CN105815277B - 一种昆虫病原线虫的固体培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种昆虫病原线虫的固体培养方法，其特征在于：具体步骤包括：(a)制备菌种培养基，将昆虫病原线虫的共生细菌活化，将共生细菌接入菌种培养基；(b)共生细菌菌液接入固体培养基；(c)在固体培养基中培养3‑5天后，再接入昆虫病原线虫悬浮液；(d)黑暗静置培养线虫，培养3周后收获线虫。本发明解决了活体培养方法无法规模化生产昆虫病原线虫的问题，并且固体培养方法的生产成本要明显低于液体培养方法，固体培养方法生产的线虫致病力也要明显高于液体培养方法。市场需求量增大，固体培养方法更具发展前景，对昆虫病原线虫的规模化生产和对地下害虫的生物防治具有非常重要的意义。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物繁殖培养的技术领域，特别是昆虫病原线虫的固体培养方法的技术领域。
【背景技术】
地下害虫，指的是一生或一生中某个阶段生活在土壤中危害植物地下部分、种子、幼苗或近土表主茎的杂食性昆虫。地下害虫是农作物的大敌，危害种子、幼芽、根茎，造成缺苗，甚至毁种，导致农作物减产，尤以蛴螬、蝼蛄、地老虎、金针虫的危害最为严重。
目前，地下害虫防治仍以化学杀虫剂为主，但效果不够理想，且易造成环境污染、威胁人体健康等负面影响。通过高毒化学农药或加大农药施用量来控制地下害虫，不仅导致其抗药性大幅度提高，还严重影响农作物的品质。因此，在农药污染日益严重、地下害虫抗药性发展迅速的今天，昆虫病原线虫已成为可持续发展农业的迫切需要，受到国际生防领域的重视，特别是斯氏科线虫和异小杆科线虫，已成为当前国际生防领域研究热点之一。
昆虫病原线虫是昆虫的专化性寄生天敌，是以昆虫为寄主的致病性线虫，一般专指斯氏线虫科和异小杆线虫科两类。昆虫病原线虫肠道内携带共生细菌，它们互惠共生，作为昆虫的“蛔虫”与其体内专化性携带的共生细菌一起致死寄主昆虫。它们搜索寄主能力强，侵染致死有效性高，起效时间快，对人畜、天敌、环境安全，是一类重要的害虫生物防治因子，已广泛应用于防治蛴螬、蝼蛄、地老虎、金针虫等多种地下害虫。
昆虫病原学线虫的培养主要分为活体培养和离体培养，离体培养又分为固体培养和液体培养。
离体培养技术的发展，是提高线虫产量和规模的基础。固体培养方法通过无菌操作技术，在人工培养基中接种共生细菌和单菌线虫一级种后进行大量培养，能够提高侵染期线虫产量，降低生产成本，并且生产的侵染期线虫具有很好的致病力，对昆虫病原线虫的规模化生产和对地下害虫的生物防治具有非常重要的意义。
【发明内容】
本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种昆虫病原线虫的固体培养方法，能够提高侵染期线虫产量，降低生产成本，发展前景好，对昆虫病原线虫的规模化生产和对地下害虫的生物防治具有非常重要的意义。
为实现上述目的，本发明提出了一种昆虫病原线虫的固体培养方法，具体步骤包括：
(a)制备菌种培养基，准备将昆虫病原线虫的共生细菌活化，将活化的共生细菌接入菌种培养基中进行培养；
(b)制备共生细菌菌液，将培养的共生细菌菌液接入装在不锈钢培养盒中的固体培养基中培养；
(c)24℃～26℃条件下，共生细菌菌液在固体培养基中培养3-5天后，再接入昆虫病原线虫悬浮液；
(d)昆虫病原线虫悬浮液在24℃～26℃条件下，黑暗静置培养线虫，培养3周后收获线虫，将线虫连同固体培养物置于筛网中一起浸泡于装有清水的较大容器中，静置分离，再加入清水反复清洗。
作为优选，所述(a)步骤中，共生细菌为活化的昆虫病原线虫共生细菌，将共生细菌菌种在菌种培养基中活化，25℃条件下培养1～2天。
