CN104164472B - 一种茄子抗褐纹病的室内鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于园艺作物抗病性鉴定技术领域，具体涉及一种茄子抗褐纹病的室内鉴定方法。本发明包括茄子的育苗与定植、茄褐纹病菌孢子悬浮液制备、病原菌侵染处理、发病调查等步骤。本发明在室内选用茄子商品果作为鉴定材料，先用自制的十字形刀具在茄果上制造“十”字伤口，再用含茄褐纹病菌孢子悬浮液的滤纸片进行侵染处理，最后进行发病调查，明确了适宜的茄褐纹病菌孢子悬浮液浓度、“十”字伤口的长度和深度。与大田接种相比，避免了气候条件的不适宜、环境中其它病虫害影响等因素，在室内进行抗病性筛选条件容易控制、标准一致、发病迅速、操作简便、结果可靠，可节省大量人力物力，尤其适合大批量的茄子育种材料的褐纹病抗性的鉴定。

Description

一种茄子抗褐纹病的室内鉴定方法

技术领域

本发明属于园艺作物抗病性鉴定技术领域，具体涉及一种茄子抗褐纹病的室内鉴定方法。

背景技术

茄子(SolanummelongenaL.)别名落苏，原产于东南亚、印度，早在公元4-5世纪就传入中国，至今已有1500年左右的历史，是我国春夏季节的主要果菜之一。茄子栽培种分为圆茄、长茄和矮茄三个变种；按果皮颜色划分，包括紫色、白色及绿色三种类型；按熟性划分，包括早熟、中熟和晚熟三种类型。目前全国茄子栽培面积80万hm²，约占世界总栽培面积的50％(吴仁锋，2011)。

褐纹病(吕佩珂等，2008)是茄子上的一种主要病害，也是一种世界性病害，又称干腐病、褐腐病，在我国南北方均普遍发生，从幼苗期到果实采收期均可发病，引起缺苗、枯枝或果实腐烂(吴仁锋，2011)。最为严重的是褐纹病对茄子采种危害甚大，许多田块常因此病的大发生而导致种子严重减产甚至绝收(中国农作物病虫害编辑委员会，1979)。

目前茄子褐纹病的防治手段主要通过栽培和化学防治的方法，但是综合状况并不是十分理想，同时，采用药剂防治褐纹病涉及到成本增加和残留等问题，因此，解决褐纹病危害最经济的措施就是培育高抗褐纹病的品种，筛选抗病品种是有效而又迫切的防控茄子褐纹病的主要方法之一，可极大提高茄子生产的经济效益。抗性资源的获得对于抗病育种意义重大，客观、快速地评价茄子材料抗性的强弱是茄子抗褐纹病育种过程中最基础、最重要的环节。在抗病育种过程中，在室内进行抗病性鉴定环境条件容易控制，发病迅速，操作简便，建立茄子抗褐纹病的室内鉴定方法有利于抗病育种工作的开展，填补国内茄子褐纹病抗病育种研究空白。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种茄子抗褐纹病的室内鉴定方法，与大田接种相比，本发明避免了气候条件的不适宜、环境中其它病虫害影响等因素，在室内进行抗病性筛选条件容易控制、标准一致、发病迅速、操作简便、结果可靠，节省大量人力物力，适合大批量育种材料的鉴定。该方法包括茄子育苗与定植、褐纹病菌孢子悬浮液制备、病原菌侵染处理、发病调查等步骤。

本发明通过以下技术方案实现：

一种茄子抗褐纹病的室内鉴定方法，该方法包括以下步骤：

1)茄子育苗与定植

将供试的茄子种子播种在装有灭菌基质的穴盘中，种子萌发出苗后分穴到一穴一株，当茄苗长至3-4片真叶时，移植田间定植，每个品种栽种40株，定植后按常规施肥和灌水，期间不使用任何药剂，待茄子结果后田间采收商品茄果到室内进行离体人工接种；

2)茄褐纹病菌孢子悬浮液制备

茄褐纹病菌病样采自武汉市蔬菜科学研究所茄子试验基地，发明人自行分离获得茄褐纹病菌HZ-4，PhomopsisvexansHZ-4，该菌株已于2014年7月3日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCCNO：M2014313。

将茄褐纹病菌HZ-4菌株接种至PDA平板上，将该PDA平板置于25℃黑暗培养9-11d至产生黑色分生孢子器，用消过毒的镊子取分生孢子器并用消过毒的玻片碾压使之散出分生孢子，用无菌水冲洗，经充分震荡使孢子释放出来，静置片刻，取上清，用显微镜观察分生孢子量，显微观察方法为(目镜10×，物镜10×)每个视野观察18-22个孢子，将剪好的5mm×5mm的滤纸片放入茄褐纹病菌孢子悬浮液中，充分浸湿备用，得到含茄褐纹病菌孢子悬浮液的滤纸片；

