CN102972446A

CN102972446A - 小卷蛾斯氏线虫的制备方法

Info

Publication number: CN102972446A
Application number: CN2012104805072A
Authority: CN
Inventors: 梁洪柱; 田会鹏; 陈倩; 李学燕
Original assignee: BEIJING XISHAN EXPERIMENT FOREST FARM
Current assignee: BEIJING XISHAN EXPERIMENT FOREST FARM
Priority date: 2012-11-22
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2013-03-20

Abstract

本发明提供一种小卷蛾斯氏线虫的制备方法，小卷蛾斯氏线虫隶属于尾感器纲小杆目斯氏线虫科，是害虫生物防治中应用最广泛、最具潜力的昆虫病原线虫之一。昆虫病原线虫的体内带有共生细菌，随线虫进入昆虫体内，造成昆虫败血症而死亡，对钻蛀和土栖等隐蔽性害虫的防治表现出独特优势和良好的防治效果。

Description

小卷蛾斯氏线虫的制备方法

技术领域

本发明涉及一种小卷蛾斯氏线虫的制备方法，其用于防治隐蔽性害虫（例如钻蛀和土栖），属于林木害虫生物防治领域。

背景技术

钻蛀和土栖等隐蔽性害虫是重要的农林害虫种类，并随着农业结构调整其危害的严重性日益突出。该类害虫的栖息和危害部位隐蔽、为害周期长、种群一旦建立就能稳定增长，而目前又缺乏行之有效的防治方法，因此成为国际上公认的难于防治的重大害虫种类。目前生产中以一些高毒、高残留的化学药剂防治为主，但往往因其隐蔽性的生活特征而难于取得理想的效果。另一方面，长期单纯使用化学农药导致目标害虫抗药性迅速增强、次要害虫上升爆发成灾，同时引起生态平衡破坏、环境污染等一系列问题，并严重影响农林产品生产安全。随着人们环境保护和可持续发展意识的不断提高，对无公害、绿色农产品的需求日益迫切，生物防治作为害虫综合治理的一种重要手段受到越来越多的重视。

昆虫病原线虫作为一类重要的新型杀虫剂，对隐蔽性害虫的防治表现出独特优势和良好的商业前景。昆虫病原线虫寄主范围较广，对寄主具有主动搜索能力，特别是对栖息和危害部位比较隐蔽的如土栖性和钻蛀性害虫具有独特的防治优势；可人工大量培养；对人、畜、环境安全。其体内带有共生细菌，随线虫进入昆虫体内，造成昆虫败血症而死亡。在工业化国家昆虫病原线虫制剂占生物农药市场销售额的13%，仅次于苏云金杆菌产品。澳大利亚、美国、德国、荷兰、加拿大等国家的数十家商业化公司均可提供昆虫病原线虫供实际应用。广泛用于农林、牧草、花卉、和卫生等重要害虫。自1985年由中国农科院生防所从澳大利亚引进大量离体培养昆虫病原线虫技术以来，我国已成功用于对桃小食心虫(Carposina onens)、小木蠢蛾(Holcocerusinsularis)等多种林业害虫的防治，其中防治苹果园桃小食心虫的面积已超过7000公顷，取得了明显的经济效益和社会效益。

但目前的大量繁殖技术和依赖于低温的贮存技术使昆虫病原线虫生产成本过高，而限制了它对害虫控制作用的充分发挥和进一步的推广应用，同时也使昆虫病原线虫的生产规模滞留于中试和商业小量生产阶段，因此昆虫病原线虫大量繁殖技术和常温贮存技术的研究具有重要的科学意义和应用价值。

发明内容

本发明涉及一种小卷蛾斯氏线虫成品的制备方法：将小卷蛾斯氏线虫制成微胶囊的形式。

本发明通过如下技术方案实现：

一种小卷蛾斯氏线虫成品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将线虫悬浮液和I液混合，将所述混合液滴入II液，静置后，从II液中滤出微胶囊，其中所述的I液包括：10%甘油、0.075%福尔马林、2%海藻糖、余量为蒸馏水；所述的II液包括：10%甘油、0.075%福尔马林、0.5%CaCl₂、余量为蒸馏水。所述的线虫悬浮液是将线虫加入适量水中配成的。

根据本发明，还提供一种小卷蛾斯氏线虫成品的制备方法，其特征在于，包括将线虫悬浮液和I液混合，将线虫的浓度调至1×10⁴IJs/ml—3×10⁴IJs/ml（优选1.5-2×10⁴IJs/ml），将所述线虫悬浮液和I液的混合液以100-130滴/min（优选110-120滴/min）的速度滴入II液，静置（优选20-60分钟，优选30-40分钟）后，用筛网将成型的微胶囊从II液中滤出。

