CN103688907A - 一种昆虫病原线虫复壮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种昆虫病原线虫复壮的方法，步骤如下：（1）应用大蜡螟活体扩繁昆虫病原线虫，并收集其侵染期幼虫，得到线虫悬浮液；（2）确定一块有昆虫病原线虫寄主昆虫分布，但无昆虫病原线虫分布的地块，将扩繁收集得到的线虫悬浮液喷施到田间；（3）在上述地块采集土样，利用大蜡螟诱集线虫，获得复壮后的昆虫病原线虫。本发明可以有效的将昆虫病原线虫复壮，使其致病力恢复到自然系统中的真实状态：复壮后的昆虫病原线虫对大蜡螟的致病力是侵染4d后，死亡率为100%，与当初刚刚诱集分离得到时对大蜡螟的致病力一致；而未复壮的线虫对大蜡螟的致病力是侵染4d后，死亡率为80.0%。
Description
技术领域
本发明涉及一种昆虫病原线虫复壮的方法。
背景技术
昆虫病原线虫是指体内携带有具有病原性的共生细菌，因而能引起昆虫致病的一类线虫。作为控制害虫的手段，昆虫病原线虫较化学防治有明显的优势，近年来的研究表明：昆虫病原线虫无污染，对环境和人类安全，可以大量使用，而且它们既可以主动发现寄主，也可以被动接触寄主，已被证实，对靶标昆虫进行控制时，昆虫病原线虫的防效要优于化学农药。昆虫病原线虫的另一优点是可以在寄主体内大量繁殖，因此，新繁殖的侵染线虫可以侵染更多的寄主昆虫。因此，昆虫病原线虫将成为生物防治中的主要手段，可以预计昆虫病原线虫在未来的农业害虫生物生态控制系统中将会发挥重要的作用。
昆虫病原线虫推广应用的前提是筛选出致病力较高的种类或品系，所以昆虫病原线虫对靶标昆虫的致病力测定是开展昆虫病原线虫应用研究的基础。昆虫病原线虫致病力的高低主要是通过其侵染期线虫对靶标昆虫的防治效果来反映，供试线虫一般情况下都是经过利用大蜡螟活体扩繁复壮的侵染期幼虫，但是由于室内扩繁代数和保存时间的递增，侵染期线虫的致病力会下降，不能很好的应用其开展昆虫病原线虫应用研究。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种昆虫病原线虫复壮的方法，应用本发明的方法可以有效的将昆虫病原线虫复壮，使其致病力恢复到自然系统中的真实状态，为致病力测定的准确性提供了保障。
本发明提供一种昆虫病原线虫复壮的方法，步骤如下：
1) 应用大蜡螟活体扩繁昆虫病原线虫，并收集其侵染期幼虫，得到线虫悬浮液；
2) 确定一块有昆虫病原线虫寄主昆虫分布，但无昆虫病原线虫分布的地块，将扩繁收集得到的线虫悬浮液喷施到田间；
3) 在上述地块采集土样，利用大蜡螟诱集线虫，获得复壮后的昆虫病原线虫。
优选地，步骤（2）中，所述线虫悬浮液以10000-15000头/m2的浓度喷施。
此浓度范围便于线虫寄生寄主昆虫，并易于收集。
更优选地，步骤（2）中，所述线虫悬浮液以10000头/m2的浓度喷施。
优选地，步骤（3）中，经过三个月后，在上述地块采集土样。
优选地，所述采集土样采取多点采样法。
优选地，步骤（3）中，所述利用大蜡螟诱集线虫是将大蜡螟老熟幼虫放入瓶中，加入采集的土样，使大蜡螟充分接触昆虫病原线虫，将表现为受线虫侵染症状的死亡大蜡螟老熟幼虫单头放入线虫收集盘上收集昆虫病原线虫。
优选地，所述使大蜡螟充分接触昆虫病原线虫的方法是每天翻动瓶，使大蜡螟在土中上下爬动。
优选地，所述线虫收集盘里为质量百分浓度为0.1%的甲醛溶液。
昆虫病原线虫复壮是其致病力研究的前提和关键步骤，有效的复壮是其致病力测定准确性的保障，本发明可以有效的将昆虫病原线虫复壮，使其致病力恢复到自然系统中的真实状态：复壮后的昆虫病原线虫对大蜡螟的致病力是侵染4d后，死亡率为100%，与当初刚刚诱集分离得到时对大蜡螟的致病力一致；而未复壮的线虫对大蜡螟的致病力是侵染4d后，死亡率为80.0%。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
本发明的昆虫病原线虫复壮的方法步骤如下：
1.1 试验材料
供试线虫：甘肃省土著昆虫病原线虫的优势种：Steinernema feltiae。
试验所需器材：人工气候箱、显微镜、解剖镜、冷光源解剖镜、智能冰箱、恒温箱、微量移液枪、直径60mm培养皿、直径90mm培养皿、黑光灯、滤纸、小喷壶等。
1.2 试验方法
1.应用大蜡螟活体扩繁Steinernema feltiae线虫，并收集其侵染期幼虫；具体方法如下：在24孔板中，每孔装2克细沙，然后每孔将200μl Steinernema feltiae线虫液（含约200头抗逆性幼虫）滴入孔中，每孔放入一头末龄大蜡螟幼虫，用封口膜密封24孔板，在25℃条件下培养24小时，然后将因昆虫病原线虫侵染死亡的大蜡螟幼虫取出，放到铺有一层干燥滤纸的培养皿中，在25℃条件下再培养72小时，然后将尸体放到线虫收集盘中，待线虫游出，每隔24小时收集一次线虫，将收集的线虫用无菌水冲洗三遍后，得到线虫悬浮液，置于5～8℃冰箱中储存备用。
