KR20080091757A - 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법 - Google Patents

에키노칸딘형 화합물의 정제 방법 Download PDF

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KR20080091757A
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echinocandin
acetate
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KR1020087011616A
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졸트 토마스 수토
피터 세레스
안드레아 소르바시
빌모스 케리
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테바 기오기스제르갸르 자르트쾨렌 뮈쾨되 레스즈베니타르사사그
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Abstract

본 발명은 뉴모칸딘 Bo, WF 11899A 및 에키노칸딘 B와 같은 에키노칸딘형 화합물을 제조 및 정제하는 방법을 제공한다. 이들 화합물은 항진균성 생성물 카스포펀진, 마이카펀진 및 아니둘라펀진과 같은 반합성 생성물을 제조하는 데 사용되는 발효 생성물이다.

Description

에키노칸딘형 화합물의 정제 방법{PURIFICATION PROCESSES OF ECHINOCANDIN-TYPE COMPOUNDS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 가특허 출원: 제60/852,346호(2006년 10월 16일 출원), 제60/937,156호(2007년 6월 25일 출원), 제60/958,531호(2007년 7월 6일 출원), 제60/953,048호(2007년 7월 31일 출원) 및 제60/967,772호(2007년 9월 7일 출원)를 기초로 우선권을 주장한다. 상기 출원들의 내용은 참고로 본원에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 뉴모칸딘 B0, WF 11899A 및 에키노칸딘 B를 비롯한 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법을 포함한다.
뉴모칸딘 B0, WF 11899A 및 에키노칸딘 B는 하기 구조:
Figure 112008034458343-PCT00001
를 가지는 에키노칸딘류의 모든 구성원이다.
Figure 112008034458343-PCT00002
그것들은 카스포펀진, 마이카펀진 및 아니둘라펀진과 같은 반합성 생성물을 각각 제조하는 데 사용되는 발효 생성물이다. 그것들은 모두 항진균성 활성을 가진다.
카스포펀진은 에키노칸딘이라 불리는 새 부류의 첫 번째이며, 세포벽 합성을 저해함으로써 작용한다. 카스포펀진은 화학명이 1-[(4R,5S)-5-[(2-아미노에틸)아미노]-N2-(10,12-디메틸-1-옥소테트라데실)-4-히드록시-L-오르니틴]-5-[(3R)-3-히드록시-L-오르니틴]뉴모칸딘 B0(CAS 등록 번호 179463-17-3)이고, 하기의 화학 구조(화학식 I)를 가진다.
Figure 112008034458343-PCT00003
카스포펀진은 미국 특허 제5,378,804호에 개시되어 있다. 카스포펀진은 미국에서 머크사에 의해 상표명 CANCIDAS®로 그것의 디아세테이트 염의 형태로 시판되고 있다. CANCIDAS®는 아스퍼길러스(Aspergillus) 및 칸디다(Candida)와 같은 감염의 치료 및 면역결핍 환자에게서 발견되는 감염의 예방을 위해 정맥 내로 투여된다.
아니둘라펀진은 미국에서 화이저에 의해 상표명 Eraxis®로 시판되고 있고, 칸디다와 같은 감염의 치료를 위해 정맥 내로 투여된다.
마이카펀진은 미국에서 아스텔라스에 의해 상표명 Mycamine®으로 이의 나트륨염의 형태로 시판되고 있고, 칸디다와 같은 감염의 치료를 위해 정맥 내로 투여된다.
카스포펀진의 제조 방법은 뉴모칸딘의 사용을 포함한다. 뉴모칸딘은 미국 특허 제5,194,377호에 개시되어 있고, 하기의 화학 구조를 가진다:
Figure 112008034458343-PCT00004
.
뉴모칸딘은 발효 반응에 의해 제조되고; 이때 발효 및 혼합된 배양액은 일반적으로 목적하는 생성물로부터 분리하기가 어려울 수도 있는 다수의 관련 부산물을 함유한다. 미국 특허 제6,610,822호는 수차례의 추출 과정, 첫째 비극성 불순물을 제거하고, 둘째 극성 불순물을 제거하고, 그 다음 경우에 따라 크로마토그래프 정제를 병행한 생성물의 "역추출"을 수행함으로써 뉴모칸딘, WF 11899 및 에키노칸딘 B와 같은 에키노칸딘형 화합물을 정제하는 방법을 기재하고 있다. 따라서, 미국 특허 제6,610,822호는 길고 시간 소모적인 정제 방법을 제공한다.