根据本发明，优选地，所述方法包括将所述混合液悬于II液上方10cm左右。其中优选所述的线虫悬浮液的浓度≥2×10⁴IJs/ml。

根据本发明，上述小卷蛾斯氏线虫成品的制备方法中使用的小卷蛾斯氏线虫可以通过任何方法获得。

根据本发明，上述小卷蛾斯氏线虫成品的制备方法中使用的小卷蛾斯氏线虫可以通过本发明中的大量繁殖方法获得。本发明进一步提供一种小卷蛾斯氏线虫的大量繁殖方法，其特征在于，所述方法包括，将线虫共生菌接入培养液中培养，将所述经培养的线虫共生菌菌液接入装在不锈钢培养盒中的固态培养基中培养，再接入线虫悬浮液，培养线虫，并收获线虫，其中所述的线虫悬浮液是将线虫加入适量水中配成的。

根据本发明，所述线虫悬浮液的浓度≥2×10⁴IJs/ml。

优选的，所述不锈钢培养盒为长方体，特别优选长35cm，宽25cm，高20cm。

根据本发明，一种小卷蛾斯氏线虫的大量繁殖方法，其特征在于，所述方法包括，将线虫共生菌接入培养液中培养，将所述经培养的线虫共生菌菌液以0.1ml/g的量接入装在不锈钢培养盒中的线虫固态培养基中，在25±1℃培养3-5天后，接入线虫悬浮液，黑暗静置培养（优选25℃），定期取样检测线虫发育进程，培养3周后收获线虫。

根据本发明，所述线虫共生菌菌液优选由如下方法制备：将线虫共生菌（优选单个菌落），接入培养液，培养，优选在振荡下培养（如160rpm），培养温度优选25-28℃，培养时间优选24-48h。

根据本发明，所述线虫共生菌优选为活化的线虫共生菌，优选采用如下的方法活化线虫共生菌：将线虫共生菌菌种在培养基上活化，优选在25℃下培养1-2天。

所述固态培养基优选包括：黄豆粉10-30%，面粉5-20%，蛋黄粉0.5-5%，蛋白陈0.5-2%，酵母膏0.5-5%，海绵5-20%，余量为蒸馏水。

优选地，所述培养基优选为黄豆粉15%，面粉10%，蛋黄粉1%，蛋白陈1%，酵母膏1%，海绵10%，水62%。

固态培养基优选灭菌后使用，灭菌时间优选40-45分钟，优选在100-140℃（例如121℃）湿热下。

根据本发明，进一步地，将收获的线虫连同固态培养物置于筛网中一起浸泡于装有清水的较大容器中，静置分离（优选0.5-l小时）后，线虫沉降到容器底部，将筛网连同培养物移走，再加入清水反复清洗（优选2-3次），收获清洁的线虫。

本发明通过将小卷蛾斯氏线虫制成微胶囊的形式获得稳定的线虫成品，该线虫成品可以实现常温贮存，在常温低湿下贮存保质期可达3个月以上，湿度提高则保质时间延长。如果冷藏保存（4℃-8℃），则保质期为六个月。

附图说明

图1是线虫生产工艺流程图。

其中包括如下步骤：

共生菌活化，共生菌培养，固态培养基的共生菌接种，固态培养基的线虫接种（种管，种瓶），线虫培养，线虫清洗收获，线虫储存。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于实施例。任何对本发明做出的改进和变化，都在本发明的保护范围之内。

一、小卷蛾斯氏线虫的大量繁殖方法

1、常用培养基配方

菌种培养基配方：营养琼脂45g，水1000ml；

鉴别培养基配方：营养琼脂18g，溴百里酚兰0.01g，蒸馏水400ml。

固态培养基：黄豆粉15%，面粉10%，蛋黄粉1%，蛋白胨1%，酵母膏1%，海绵10%，水62%。

2、线虫共生菌菌种制备

线虫共生菌为杆状细菌，线虫共生菌在上述菌种培养基平板上为白色菌落，生长初期菌落不规则，有芳香气味。在鉴别培养基上为蓝色菌落。

2.1、菌种的活化

将线虫共生菌菌种在鉴别培养基平板上划线活化，在25℃下培养1-2天备用。

2.2、摇瓶菌液的制备

摇瓶培养液配方：牛肉浸膏3g，氯化钠10g，pH 7.4-7.6。

500m1三角瓶中摇瓶培养液的装液量为250ml，以接种环挑取鉴别培养基平板上活化的单个蓝色菌落，接入摇瓶培养液。于25-28℃下160rpm振荡培养24-48h，得到共生菌菌液。

3、线虫种管制备

小卷蛾斯氏线虫(Steinernema carpocapsae)隶属于线虫动物门，侧尾腺纲，小杆目，斯氏线虫科。线虫显微形态：体表角质层光滑或有环纹。口腔无口针、口腔壁由分开或融合的杆体组成。收获的侵染期幼虫体外有鞘。体长438-650μm，体宽20-30μm。

用菌种培养基制备试管斜面培养基，冷却后每管中加入2-3头湿热灭菌的大蜡螟，同时加入3-4块灭菌的固态培养基，接共生菌菌液适量，以不见明水为宜，25℃培养3天后加入无菌的线虫。培养三周后冰箱4℃保存。

