CN101157893A - 规模化昆虫病原线虫活体高倍培殖方法 - Google Patents

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刘洪家
王玉玺
陈祥伟
解运杰
于泽波
马光波
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Abstract

本发明属于林业生产技术领域。是一种规模化昆虫病原线虫活体高倍培殖方法。改目前的离体繁殖为活体繁殖，明显提高了对农业害虫的致病能力，并且产量与效率较高，成本低，质量好，防治效果明显提升。本发明的使用材料分布广，价格便宜，可降低成本。广泛应用于林木、果树、观赏园林等隐蔽性害虫防治和盆栽作物、经济作物等地下害虫防治上，本发明将进一步提高昆虫病原线虫产量和质量，促进我国生物防治的发展。

Description

规模化昆虫病原线虫活体高倍培殖方法
技术领域
本发明属于林业生产技术领域。是一种规模化昆虫病原线虫活体高倍培殖方法。
背景技术
如今，地下害虫和隐蔽性害虫防治主要采用化学药剂，但是该方法易造成人畜中毒，还会污染环境。并且多次防治成本高，害虫还容易产生抗药性。随着人们对食品安全性要求的提高，以及对化学药剂可能给生态环境带来潜在危机的考虑，筛选可替代化学药剂的生物防治制剂成为迫切需要。当今已筛选出苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)、白僵菌(Beauveria brongniatii)、绿僵菌(Metarhizium anisopliae)等作为生物防治制剂，但防治一些地下害虫和隐蔽性害虫效果不是很理想。而昆虫病原线虫(Entomopathogenic Nematode)是昆虫的专化寄生性天敌。以侵染期虫态(即三龄线虫IJ)随寄主食物或从昆虫的肛门、气孔、节间膜进入昆虫体内，随后释放其携带的共生细菌，这些共生细菌迅速繁殖，使寄主昆虫患败血症于48小时之内死亡。昆虫病原线虫是一种很有潜能的生物防治因子。当今世界上有许多国家，如美国、澳大利亚、新西兰、德国、埃及等国家都投入大量的人力、物力研究利用这种线虫，致力于将线虫产品销售到世界各地。1994年据Lisansky&Coombs统计，在发达国家的生物农药市场中，昆虫病原线虫这种新型杀虫剂的市场销售额仅次于工业苏云金芽胞杆菌，已经成功地应用于防治林木、果树、观赏园林等隐蔽性害虫和盆栽作物、经济作物、蔬菜和牧草、草坪等地下害虫。所以昆虫病原线虫这种新型生物杀虫剂具有广阔的应用前景，但所用线虫数量极少，不能满足市场需求。
因为昆虫病原线虫能够大量培养繁殖，所以可以将其推广应用。虽然传统的White trap法繁殖得到的线虫侵染力较高，但其规模远远满足不了当今市场的需求，广东昆虫研究所韩日畴采用人工离体繁殖的方法，美国生产线虫的发酵罐已从5升、20升到Biosys公司生产斯氏线虫15000升，生产异小杆线虫7500升的规模，虽然线虫产量较高，但其致病力有所下降。
发明内容
本发明的目的是提供一种规模化昆虫病原线虫活体高倍培殖方法，是规模化大量高倍活体繁殖昆虫病原线虫，达到林业生产实践中生物防治虫害的良好效果。本发明的关键技术是对已有的离体繁殖，改为活体繁殖，使线虫对林业害虫的致病力明显增强，并且产量与效率较高，成本低，质量好，防治效果明显提升。
本发明采用培养介质接种侵染期线虫后与寄主昆虫混合装入繁殖袋中，将繁殖袋置于恒温培养箱中培养，对培养参数进行优化，将得到大量的昆虫病原线虫。
a.介质与繁殖袋质地筛选：寄主昆虫采用黄粉虫，培养介质选用价格便宜的蛭石。蛭石用自来水浸泡，洗干净，然后在60℃烘箱中烘干至恒重。
侵染前期准备：把1Kg蛭石装在布袋中浸泡在蒸馏水桶中，完全浸泡之后，取出布袋，挂起来，晒干直至布袋上不滴水，再称布袋的重量，计算蛭石含水量，即蛭石完全浸透所需水量。
侵染：将线虫悬液，配成一定浓度的线虫悬浮液。将一定浓度的线虫悬浮液喷在蛭石上，使蛭石完全湿透，没有水溢出为宜。
布袋是17×26cm大小，布料质地有尼龙、纯棉，设侵染每头末龄黄粉虫的异小杆线虫剂量为50条IJ、斯氏线虫100条IJ。结果繁殖袋采用纯棉布制作的线虫产量是尼龙袋的5倍。
b.培养介质不灭菌：寄主昆虫、培养介质处理和侵染剂量同a步，结果培养介质不灭菌的线虫产量高于灭菌的1.25倍，所以考虑到繁殖效率培养介质不必灭菌。
c.繁殖袋不用翻动：寄主昆虫、培养介质处理和侵染剂量同a步，结果繁殖袋翻动与不翻动的线虫产量相当，所以繁殖袋也不必翻动。
d.侵染剂量筛选：寄主昆虫与培养介质混合比例、收获时间、繁殖袋大小进行正交组合试验，寄主昆虫和培养介质处理同a步，结果寄主昆虫(黄粉虫)与培养介质(蛭石)混合比例是三比二；异小杆线虫侵染剂量是800条侵染期线虫/克黄粉虫(斯氏线虫侵染剂量是1600条侵染期线虫/克黄粉虫)；繁殖袋大小选用17×26cm；异小杆线虫的收获时间是培养12天时开始收获，将布袋浸泡并收获5次，培养15天时再次收获，将布袋浸泡并收获3次(斯氏线虫的收获时间是培养10天时开始收获，将布袋浸泡并收获5次，培养13天时再次收获，将布袋浸泡并收获3次)；
e.收获方法优化：收获后将线虫悬浮液沉淀，移去上清液后再用放在瓷盘上的面巾纸过滤除去杂质，可保持线虫原有的致病力，并且寿命比不过滤储存的线虫延长6倍。
f.规模化生产：选择以上筛选出的最佳培养参数，将繁殖袋悬挂在25℃装有空调的房间里，每天观察悬在繁殖袋上的弹簧秤的读数，以监控繁殖袋的失水量，当失水达到50％时，应用蒸馏水喷湿布袋。最终获取繁殖倍数高、质量好的线虫。
g.所用仪器设备：DHP-9162A恒温培养相(天津泰斯特)、30405359相差显微镜(麦克奥迪)、S633069冷光源解剖镜(麦克奥迪)、Z18400微量移液器(上海)。
具体实施方式
本发明是黑龙江省科技厅科技攻关项目：“丘陵黑土区水土保持林构建与流域综合治理技术研究”(编号GA06B302-3)中的部分内容。我们于2006年3月至2007年6月在黑龙江省水土保持科学研究所二龙山生态试验站按以上步骤进行了规模化试验性生产，供试树种3个，分别是小黑杨、樟子松、落叶松。所有苗木均为1年生实生苗。生产中获取了昆虫病原线虫活体最佳高倍繁殖方法的成功，可解决线虫数量少不能应用于生产实践的难题，经过试验防治地下害虫效果达到80％以上，既获得了经济效益，又获得了生态效益。
本发明的使用材料分布广，价格便宜，可降低成本。广泛应用于盆栽作物、经济作物、蔬菜、牧草、草坪等地下害虫防治和果树、观赏园林等林木上隐蔽性害虫防治，本发明将进一步提高昆虫病原线虫的产量和质量，促进我国生物防治的发展。