미국 특허 제5,021,403호는 수차례 크로마토그래프의 수행에 의한 뉴모칸딘, WF 11899 및 에키노칸딘 B와 같은 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법을 기재하고 있다. 따라서, 이 방법은 대규모의 제조에 적절하지 않고, 경제적이지 않고, 시간 소모적이다.
미국 특허 제6,506,726호 및 미국 특허 제6,590,073호는 크로마토그래피에 의한 에키노칸딘형 화합물, 특히 탈아실화 에키노칸딘 B의 정제를 기재하고 있다. 정제된 물질은 산의 존재하에 양성자화될 수 있는 1 이상의 아미노기를 함유하는 에키노칸딘 핵(nuclea)이다. 따라서, 이 방법은 양성자화되는 아민기를 가지지 않 는 물질, 예컨대 뉴모칸딘, WF 11899 및 에키노칸딘 B에는 적절하지 않다.
이 분야에서 산업적인 규모에서 실행가능한 기술을 이용하여 에키노칸딘형 화합물을 정제하는 별도의 방법에 대한 요구가 있다.
발명의 개요
본 발명은 뉴모칸딘을 비롯한 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명은 (a) 1종 이상의 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매로 에키노칸딘형 화합물을 함유하는 원액(whole broth)으로부터 불순물을 추출하여, 수상 및 유기상을 포함하는 제1의 2상 시스템을 얻는 단계; (b) 상기 유기상을 제거하여 수상을 얻는 단계; (c) 수불혼화성 유기 용매를 사용하여 수상으로부터 에키노칸딘형 화합물을 추출하여, 제2의 2상 시스템을 얻는 단계; 및 (d) 제2의 2상 시스템의 유기상으로부터 정제된 에키노칸딘형 화합물을 회수하는 단계를 포함하며, 단계 (a)에서의 수불혼화성 유기 용매와 (c)에서의 수불혼화성 유기 용매는 상이한 것인 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 1종 이상의 역용매를 사용하여 에키노칸딘형 화합물을 결정화하는 단계를 포함하는 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 1종 이상의 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매로 에키노칸딘형 화합물을 함유하는 원액으로부터 불순물을 추출하여, 수상 및 유기상을 포함하는 제1의 2상 시스템을 얻는 단계; (b) 상기 유기상을 제거하여 수상을 얻는 단계; (c) 수불혼화성 유기 용매를 사용하여 수상으로부터 에키노칸딘형 화합물을 추출하여, 제2의 2상 시스템을 얻는 단계; (d) 에키노칸 딘형 화합물을 회수하는 단계; 및 (e) 회수된 에키노칸딘형 화합물을 1종 이상의 역용매를 사용하여 결정화하는 단계를 포함하며, 단계 (a)에서의 수불혼화성 유기 용매와 (c)에서의 수불혼화성 유기 용매는 상이한 것인 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 에키노칸딘형 화합물을 1종 이상의 역용매 및 고체 담체와 배합하는 단계를 포함하는 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 수불혼화성 유기 용매를 사용하여 발효액으로부터 또는 발효액에서 얻어진 여과된 균사체로부터 에키노칸딘형 화합물을 추출하여, 수상 및 유기상을 포함하는 2상 시스템을 얻는 단계; (b) 에키노칸딘형 화합물을 회수하는 단계; 및 (c) 회수된 에키노칸딘형 화합물을 1종 이상의 역용매 및 고체 담체와 함께 배합하여 정제된 에키노칸딘형 화합물을 얻는 단계를 포함하는 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법을 포함한다.
도 1은 단계별 방식으로 정제 방법의 일 구체예를 도해하는 흐름도이다.
본 발명은 뉴모칸딘 또는 다른 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법을 포함한다. 본원에서 사용한 바와 같이, 달리 정의하지 않는 한, 용어 "에키노칸딘형 화합물"은 하기 구조 및 이의 유도체를 가지는 화합물을 가리킨다:
Figure 112008034458343-PCT00005
식 중, R은 수소 또는 -CO(O)R'이고; R'는 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 또는 산의 존재하에 양성자화될 수 있는 1 이상의 아미노기가 부착된 헤테로아릴기이고; R1은 -H 또는 -OH이고; R2는 -H 또는 -CH3이고; R3은 -H, CH3, -CH2CONH2 또는 -CH2CH2NH2이고; R4는 -H 또는 -OH이고; R5는 -OH, -OPO3H2 또는 -OSO3H이고; R6은 -H 또는 -OSO3H이고, R7은 -H 또는 -CH3이다.
바람직하게는, R은 리놀레오일, 10,12-디메틸 미리스토일 또는 팔미토일이다. 바람직하게는, R1, R4 및 R5는 OH이다. 바람직하게는, R3은 Me 또는 CH2CONH2 중 하나이다.