3)病原菌侵染处理

取大小一致的成熟茄果，用消过毒的自制的十字形刀具(见图2)在健康无病的茄果上划5mm长2mm深的“十”字伤口，然后取步骤2)的含茄褐纹病菌孢子悬浮液的滤纸片贴在茄果“十”字伤口处作病原菌侵染处理，将侵染后的茄果统一平放在塑料盒内，用喷壶喷水至未见明显水滴下流，用保鲜膜覆盖，在25-28℃条件下保湿培养，5d后开始调查；同时将对照的茄果划“十”字伤口后只接种无菌水；

各品种接种7-8个茄果，在每个果实的果肩至果脐部随机划“十”字伤口10个以上，相邻两个伤口之间留足足够的发病空间；

4)发病调查

接种后第5d开始调查，记录各处理的发病情况；待各处理的病情基本稳定、无新病斑出现时，停止调查，统计其病果率及发病点数，评价各品种对褐纹病的抗性水平；

茄子对褐纹病的抗性标准：免疫(IM)：发病率为0，高抗(HR)：0<发病率≤20％，抗病(R)：20％<发病率≤40％，耐病(MR)：40％<发病率≤60％，感病(S)：60％<发病率≤100％

其中步骤1)中基质配方为：草炭土、蛭石和田园土按体积比1：1：1混合，用福尔马林消毒。

所述的用于侵染处理的茄果为成熟的商品果；所述的茄褐纹病菌孢子悬浮液的制备方法为病菌在PDA平板上25℃黑暗培养9-11天至产生黑色分生孢子器，用消毒镊子取分生孢子器用消毒玻片碾压散出分生孢子，用无菌水冲洗，充分震荡使孢子释放出来，静置片刻，取上清，观察分生孢子量，显微观察(目镜10×，物镜10×)每个视野18-22个孢子；所述的病原菌侵染处理是用消毒的自行研制的简易造伤口刀具在健康无病的茄果上划5mm长2mm深“十”字伤口，然后取在孢子悬浮液中充分浸湿的滤纸片贴在“十”字伤口处完成侵染；所述的造伤口刀具属自行研制，刀口“十”字形，长5mm,深2mm，带柄。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明的室内鉴定方法与大田接种方法相比，避免了气候条件的不适宜、环境中其它病虫害影响等因素，在室内进行抗病性筛选条件容易控制、标准一致、发病迅速、操作简便、结果可靠，节省大量人力物力。

2、确定了茄褐纹病菌孢子悬浮液的制备方法为病菌在PDA平板上25℃黑暗培养9-11天至产生黑色分生孢子器，用消毒镊子取分生孢子器用消毒玻片碾压散出分生孢子，用无菌水冲洗，充分震荡使孢子释放出来，静置片刻，取上清，观察分生孢子量，显微观察(目镜10×，物镜10×)每个视野18-22个孢子。

3、确定了病原菌侵染处理方法是用消毒的自行研制的简易造伤口刀具或现有的医用解剖刀片在健康无病的茄果上划5mm长2mm深“十”字伤口，然后取在孢子悬浮液中充分浸湿的滤纸片贴在“十”字伤口处完成侵染。

4、自制了简易造伤口刀具，刀口呈“十”字形，长5mm,深2mm，带柄，避免了造伤口过程中伤口长短不一、深浅不一的情况，确保了伤口大小的一致性，减少了试验误差，提高了工作效率。

附图说明

图1：为实施例1的茄子穴盘育苗图。

图2：为自制简易造伤口十字形刀具示意图。

图3：为实施例1中充分浸湿孢子悬浮液的滤纸片侵染处理茄果图。图中品种为五山三号紫红长茄。

图4：实施例1中不同茄子品种接种本发明的茄褐纹病菌(Phomopsisvexans)HZ-4侵染处理后的发病趋势图。

具体实施方式

实施例1

茄子抗褐纹病的室内鉴定方法，包括以下步骤：

A、茄子育苗与定植

选择不同类型的茄子品种材料作为鉴定对象，这些品种都是现有的栽培品种但不限于这些品种，试验的品种包括：创丰三月茄、黑衣天使早茄F1、鑫大长、美茄一号、精选紫罐茄、白又嫩长白茄子F1、五山三号紫红长茄、渝早茄四号、扬茄一号、四季绿茄霸王(这些茄子品种为市场销售品种，购自武汉蔬菜科技发展总公司种业分公司)。

将供试的茄子种子播种在装有灭菌基质(草炭土、蛭石和田园土按体积比1：1：1混合，用福尔马林溶液消毒)的穴盘中，种子萌发出苗后分穴到一穴一株(见图1)，茄苗长至3-4片真叶时，在田间定植，每个品种40株。定植后进行适期施肥灌水等常规田间管理，期间不使用任何药剂，待茄子结果后田间采收商品果到室内进行离体人工接种。

