目的是提供了上述的环孢菌素T在抑制植物病原真菌中的应用。

进一步的，上述的应用，所述植物病原真菌为细交链孢、小麦离蠕孢病菌、燕麦镰孢病菌和新月弯孢霉。

Cyclosporin T是一种多肽，该类化合物的研究已经有已经有几十年的历史，早期主要用于预防及治疗骨髓移植时发生的移植物抗宿主反应。现有文献报道其可以治疗眼色素层炎、银屑病、难治性狼疮肾炎、难治性自身免疫性血小板减少性紫癜以及重型再生障碍性贫血等疾病。然而对于Cyclosporin T是否对牲畜有毒以及是否具有抗植物病原真菌活性，均未见文献报道。

经过实验证明：Cyclosporin T是从Epichloë bromicola内生真菌中分离得到的量最大的化合物，Cyclosporin T对正常牛肾细胞（madin-darby bovine kidney cells）无毒，并且在低浓度可以促进细胞生长；Cyclosporin T对于多种牧草常见的植物病原真菌都有很强的离体抗菌活性，表现出较广谱的杀菌活性；Cyclosporin T对这四种植物病原真菌（细交链孢, 小麦离蠕孢病菌，燕麦镰孢病菌, 新月弯孢霉）活性均优于阳性对照药物甲基托布津和多菌灵。

本发明提供的环孢菌素T及其制备方法和应用，其有益效果为：

（1）环孢菌素T对牲畜无毒，其来源Epichloë bromicola是一种有益的内生真菌；

（2）环孢菌素T具有广谱杀菌活性，用量低，防病效果优于阳性药物；

（3）环孢菌素T是天然产物，可以通过对Epichloë bromicola内生真菌大量发酵得到，具有可持续性；

（4）Epichloë bromicola内生真菌可接种于其它劣势牧草上，其具有培育抗植物病原真菌的优势牧草的潜质。

附图说明

图1为本发明提供的环孢菌素T的结构图。

具体实施方式

实施例 1 ：

环孢菌素 T （ Cyclosporin T ）的制备：

1、实验方法：

先将Epichloë bromicola内生真菌接种于土豆葡萄糖液体培养基中，温度保持在27℃的恒温箱内的摇床上培养7天，之后将其接种于100个1000 mL的锥形瓶中，每瓶还有100 g潮湿的大米，在27℃的恒温箱内培养30天。 此时用乙酸乙酯萃取大米培养基，得到18 g粗浸膏，然后过硅胶柱子（氯仿-甲醇作溶剂）和葡聚糖凝胶色谱分离得到Cyclosporin T（478 mg）。并通过核磁、高分辨质谱以及与文献对比确定了Cyclosporin T的化学结构。

2、实验结果：

对Epichloë bromicola在大米培养基下发酵，大量得到Cyclosporin T。

实验例 2 ：

Cyclosporin T 对牛肾正常细胞毒性的观察：

1、实验方法：

将牛肾正常细胞接种于96孔板中，每个孔加入 100 μL 的DMEM培养基，在37℃下培，养24h后，不同浓度梯度的Cyclosporin T加入96孔板中，再培养24h。之后10 μL 的 5 mg/mL 刃天青钠溶液加入孔中，培养2h后，用多功能酶标仪器在波长555/585 纳米下测其荧光强度来计算其抑制率。

2、实验结果：

Cyclosporin T对牛肾细胞的IC₅₀ >100 μM，并且从12.5μM开始促进牛肾细胞增长，说明Cyclosporin T对牲畜无毒，Epichloë bromicola是一种有益的内生真菌。

实施例 3 ：

Cyclosporin T 对植物病原真菌菌丝生长的抑菌活性：

1、供试病原真菌： 细交链孢（Alternaria alternat）, 小麦离蠕孢病菌（Bipolaris sorokinian），燕麦镰孢病菌（Fusarium avenaceum）, 新月弯孢霉（Curvularia lunata）。

2、实验方法：

采用含毒介质的生长速率法测定杜鹃素对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用。简述为将Cyclosporin T用DMSO溶解后加入到熔融的PDA培养基中（DMSO含量5 ‰），分别配成含Cyclosporin T一定浓度的含药PDA平板。将培养活化好的直径是5 mm的各病原真菌的菌丝块移到含药平板中央，每个浓度设三次重复，并设5 ‰的DMSO作为对照。置27℃恒温培养。用十字交叉法测量菌落直径，并校正，计算抑菌百分率，计算毒力回归方程y=a+bx，抑制中浓度(EC₅₀)。

3、实验结果：

Cyclosporin T对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用测试结果见表。表1显示为Cyclosporin T对植物病原真菌的抑制作用 (EC₅₀,μg/mL)。从表1可见Cyclosporin T对供试的多种植物病原真菌的菌丝生长都表现出很好的抑菌活性，对四种植物病原菌活性（EC₅₀值范围为0.78-6.25 μg/mL）均好于阳性对照药物甲基托布津（EC₅₀值范围为≥50.0μg/mL）和多菌灵（EC₅₀值范围为≥2.70μg/mL）。

。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.环孢菌素T，其特征在于，结构式如式（Ⅰ）所示：

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2.根据权利要求1所述的环孢菌素T，其特征在于，所述环孢菌素T是由青海的麦宾草（Elymus tangutorum）中分离得到的Epichloë bromicola内生真菌的代谢产物。

3.根据权利要求1所述的环孢菌素T的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）先将Epichloë bromicola内生真菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，置于恒温箱摇床上培养，培养温度为27℃，培养时间为7天，得到Epichloë bromicola内生真菌悬浮液，接种量为从马铃薯葡萄糖琼脂培养基挑取0.5 cm²的琼脂块；

2）将步骤1）得到的摇床培养后Epichloë bromicola内生真菌悬浮液，接种于100个1000 mL的锥形瓶中，每瓶内含有100 g大米培养基，于27℃的恒温箱内培养30天；接种量为每个锥形瓶接3.0 mL悬浮液，悬浮液孢子浓度为1×10⁶个孢子/mL；每瓶大米培养基含水量为160mL蒸馏水；

3）以乙酸乙酯萃取步骤2）得到的培养Epichloë bromicola内生真菌的大米培养基，得到粗浸膏；

4）将步骤3）得到的粗浸膏以氯仿-甲醇作溶剂过硅胶柱子，柱子规格为外径6cm，内径5.3cm，长45.7cm，再以葡聚糖凝胶色谱分离得到环孢菌素T。

4.根据权利要求3所述的环孢菌素T的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，马铃薯葡萄糖液体培养基的制备方法为：每200g土豆，加入1000ml蒸馏水，煮开后再煮沸30min，将煮液用纱布过滤于烧杯中，在滤汁中补足水分至1000ml，重新倒入锅中，加入20g蔗糖即可。

5.根据权利要求1所述的环孢菌素T在牧草抗性检测中的应用。

6.根据权利要求1所述的环孢菌素T在抑制植物病原真菌中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物病原真菌为细交链孢、小麦离蠕孢病菌、燕麦镰孢病菌和新月弯孢霉。