바람직하게는 R이 리놀레오일인 경우, R1 및 R4는 OH이고, R3 및 R7은 Me이고, R6은 H이고, 즉, 상기 화합물은 에키노칸딘 B이다.
바람직하게는, R이 10,12-디메틸 미리스토일인 경우, R1 및 R4는 OH이고, R3은 CH2CONH2이고, R5는 OH이고, R6 및 R7은 H이고, 즉, 상기 화합물은 뉴모칸딘 B0이다.
바람직하게는, R이 팔미토일인 경우, R1 및 R4는 OH이고, R3은 CH2CONH2이고, R5는 OH이고, R6은 OSO3H이고, R7은 CH3이고, 즉, 상기 화합물은 WF11899A이다.
바람직하게는, 에키노칸딘형 화합물은 뉴모칸딘 B0, WF-11899 및 에키노칸딘이다. 이들 생성물은 에스테르, 저급 알코올 및 물과 같은 통상적인 용매에서 잘 용해될 수 있는 것은 아니다. 따라서 그것들은 통상적인 추출에 의해 정제하기가 어렵다. 그러므로, 그것들에 대한 알려진 정제 방법은 일반적으로 복잡하고 비효율적이며, 특히 이들 화합물을 대량으로 취급할 때 그러하다.
본 발명은 산업적인 규모를 비롯한 어떠한 규모에도 적절한 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 방법은 간단해서 공정 단계가 복잡하지않고, 산업적인 규모의 방법으로 용이하게 규모화할 수 있고, 경제적인 동시에, 예를 들어 항진균성 카스포펀진, 아니둘라펀진 및 마이카펀진과 같은 활성 의약 물질을 얻기 위한 추가 처리에 충분한 순도의 에키노칸딘형 화합물을 제공한다. 본 발명의 제1 방법은 에키노칸딘형 화합물의 낮은 용해도 특성을 이용한다.
본원에서 사용한 바와 같이, 달리 언급하지 않는 한, 용어 "수불혼화성 용매"는 물과 혼합시 단일 혼합물을 형성하지 않고 적어도 2상 시스템을 형성하는 용매 또는 용매 혼합물을 가리킨다. 그에 반해서, "수혼화성 용매"는 물과 혼합시 단일 용액상을 형성하는 용매 또는 용매의 혼합물을 가리킨다.
본원에서 사용한 바와 같이, 달리 언급하지 않는 한, 용어 "고체 담체"는 비활성이고 처리 용매 중 용해되지않은 채 남아있지만 화합물(들)과 함께 혼합물을 형성할 수 있는 물질(화합물)을 가리킨다.
본원에서 사용한 바와 같이, 달리 언급하지 않는 한, 용어 "비극성"은 극성 지수가 약 0∼약 2.4인 유기 용매를 가리킨다. 이러한 용매의 예로는 톨루엔, 헵탄, 헥산, 옥탄 및 시클로헥산이 있다.
본원에서 사용한 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약극성의"은 알코올성 유기 용매를 제외한, 극성 지수가 약 2.4∼약 5.1인 유기 용매를 가리킨다. 이러한 용매의 예로는 메틸 에틸 케톤, 아세톤, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 이소부틸 아세테이트, n-프로필 아세테이트, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄 및 이소프로필 아세테이트가 있다. 극성 지수는 문헌[Synder, J. Chromatographic science 16, 223-234 (1978)]에 따라 측정할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 (a) 1종 이상의 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매로 에키노칸딘형 화합물을 함유하는 원액으로부터 불순물을 추출하여, 수상 및 유기상을 포함하는 제1의 2상 시스템을 얻는 단계; (b) 상기 유기상을 제거하여 수상을 얻는 단계; (c) 제2의 수불혼화성 유기 용매를 사용하여 수상으로부터 에키노칸딘형 화합물을 추출하여, 제2의 2상 시스템을 얻는 단계; 및 (d) 정제된 에키노칸딘형 화합물을 회수하는 단계를 포함하며, 단계 (a)에서의 수불혼화성 유기 용매와 (c)에서의 수불혼화성 유기 용매는 상이한 것인 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법을 포함한다.
에키노칸딘형 화합물이 뉴모칸딘 B0인 경우, 출발 미정제된 뉴모칸딘(예컨대, 발효액 중의 뉴모칸딘)은 예를 들어 미국 특허 제6,610,822호에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다.