B、茄褐纹病菌孢子悬浮液制备

将供试的茄褐纹病菌(Phomopsisvexans)HZ-4菌株接种到PDA平板上，在PDA平板上25℃黑暗培养9-11天至产生黑色分生孢子器，用消毒镊子取分生孢子器用消毒玻片碾压散出分生孢子，用无菌水冲洗，充分震荡使孢子释放出来，静置片刻，取上清，观察分生孢子量，显微观察(目镜10×，物镜10×)每个视野18-22个孢子，将剪好的5mm×5mm的滤纸片放入孢子液中，充分浸湿后得到含茄褐纹病菌孢子悬浮液的滤纸片。

C、病原菌侵染处理

取大小一致的成熟商品果，用消毒的自行研制的简易造伤口的十字形刀具(见图2)在健康无病的茄果上划5mm长2mm深“十”字伤口，然后取前述含茄褐纹病菌孢子悬浮液的滤纸片贴在“十”字伤口处进行病原菌侵染处理(图3)，将侵染后的茄果统一平放在塑料盒内，用喷壶喷水至未见明显水滴下流，用保鲜膜覆盖，在25-28℃条件下保湿培养，5d后开始调查。同时设对照，对照茄果划“十”字伤口后接种无菌水。

上述各品种接种7-8个茄果，在每个果实的果肩至果脐部随机划“十”字伤口10个以上，相邻两个伤口之间留足足够的发病空间。

D、发病调查

接种后第5d开始调查，记录各处理的发病情况。待各处理的病情基本稳定、无新病斑出现时，停止调查，统计其病果率及发病点数，评价各品种对褐纹病的抗性水平。

茄子对褐纹病的抗性标准：免疫(IM)：发病率为0，高抗(HR)：0<发病率≤20％，抗病(R)：20％<发病率≤40％，耐病(MR)：40％<发病率≤60％，感病(S)：60％<发病率≤100％。

结果见表1，供试品种在侵染处理后，表现不同程度的发病状况，病果率和病点率有显著差异，不同品种的抗病性呈现明显不同(图4)。

结果表明：江西美茄1号、广东白又嫩长白茄子F1为免疫品种，四川黑衣天使早茄F1、湖北鑫大长为高抗品种，广东五山三号紫红长茄为抗病品种，扬州扬茄1号为耐病品种，广东创丰三月茄、西安精选紫罐茄、重庆渝早茄四号、辽宁四季绿茄霸王为感病品种。

表1不同茄子品种材料抗褐纹病鉴定结果

Claims (2)

1.一种茄子抗褐纹病的室内鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)茄子育苗与定植

将供试的茄子种子播种在装有灭菌基质的穴盘中，种子萌发出苗后分穴到一穴一株，当茄苗长至3-4片真叶时，移植田间定植，每个品种栽种40株，定植后按常规施肥和灌水，期间不使用任何药剂，待茄子结果后田间采收商品茄果到室内进行离体人工接种；

2)茄褐纹病菌孢子悬浮液制备

将保藏号为CCTCCNO：M2014313的茄褐纹病菌(Phomopsisvexans)HZ-4菌株接种至PDA平板上，将该PDA平板置于25℃黑暗培养9-11d至产生黑色分生孢子器，用消过毒的镊子取分生孢子器并用消过毒的玻片碾压使之散出分生孢子，用无菌水冲洗，经充分震荡使孢子释放出来，静置片刻，取上清，用显微镜观察分生孢子量，在目镜10×，物镜10×条件下每个视野观察18-22个孢子，将剪好的5mm×5mm的滤纸片放入茄褐纹病菌孢子悬浮液中，充分浸湿备用，得到含茄褐纹病菌孢子悬浮液的滤纸片；

3)病原菌侵染处理

取大小一致的成熟茄果，用消过毒的十字形刀具在健康无病的茄果上划5mm长2mm深的“十”字伤口，然后取步骤2)的含茄褐纹病菌HZ-4菌株孢子悬浮液的滤纸片贴在茄果“十”字伤口处作病原菌侵染处理，将侵染后的茄果统一平放在塑料盒内，用喷壶喷水至未见明显水滴下流，用保鲜膜覆盖，在25-28℃条件下保湿培养，5d后开始调查，同时将对照的茄果划“十”字伤口后只接种无菌水；

各品种接种7-8个茄果，在每个果实的果肩至果脐部随机划“十”字伤口10个以上，相邻两个伤口之间留足足够的发病空间；

4)发病调查

接种后第5d开始调查，记录各处理的发病情况；待各处理的病情基本稳定、无新病斑出现时，停止调查，统计其病果率及发病点数，评价各品种对褐纹病的抗性水平；

其中步骤1)中基质配方为：草炭土、蛭石和田园土按体积比1：1：1混合，用福尔马林溶液消毒。

茄子对褐纹病的抗性标准：免疫：发病率为0，高抗：0<发病率≤20％，抗病：20％<发病率≤40％，耐病：40％<发病率≤60％，感病(S)：60％<发病率≤100％。

2.一种分离的适用于褐纹病鉴定的茄褐纹病菌(Phomopsisvexans)HZ-4，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO：M2014313。