作为优选，所述(a)步骤中，菌种培养基，采用LB培养基，LB培养基组分为：蛋白胨1％，氯化钠0.5％，酵母0.5％，水98％。
作为优选，所述(b)步骤中，共生细菌菌液的制备方法，将线虫共生细菌(优选单个菌落)，接入到菌种培养基培养，在振荡下培养，振荡转速160rpm，培养温度24℃～26℃，培养时间1～2天。
作为优选，所述(b)步骤中，不锈钢培养盒为长方体，不锈钢培养盒尺寸为长50cm，宽40cm，高10cm。
作为优选，所述(b)步骤中，固体培养基采用的配方为：黄豆粉15％，面粉10％，蛋黄粉1％，蛋白胨1％，植物油1％，酵母1％，海绵10％，水61％，固体培养基灭菌后使用，灭菌时间45分钟，灭菌在100～140℃湿热环境下进行。
作为优选，所述(c)步骤中，昆虫病原线虫悬浮液是指由水，以及分散于水中的昆虫病原线虫构成的混合物。
作为优选，所述(d)步骤中，静置分离时间1小时，线虫沉降到容器底部，将筛网连同固体培养物移走，清洗3～4次，收获清洁的线虫。
本发明的有益效果：本发明采用的昆虫病原线虫固体培养方法解决了活体培养方法无法规模化生产昆虫病原线虫的问题，并且固体培养方法的生产成本要明显低于液体培养方法，固体培养方法生产的线虫致病力也要明显高于液体培养方法。因此，当市场需求量增大，固体培养方法更具发展前景，对昆虫病原线虫的规模化生产和对地下害虫的生物防治具有非常重要的意义。
本发明的特征及优点将通过实施例进行详细说明。
【具体实施方式】
本发明一种昆虫病原线虫的固体培养方法，具体步骤包括：
步骤一、制备菌种培养基，准备将昆虫病原线虫的共生细菌活化，将活化的共生细菌接入菌种培养基中进行培养；
步骤二、制备共生细菌菌液，将培养的共生细菌菌液接入装在不锈钢培养盒中的固体培养基中培养；
步骤三、24℃～26℃条件下，共生细菌菌液在固体培养基中培养3-5天后，再接入昆虫病原线虫悬浮液；
步骤四、昆虫病原线虫悬浮液在24℃～26℃条件下，黑暗静置培养线虫，培养3周后收获线虫，将线虫连同固体培养物置于筛网中一起浸泡于装有清水的较大容器中，静置分离，再加入清水反复清洗。
所述(a)步骤中，共生细菌为活化的昆虫病原线虫共生细菌，将共生细菌菌种在菌种培养基中活化，25℃条件下培养1～2天。所述(a)步骤中，菌种培养基，采用LB培养基，LB培养基组分为：蛋白胨1％，氯化钠0.5％，酵母0.5％，水98％。所述(b)步骤中，共生细菌菌液的制备方法，将线虫共生细菌(优选单个菌落)，接入到菌种培养基培养，在振荡下培养，振荡转速160rpm，培养温度24℃～26℃，培养时间1～2天。所述(b)步骤中，不锈钢培养盒为长方体，不锈钢培养盒尺寸为长50cm，宽40cm，高10cm。所述(b)步骤中，固体培养基采用的配方为：黄豆粉15％，面粉10％，蛋黄粉1％，蛋白胨1％，植物油1％，酵母1％，海绵10％，水61％，固体培养基灭菌后使用，灭菌时间45分钟，灭菌在100～140℃湿热环境下进行。所述(c)步骤中，昆虫病原线虫悬浮液是指由水，以及分散于水中的昆虫病原线虫构成的混合物。所述(d)步骤中，静置分离时间1小时，线虫沉降到容器底部，将筛网连同固体培养物移走，清洗3～4次，收获清洁的线虫。
本发明通过固体培养方法获得的昆虫病原线虫产品，需要冷藏保存(4～10℃)，保质期为6个月。
实施例：
1、培养基配方：
菌种培养基配方：蛋白胨1g，氯化钠0.5g，酵母0.5g，水980ml。
2、线虫共生细菌菌种的活化
将线虫共生细菌接入菌种培养基上进行活化，在25℃下培养1～2天
3、共生细菌菌液的制备