바람직하게는, 에키노칸딘형 화합물은 원액 중 약 0.2 g/L∼약 15 g/L의 농도, 더욱 바람직하게는, 약 0.2 g/L∼약 8 g/L의 농도로 존재한다. 발효액 중 에키노칸딘형 화합물의 이 농도는 HPLC 분석에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 에키노칸딘형 화합물을 보유한 발효액을 비극성 또는 약극성의의 수불혼화성 유기 용매와 배합하여 제1의 2상 시스템을 얻는다. 일반적으로, 상기 2상 시스템은 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기상에 있는 식물성 오일, 아미노산 및 저분자 크기의 단백질과 같은 불순물, 및 발효액의 수성 배지인 수상에 있는 에키노칸딘형 화합물 및 균사체를 포함한다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 수상은 또한 불용성 입자들을 함유할 수 있다.
그러므로, 적절한 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매는 에키노칸딘형 화합물이 낮은 용해도를 가지는 용매를 포함한다. 바람직하게는, 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매로는, 이에 국한되는 것은 아니지만, C5 -8 지방족 알칸, C6 -8 방향족 탄화수소, C4 -8 에테르 및 C3 -6 에스테르가 있다. 바람직하게는, C5 -8 지방족 알칸은 헵탄, 헥산, 옥탄 또는 시클로헥산이다. 바람직하게는, C6 -8 방향족 탄화수소는 톨루엔이다. 바람직하게는, C4 -8 에테르는 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르 또는 디부틸 에테르이다. 바람직하게는, C3 -6 에스테르는 이소-부틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, n-프로필 아세테이트, 이소프로필 아세테이트 또는 에틸 아세테이트이다. 가장 바람직하게는, 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매는 이소-부틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, n-프로필 아세테이트, 이소프로필 아세테이트 또는 에틸 아세테이트이다.
본 발명의 방법에서, 제1의 2상 시스템을 얻는 데 사용되는 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매의 양은 2상의 분리 효율에 따라 원액의 약 5 부피%∼약 90 부피%일 수 있다. 상 분리가 효율적이면, 5∼25%가 일반적으로 충분하다. 하지만, 상 분리가 최적이 아니면, 50∼90%가 사용되어야 한다. 바람직하게는, 사용된 수불혼화성 용매의 양은 원액의 약 10 부피%∼약 50 부피%, 더욱 바람직하게는 약 30 부피%∼약 50 부피%, 가장 바람직하게는 약 50 부피%이다.
추출은 단계 (b)의 수상인 정제된 발효액을 제공한다. 이 상은 대개는 단지 하나의 별도의 추출 단계를 가진 추출 공정을 계속하기 위해 충분히 정제된다.
그 다음 단계 (b)의 수상을 제2의 수불혼화성 용매를 사용하여 추출하고, 수상으로부터 에키노칸딘형 화합물을 제거한다. 이 추출은 바람직하게는 알코올을 사용한 추출로 얻어지고 유기상으로 언급된 극성 유기상인 수불혼화성 유기상에 에키노칸딘형 화합물을 포함하고, 균사체 및 유기상에 용해되지 않는 물질은 수상에 남아있는 제2의 2상 시스템을 제공한다. 극성 유기상에 용해되지 않는 물질의 예로는 몇몇 아미노산과 아미노산 염, 몇몇 유기산과 유기산 염, 효소 및 단백질이 있다.
단계 (c)에서의 적절한 제2의 수불혼화성 유기 용매는 에키노칸딘형 화합물에 대해 높은 친화도를 갖는 것이다. 바람직하게는, 제2의 수불혼화성 유기 용매는 알코올, 더욱 바람직하게는 C4 -6 알코올, 더 더욱 바람직하게는 C4 -5 알코올, 가장 바람직하게는, 이소부탄올 또는 n-부탄올이다.
단계 (c)에서의 추출을 반복하여 유기상에 있는 에키노칸딘형 화합물의 수율을 더 증가시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 추출 단계 (c)를 반복한다.
그 다음 에키노칸딘형 화합물을 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 용매의 증발에 의해 유기상으로부터 회수한다. 회수는 에키노칸딘형 화합물을 보유하는 유기상의 농축액을 제공한다. 농축액은 에키노칸딘형 화합물의 농축 용액 또는 유성 잔여물일 수 있으며, 본원에서 농축 잔여물이라고 언급된다.
그 다음 얻어진 농축 잔여물은 1종 이상의 역용매를 사용하여 에키노칸딘형 화합물을 결정화함으로써 더 정제할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 1종 이상의 역용매를 사용하여 에키노칸딘형 화합물을 결정화하는 단계를 포함하는 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법을 제공한다.
결정화는 에키노칸딘형 화합물을 역용매와 혼합하여 에키노칸딘형 화합물을 침전시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 역용매를 에키노칸딘형 화합물에 첨가한다.