2.确定一块有Steinernema feltiae线虫寄主昆虫（如常见地下害虫类：蛴螬）分布，但无Steinernema feltiae线虫分布的地块，并将扩繁收集得到的线虫悬浮液以10000头/m2的浓度喷施到田间；此浓度便于线虫寄生寄主昆虫，并易于收集。
3.经过三个月（线虫可在自然环境中扩繁多代）后再在此地块采集土样并诱集Steinernema feltiae线虫；具体方法如下：
①采集土样：采取5点采样法。即在某一地点，除去表层土，在10～20cm的土深处取土，样品量至少200cm3，以便采取到足够量的Steinernema feltiae线虫。在每个地面2～4m2的范围内取5个点，将5点采的样混合，装入双层塑料袋中。
②大蜡螟诱集法诱集Steinernema feltiae线虫：将室内人工饲料饲养的10头大蜡螟老熟幼虫放入塑料瓶内，然后分别装入500g采集的土样，在25℃的恒温箱内保持5～7天，期间每天翻倒塑料瓶，使大蜡螟在土中上下爬动，以充分接触线虫。放置2天后每天检查大蜡螟幼虫的死亡情况。将表现受线虫侵染症状的死亡幼虫单头放入线虫收集盘（培养皿）上收集Steinernema feltiae线虫(培养皿里加入少量质量百分浓度为0.1%的甲醛溶液，溶剂为无菌水，起保湿和消毒的作用)。7～10天后线虫开始从大蜡螟尸体内爬出，爬到大培养皿的无菌水甲醛溶液中，就可获得侵染期线虫的水悬液。每天将线虫水悬液换入新的容器中，贴上品系名称和日期标签，放在5～8℃冰箱中保存备用，再在大培养皿中重新加入适量的无菌水甲醛溶液。
4.将收集得到的线虫悬浮液进行形态学、分子生物学鉴定，分离鉴定得到的昆虫病原线虫为Steinernema feltiae。
5.保存于4℃的冰箱中，备用。
应用本发明的方法得到的昆虫病原线虫具有很好的致病力，具体试验过程如下：
试验在温度为25℃，相对湿度为80%条件下的恒温箱内进行。在直径为60mm的培养皿中垫一层滤纸，加入适量的水，使滤纸保持湿润。每个培养皿中加入50条应用本发明的方法获得的线虫，同时每培养皿放入大蜡螟老熟幼虫一头。每处理10头供试幼虫，3次重复。并将未复壮的线虫作为对照试验。每隔8小时检查大蜡螟幼虫的死亡情况并作记录，比较复壮前后Steinernema feltiae线虫对大蜡螟的致病力，结果为：复壮后的Steinernema feltiae线虫对大蜡螟的致病力是侵染4d后，死亡率为100%，与当初刚刚诱集分离得到时对大蜡螟的致病力一致；而未复壮的线虫对大蜡螟的致病力是侵染4d后，死亡率为80.0%。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤2中，将扩繁收集得到的线虫悬浮液以12000头/m2的浓度喷施到田间；其余步骤均与实施例1中相同。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤2中，将扩繁收集得到的线虫悬浮液以15000头/m2的浓度喷施到田间；其余步骤均与实施例1中相同。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种昆虫病原线虫复壮的方法，其特征在于：步骤如下：
（1）应用大蜡螟活体扩繁昆虫病原线虫，并收集其侵染期幼虫，得到线虫悬浮液；
（2）确定一块有昆虫病原线虫寄主昆虫分布，但无昆虫病原线虫分布的地块，将扩繁收集得到的线虫悬浮液喷施到田间；
（3）在上述地块采集土样，利用大蜡螟诱集线虫，获得复壮后的昆虫病原线虫。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述线虫悬浮液以10000-15000头/m2的浓度喷施。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述线虫悬浮液以10000头/m2的浓度喷施。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，经过三个月后，在上述地块采集土样。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述采集土样采取多点采样法。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述利用大蜡螟诱集线虫是将大蜡螟老熟幼虫放入瓶中，加入采集的土样，使大蜡螟充分接触昆虫病原线虫，将表现为受线虫侵染症状的死亡大蜡螟老熟幼虫单头放入线虫收集盘上收集昆虫病原线虫。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述使大蜡螟充分接触昆虫病原线虫的方法是每天翻动瓶，使大蜡螟在土中上下爬动。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述线虫收集盘里为质量百分浓度为0.1%的甲醛溶液。
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