将活化的线虫共生细菌(优选单个菌落)，接入500ml的摇瓶培养液，在25±1℃条件下，在以160rpm振荡培养1～2天，得到共生细菌菌液。
4、固体培养基制备
按照固体培养基配方制备固体培养基，固体培养基配方如下：黄豆粉15％，面粉10％，蛋黄粉1％，蛋白胨1％，植物油1％，酵母1％，海绵10％，水61％。
5、固体培养容器、装量和灭菌
不锈钢培养盒：长50cm，宽40cm，高10cm。装入1500g固体培养基，培养基含水量为61％，以纱布封口，100～140℃湿热灭菌45分钟。
6、共生菌和线虫接种
将制备好的共生细菌菌液接入配置好的固体培养基中，在25±1℃下培养3～5天，接入线虫悬浮液，在25±1℃下黑暗静置下培养线虫，培养3周后收获线虫。
7、线虫清洗和收获
将线虫连同固体培养物置于筛网中一起浸泡于装有清水的较大容器中，静置分离1小时后，线虫沉降到容器底部，将筛网连同固体培养物移走，再加入清水反复清洗3～4次，收获清洁的线虫。
8、线虫储存
将收获的线虫注入海绵碎块中，在4～10℃下进行冷藏储存。
本发明达到的技术效果
1、线虫产品的质量标准
整齐度：将线虫悬浮液浓度稀释至100IJs/ml，在解剖镜下对线虫的侵染期线虫的比例进行检测，本发明生产的线虫能达到95％以上。
致病力：以黄粉虫作为侵染对象，在25±1℃下对黄粉虫侵染96个小时，黄粉虫的死亡率可以达到80％以上。
存活率：成品线虫包装为海绵剂包装，带有保温材料，线虫的存活率可以达到90％以上。
2、线虫产品的储存和保质期
通过冷藏保存(4-10℃)，保质期可达6个月。
本发明采用的昆虫病原线虫固体培养方法解决了活体培养方法无法规模化生产昆虫病原线虫的问题，并且固体培养方法的生成成本要明显低于液体培养方法，固体培养方法生产的线虫致病力也要明显高于液体培养方法。因此，当市场需求量增大，固体培养方法更具发展前景，对昆虫病原线虫的规模化生产和对地下害虫的生物防治具有非常重要的意义。
上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种昆虫病原线虫的固体培养方法，其特征在于：具体步骤包括：
(a)制备菌种培养基，准备将昆虫病原线虫的共生细菌活化，将活化的共生细菌接入菌种培养基中进行培养；所述(a)步骤中，菌种培养基，采用LB培养基，LB培养基组分为：蛋白胨1％，氯化钠0.5％，酵母0.5％，水98％；
(b)制备共生细菌菌液，将培养的共生细菌菌液接入装在不锈钢培养盒中的固体培养基中培养；固体培养基采用的配方为：黄豆粉15％，面粉10％，蛋黄粉1％，蛋白胨1％，植物油1％，酵母1％，海绵10％，水61％，固体培养基灭菌后使用，灭菌时间45分钟，灭菌在100～140℃湿热环境下进行；
(c)24℃～26℃条件下，共生细菌菌液在固体培养基中培养3-5天后，再接入昆虫病原线虫悬浮液；
(d)在24℃～26℃条件下，黑暗静置培养线虫，培养3周后收获线虫，将线虫连同固体培养物置于筛网中一起浸泡于装有清水的较大容器中，静置分离，再加入清水反复清洗。
2.如权利要求1所述一种昆虫病原线虫的固体培养方法，其特征在于：所述(b)步骤中，不锈钢培养盒为长方体，不锈钢培养盒尺寸为长50cm，宽40cm，高10cm。
3.如权利要求1所述一种昆虫病原线虫的固体培养方法，其特征在于：所述(c)步骤中，昆虫病原线虫悬浮液是指由水，以及分散于水中的昆虫病原线虫构成的混合物。
4.如权利要求1所述一种昆虫病原线虫的固体培养方法，其特征在于：所述(d)步骤中，静置分离时间1小时，线虫沉降到容器底部，将筛网连同固体培养物移走，清洗3～4次，收获清洁的线虫。
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