출발 에키노칸딘형 화합물은, 바람직하게는 발효액의 추출로부터 얻어진다. 추출은 예를 들어 본원에 개시된 방법 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 방법에 의해 수행할 수 있다.
출발 에키노칸딘형 화합물은 전술한 방법에 의해 얻어진 농축 잔여물의 형태일 수 있다.
본원에서 사용한 바와 같이, 용어 역용매는 용매와 고체의 혼합물에 첨가하여 용매 중 고체의 용해도를 감소시키는 액체를 가리킨다.
적절한 역용매는 에키노칸딘형 화합물의 침전을 일으킨다. 그러므로, 적절한 역용매는 에키노칸딘형 화합물이 낮은 용해도를 가지는 것이다. 바람직하게는, 적절한 역용매로는, 이에 국한되는 것은 아니지만, 에틸 아세테이트, 이소부틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴(ACN), 에틸아세테이트 및 이소-부틸아세테이트와 아세토니트릴의 혼합물, 및 이소-부틸아세테이트와 아세토니트릴의 혼합물이 있다. 가장 바람직한 역용매는 이소부틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, tert-부틸 아세테이트, 아세토니트릴, 아세톤 또는 이소프로필 아세테이트이고, 더 가장 바람직하게는, 아세토니트릴이다. 바람직하게는, 역용매의 양은 각각 2:1 이상, 더욱 바람직하게는 약 5:1∼약 2:1, 더 더욱 바람직하게는 약 3:1∼약 2:1 v/v의 역용매:에스테르의 비로 첨가한다.
바람직한 구체예에서, 역용매는 아세토니트릴이고, 아세토니트릴:에스테르 비가 각각 약 2:1 v/v 이상이 되는 양으로 존재한다. 다른 바람직한 구체예에서, 역용매는 아세톤이고, 아세톤:에스테르 비가 각각 약 2:1 v/v 이상이 되는 양으로 존재한다.
몇몇 구체예에서, 역용매는 에틸아세테이트 또는 이소부틸 아세테이트이고,침전은 또한 냉각 단계 또는 ACN 또는 아세톤과 같은 제2의 역용매를 첨가하여 침전을 유도하는 단계를 포함한다. 이러한 냉각 단계는 농축 잔여물 및 역용매의 혼합물을 약 5℃∼약 -20℃, 더욱 바람직하게는 약 5℃∼약 0℃의 온도로 냉각시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 예를 들어, 역용매가 ACN 또는 아세톤인 경우, 침전은 약 5℃∼약 -20℃, 더욱 바람직하게는 약 5℃∼약 0℃의 온도로 냉각시켜 침전된 생성물의 수율을 증가시키는 단계를 더 포함한다.
침전은 침전된 생성물의 수율을 증가시키기에 충분한 시간 동안 상기의 온도에서 유지할 수 있는 현탁액을 제공한다. 바람직하게는, 상기 현탁액을 약 15분 이상 동안, 더욱 바람직하게는 약 10 시간∼약 24 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 20 시간 동안 유지한다.
본 발명의 다른 방법에서, 고체 담체를 정제 방법에서 사용함으로써, 예를 들어 전술한 방법에서 요구된 바와 같은 불순물을 추출하는 제1의 추출 단계를 제거한다. 또한, 추출 단계(들) 및 결정화 단계에서도 더 소량의 용매가 요구되며, 이러한 점으로 인하여 상기 방법은 특히 대규모 제조에 있어서 매우 매력적이다.
이 방법은 (a) 수불혼화성 유기 용매를 사용하여 발효액 또는 발효액에서 얻어진 여과된 균사체로부터 에키노칸딘형 화합물을 추출하여, 수상 및 유기상을 함유하는 2상 시스템을 얻는 단계; (b) 이 에키노칸딘형 화합물을 회수하는 단계; 및 (c) 회수된 에키노칸딘형 화합물을 1종 이상의 역용매 및 고체 담체와 배합하여 정제된 에키노칸딘형 화합물을 얻는 단계를 포함한다.
우선, 발효액을 수불혼화성 유기 용매와 배합하여 2상 시스템을 얻는다. 상기 수불혼화성 유기 용매는 전술한 바와 같고, 바람직하게는 수불혼화성 유기 용매는 수불혼화성 알코올이다. 바람직한 구체예에서, 추출은 약 2∼약 8, 더욱 바람직하게는, pH 약 5∼약 7에서 수행한다. 산성 pH, 예컨대 pH 2∼약 4에서 추출할 때, 생성물의 변성을 피하기 위해 냉각하면서 추출을 수행하고, 먼저 발효액 및 극성 수불혼화성 용매를 냉각시킨 후 수행하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 냉각은 약 0℃∼10℃, 더욱 바람직하게는 약 0℃∼약 5℃의 온도까지 실시한다. 일반적으로, pH는 발효액의 pH에 따라 염기 또는 산을 첨가함으로써 약 2∼약 8의 범위로 조정한다. 적절한 염기는, 예를 들어, 수산화암모늄과 같은 암모늄 염기 또는 수산화나트륨과 같은 알칼리 염기의 희석 수용액이다. 적절한 산은, 예를 들어, 아세트산 또는 황산의 희석 수용액이다.