4、固态培养接种及培养

4.1、固态发酵培养基

黄豆粉15%，面粉10%，蛋黄粉1%，蛋白胨1%，酵母膏1%，海绵10%，水62%。

4.2、固态发酵容器、装量及灭菌

不锈钢培养盒，长35cm，宽25cm，高20cm，侧面靠上部处开突出圆口，装入1000-1200g固态培养基，培养基含水量为63%，以纱布封口，121℃湿热灭菌40-45min。

4.3、线虫和共生菌接种

将上述制备的摇瓶菌液以0.1ml/g的量接入上述配置好的固态培养基中，在25℃培养3天后，接入线虫悬浮液（将线虫加入适量水中），25℃黑暗静置培养，定期取样检测线虫发育进程，培养3周后收获线虫。以休眠期线虫比例占到总比例的95%左右为收获标准。

5、线虫清洗与回收

将收获的线虫连同固态培养物置于筛网中一起浸泡于装有清水的较大容器中，静置分离0.5-l小时后，线虫沉降到容器底部，将筛网连同培养物移走，再加入清水反复清洗2-3次。收获清洁的线虫。

二、小卷蛾斯氏线虫的成品的制备方法和质量标准

1、小卷蛾斯氏线虫的成品的制备

线虫悬浮液：将收获的线虫加入适量清水配成线虫悬浮液，线虫浓度≥2×10⁴IJs/ml。

I液配置：10%甘油、0.075%福尔马林、2%海藻糖，余量为蒸馏水；

II液配置：10%甘油、0.075%福尔马林、0.5%CaCl₂，余量为蒸馏水。

将I液和线虫悬浮液混合，将线虫浓度调至2×10⁴IJs/ml线虫。将I液与线虫的混合液悬于II液上方10cm左右以120滴/min的速度滴入II液，静置40min后，用筛网将成型的微胶囊从II液中滤出。

2、成品的质量标准

整齐度：将线虫悬浮液浓度稀释至100-200IJs/ml，在解剖境下对线虫的侵染期线虫的比例进行检测，以达到95%左右为整齐度的标准；

侵染力：以大蜡螟老熟幼虫作为侵染对象，侵染率在7-10%左右线虫的质量较好。

3、产品储存及保质期

常温低湿下贮存保质期达3个月以上，湿度提高则保质时间延长。冷藏保存（4℃-8℃），保质期为六个月。

Claims

1.一种小卷蛾斯氏线虫成品的制备方法，将小卷蛾斯氏线虫制成微胶囊。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将线虫悬浮液和I液混合，将所述混合液滴入II液，静置后，从II液中滤出微胶囊，其中所述的I液包括：10%甘油、0.075%福尔马林、2%海藻糖、余量为蒸馏水；所述的II液包括：10%甘油、0.075%福尔马林、0.5%CaCl₂、余量为蒸馏水，所述的线虫悬浮液是将线虫加入水中配成。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将线虫悬浮液和I液混合，将线虫的浓度调至1×10⁴IJs/ml-3×10⁴IJs/ml（优选1.5-2×10⁴IJs/ml），将所述线虫悬浮液和I液的混合液以100-130滴/min（优选110-120滴/min）的速度滴入II液，静置（优选20-60分钟，优选30-40分钟）后，用筛网将成型的微胶囊从II液中滤出。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，其中所述小卷蛾斯氏线虫是由如下繁殖方法获得的：将线虫共生菌接入培养液中培养，将所述培养的线虫共生菌菌液接入装在不锈钢培养盒中的固态培养基中培养，再接入线虫悬浮液，培养线虫，收获线虫。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述不锈钢培养盒为长方体，优选长35cm，宽25cm，高20cm。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，其中所述小卷蛾斯氏线虫是由如下繁殖方法获得的：将线虫共生菌菌液以0.1ml/g的量接入装在不锈钢培养盒中的线虫固态培养基中，在25±1℃培养3d-5d后，接入线虫悬浮液，黑暗静置培养（优选25℃），定期取样检测线虫发育进程，培养3周后收获线虫。

7.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述线虫共生菌菌液由如下方法制备：将线虫共生菌（优选单个菌落），接入培养液，培养，优选在振荡下培养（如160rpm），培养温度优选25-28℃，培养时间优选24-48h。

8.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述线虫共生菌为活化的线虫共生菌，优选采用如下的方法活化共生菌：将共生菌菌种在培养基上活化，优选在25℃下培养1-2天。

9.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述固态培养基包括：黄豆粉，面粉，蛋白陈，酵母膏，海绵，水。

10.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其特征在于，将收获的线虫连同固态培养物置于筛网中一起浸泡于装有清水的较大容器中，静置分离（优选0.5-1小时）后，线虫沉降到容器底部，将筛网连同培养物移走，再加入清水反复清洗（优选2-3次），收获清洁的线虫。