Claims (1)

1.一种规模化生产昆虫病原线虫活体高倍培殖方法，其特征在于改目前的离体繁殖为活体繁殖，其步骤如下：
a.介质与繁殖袋质地筛选：寄主昆虫采用黄粉虫，培养介质选用价格便宜的蛭石，蛭石用自来水浸泡，洗干净，然后在60℃烘箱中烘干至恒重；
侵染前期准备：把1Kg蛭石装在布袋中浸泡在蒸馏水桶中，完全浸泡之后，取出布袋，挂起来，晒干直至布袋上不滴水，再称布袋的重量，计算蛭石含水量，即蛭石完全浸透所需水量；
侵染：将线虫悬液，配成一定浓度的线虫悬浮液，将一定浓度的线虫悬浮液喷在蛭石上，使蛭石完全湿透，没有水溢出为宜；
布袋是17×26cm大小，布料质地选用纯棉，设侵染每头末龄黄粉虫的异小杆线虫剂量为50条IJ、斯氏线虫100条IJ；
b.培养介质不灭菌；
c.繁殖袋不用翻动；
d.侵染剂量筛选：寄主昆虫与培养介质混合比例、收获时间、繁殖袋大小进行正交组合试验，寄主昆虫和培养介质处理同a步，寄主昆虫(黄粉虫)与培养介质(蛭石)混合比例为三比二；异小杆线虫侵染剂量是800条侵染期线虫/克黄粉虫或斯氏线虫侵染剂量是1600条侵染期线虫/克黄粉虫；繁殖袋大小选用17×26cm；异小杆线虫的收获时间是培养12天时开始收获，将布袋浸泡并收获5次，培养15天时再次收获，将布袋浸泡并收获3次，斯氏线虫的收获时间是培养10天时开始收获，将布袋浸泡并收获5次，培养13天时再次收获，将布袋浸泡并收获3次；
e.收获方法优化：收获后将线虫悬浮液沉淀，移去上清液后再用放在瓷盘上的面巾纸过滤除去杂质；
f.规模化生产：选择以上筛选出的最佳培养参数，将繁殖袋悬挂在25℃装有空调的房间里，每天观察悬在繁殖袋上的弹簧秤的读数，以监控繁殖袋的失水量，当失水达到50％时，应用蒸馏水喷湿布袋。
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