추출 단계를 반복하여 제2의 수불혼화성 유기상 중의 키노칸딘형 화합물의 수율을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 추출 단계는 약 2∼4회 추출을 반복하고, 더욱 바람직하게는 이 추출 단계에서 총 3회의 추출이 바람직하다.
그 다음 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 용매 증발에 의해 유기상으로부터 에키노칸딘형 화합물을 회수한다. 회수하여 에키노칸딘형 화합물을 보유하는 유기상의 농축액을 얻는다. 이 농축액은 본원에서 미정제 농축 잔여물로서 언급되는, 에키노칸딘현 화합물의 유성 잔여물 또는 농축액일 수 있다.
에키노칸딘형 화합물의 이 미정제 농축 잔여물은 용매를 건조될 때까지 거의 제거하여 농축액을 얻음으로써 수득할 수 있다. 수불혼화성 유기 용매의 제거는 이소부틸 아세테이트과 같은 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매를 첨가하고 이 용매를 증발시킴으로써 수차례 반복할 수 있으며, 이때 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매는 상기 방법의 단계 (a)에서의 수불혼화성 용매와는 상이하다.
경우에 따라, 상기 방법은 단계 c)에서와 같이, 역용매 및 고체 담체와 에키노칸딘형 화합물을 배합하여 에키노칸딘형 화합물을 결정화하기 이전에, 얻어진 농축액의 별도의 세척 단계를 포함한다. 이 세척 단계는 얻어진 농축액과 물을 배합하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 세척은 두 단계, 즉 제1 단계는 pH가 약 4∼약 6.5, 바람직하게는 약 4∼약 4.5인 물을 사용하고, 제2 단계는 pH가 약 4∼약 6.5, 바람직하게는, 약 6∼약 6.5인 물을 사용하는 단계들을 포함한다. 또한, 얻어진 농축액을 예를 들어 약 5℃로 냉각할 때, pH가 4 미만인 물, 예를 들어 pH가 약 3인 물을 사용할 수 있다. 세척은 발효액으로부터 유래하여 농축액에 존재할 수 있는 고체 잔여물의 대략 약 20 중량%∼약 50중량%를 제거할 수 있다.
또한, 농축액은 단계 c)에서와 같이, 역용매 및 고체 담체와 에키노칸딘형 화합물을 배합하여 에키노칸딘형 화합물을 결정화하기 이전에 활성탄으로 처리할 수 있다. 이 처리는 활성탄과 농축액을 혼합하는 단계 및 그 다음 활성탄을 여과하는 단계를 포함한다.
그 다음 얻어진 농축액은 1종 이상의 역용매 및 고체 담체와 그것을 배합함으로써 더 정제하여 정제된 에키노칸딘형 화합물을 얻을 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 1종 이상의 역용매 및 고체 담체와 에키노칸딘형 화합물을 배합하는 단계를 포함하는 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법을 포함한다. 바람직하게는, 역용매 및 고체 담체를 에키노칸딘형 화합물에 첨가할 수 있다.
출발 에키노칸딘형 화합물은, 바람직하게는 발효액의 추출에 의해 얻어진다. 추출은 예를 들어 본원에 기재된 방법 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 방법으로 수행할 수 있다.
출발 에키노칸딘형 화합물은 상기 기술된 방법에 의해 얻어진 농축 잔여물의 형태일 수 있다.
에키노칸딘형 화합물의 침전은 고체 담체 상에서 일어나고, 따라서 에키노칸딘형 화합물은 고체 담체 상에 흡수되어 그 결과로서 이전 공정 단계에서 얻어진 농축액에 여전히 존재하고 있는 불순물로부터 분리된다. 역용매를 사용한 목적하는 물질의 침전에 있어서, 적은 부피의 역용매가 사용될수록 높은 순도의 침전 물질이 얻어지나, 이 적은 부피의 역용매는 또한 이의 여과를 복잡하게 한다. 고체 담체는 다른 방법으로 여과하기 어려운 침전된 물질의 여과를 촉진한다. 적절한 고체 담체로는, 이에 국한되는 것은 아니지만, 활성탄, 규조토, 밀가루, 옥수수 전분, 감자 전분, 벤토나이트, 펄라이트, 아비셀, 소수성 펄라이트, 활성 갈탄분, 탄소, 셀룰로스 생성물 및 본 발명에 따른 방법의 용매 용액에서 현탁될 수 있는 임의의 다른 고체가 있다.
본 방법의 이 단계에서, 고체 담체와 이전 단계에서 얻어진 농축액을 배합하여 혼합물을 제조한다. 그 다음 혼합물을 역용매와 배합한다. 바람직하게는, 적절한 역용매는 이소프로필 아세테이트 및 이소부틸 아세테이트 외에도 전술한 바와 같다. 일반적으로, 역용매를 첨가한 후, 현탁액을 얻는다.
그 다음 현탁액을 여과하여 고체 담체 및 흡수된 생성물을 제거한다.
상기 방법은 여과된 고체 담체 및 흡수된 생성물을 현탁시켜 미량의 모액을 제거하는 단계를 더 포함한다. 현탁액을 생성하는 데 사용된 용매는 ACN 또는 아세톤과 같은 단일 용매, 또는 두 용매의 혼합물일 수 있고, 이들 둘 다에서 에키노칸딘형 화합물이 낮은 용해도를 가진다. 두 용매의 혼합물을 사용하는 경우, 제1의 용매는 불순물이 용해되는 것, 예컨대 이소부틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트와 에틸 아세테이트, 옥탄이고, 제2의 용매는 아세토니트릴 또는 아세톤 중 하나이다.
또한, 생성물 및 고체 담체를 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예컨대 여과 및 이어서 여과된 고체의 건조에 의해 현탁액으로부터 회수할 수 있다. 바람직하게는, 고체 담체 및 에키노칸딘형 화합물의 착물을 생성물이 용해될 수 있는 용매, 예를 들어 알코올류(예컨대 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올), DMF 또는 DMSO와 배합하여 고체 담체로부터 생성물을 분리할 수 있다. 그 다음 고체 담체를 여과하여 정제된 생성물을 얻는다. 그 다음 이 정제된 생성물을 함유하는 여과액을 임의의 공지된 침전 방법 또는 크로마토그래피 방법에 의해 더 정제할 수 있다.
상기 정제된 에키노칸딘형 화합물을 카스포펀진, 아니둘라펀진 또는 마이카펀진과 같은 합성 생성물을 제조하는 데 더 사용할 수 있다.
소정의 바람직한 구체예와 관련하여 본 발명을 기술하였지만, 다른 구체예도 본 명세서의 이해(consideration)에 의해 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 본 발명의 방법을 상세하게 기술하는 하기의 실시예와 관련하여 더 정의된다. 실시예들이 뉴모칸딘 B0, WF 11899A 및 에키노칸딘 B에 초점을 두고 있지만, 당업자라면 에키노칸딘류 중 다른 천연 생성물을 정제하기 위해 별도의 실험 없이 상기 방법이 채택될 수 있음을 인지할 것이다. 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한, 물질 및 방법에 대한 여러 가지 변경을 수행할 수 있음은 또한 당업자에게 자명한 것이다.
실시예 1
단계 a: 정제
뉴모칸딘 B0를 함유하는 발효액 1 ㎏을 이소-부틸 아세테이트 0.5 리터와 배합하여 2상 시스템을 형성하였다. 이 두 상을 원심분리기를 사용하여 분리하였다. 이소-부틸 아세테이트 상을 제거하였다. 모든 뉴모칸딘 B0가 정제된 발효액에 남아있었다.
이 정제된 발효액을 그 다음 이소-부탄올 500 ㎖로 추출하였다. 그 후에 별도의 이소-부탄올 500 ㎖를 사용하여 추출을 반복하였다. 2종의 얻어진 이소-부탄올 상을 배합하여 이소-부탄올 상 1090 ㎖를 얻었다. 정제 및 추출의 전반적인 수율은 대략 100%였다.
단계 b: 결정화
이소-부탄올 상을 200 ㎖씩 5개의 부분으로 나누었다. 뉴모칸딘 B0 미정제물을 하기의 방법에 의해 각각의 부분으로부터 결정화하였다.
i) 하나의 200 ㎖ 부분을 감압하에 3.5 g으로 농축시켰다. 그 다음 이소-부틸아세테이트 17.5 ㎖를 첨가하였다. 얻어진 용액을 0∼5℃로 냉각시켰다. 이 용액을 대략 20 시간 동안 정치시키고, 그동안 결정화가 일어났다. 그 다음 생성된 결정을 용액으로부터 여과하고 건조하였다. 미정제 생성물의 수율은 37%였다.
ii) 다른 200 ㎖ 부분을 감압하에 3.5 g으로 농축시켰다. 그 다음 아세토니트릴 17.5 ㎖를 첨가하였다. 얻어진 용액을 0∼5℃로 냉각시켰다. 이 용액을 대략 20 시간 동안 정치시키고, 그동안 결정화가 일어났다. 그 다음 생성된 결정을 용액으로부터 여과하고 건조하였다. 미정제 생성물의 수율은 75%였다.
iii) 다른 200 ㎖ 부분을 감압하에 3.5 g으로 농축시켰다. 그 다음 에틸 아세테이트 17.5 ㎖를 첨가하였다. 얻어진 용액을 0∼5℃로 냉각시켰다. 이 용액을 대략 20 시간 동안 정치시키고, 그동안 결정화가 일어났다. 그 다음 생성된 결정을 용액으로부터 여과하고 건조하였다. 미정제 생성물의 수율은 84%였다.
iv) 다른 200 ㎖ 부분을 감압하에 3.5 g으로 농축시켰다. 그 다음 부틸 아세테이트 3.5 ㎖ 및 아세토니트릴 10.5 ㎖를 첨가하였다. 얻어진 용액을 0∼5℃로 냉각시켰다. 이 용액을 대략 20 시간 동안 정치시키고, 그동안 결정화가 일어났다. 그 다음 생성된 결정을 용액으로부터 여과하고 건조하였다. 미정제 생성물의 수율 은 83%였다.
v) 하나의 200 ㎖ 부분을 감압하에 3.5 g으로 농축시켰다. 그 다음 에틸 아세테이트 3.5 ㎖ 및 아세토니트릴 10.5 ㎖를 첨가하였다. 이어서, 이소-부틸아세테이트 17.5 ㎖를 넣었다. 얻어진 용액을 0∼5℃로 냉각시켰다. 이 용액을 대략 20 시간 동안 정치시키고, 그동안 결정화가 일어났다. 그 다음 생성된 결정을 용액으로부터 여과하고 건조하였다. 미정제 생성물의 수율은 74%였다.
실시예 2
단계 a: 정제
뉴모칸딘 B0를 함유하는 발효액 1 ㎏을 n-부틸아세테이트 0.5 리터와 배합하여 2상 시스템을 형성하였다. 이 두 상을 원심분리기를 사용하여 분리하였다. n-부틸아세테이트 상을 제거하여 모든 뉴모칸딘 B0가 정제된 발효액에 남아있었다.
이 정제된 발효액을 그 다음 n-부탄올 500 ㎖로 추출하였다. 그 후에 별도의 n-부탄올 500 ㎖를 사용하여 추출을 반복하였다. 2종의 얻어진 n-부탄올 상을 배합하여 n-부탄올 상 1150 ㎖를 얻었다.
단계 b: 결정화
n-부탄올 상을 감압하에 18 g으로 농축시켰다. 그 다음 이소-부틸아세테이트 18 ㎖ 및 아세토니트릴 54 ㎖를 첨가하였다. 얻어진 용액을 0∼5℃로 냉각시켰다. 이 용액을 대략 20 시간 동안 정치시키고, 그동안 결정화가 일어났다. 그 다음 생성된 결정을 용액으로부터 여과하고 건조하였다. 미정제 생성물의 수율은 64%였다.
실시예 3
단계 a: 정제
뉴모칸딘 B0를 함유하는 발효액 1 ㎏을 n-프로필아세테이트 0.5 리터와 배합하여 2상 시스템을 형성하였다. 이 두 상을 원심분리기를 사용하여 분리하였다. n-프로필아세테이트 상을 제거하여 모든 뉴모칸딘 B0가 정제된 발효액에 남아있었다.
이 정제된 발효액을 그 다음 이소-부탄올 500 ㎖로 추출하였다. 그 후에 별도의 이소-부탄올 500 ㎖를 사용하여 추출을 반복하였다. 2종의 얻어진 이소-부탄올 상을 배합하여 이소-부탄올 상 1140 ㎖를 얻었다.
단계 b: 결정화
이소-부탄올 상을 감압하에 9 g으로 농축시켰다. 그 다음 이소-부틸아세테이트 9 ㎖ 및 아세토니트릴 27 ㎖를 첨가하였다. 얻어진 용액을 0∼5℃로 냉각시켰다. 이 용액을 대략 20 시간 동안 정치시키고, 그동안 결정화가 일어났다. 그 다음 생성된 결정을 용액으로부터 여과하고 건조하였다. 미정제 생성물의 수율은 80%였다.
실시예 4
단계 a: 정제
뉴모칸딘 B0를 함유하는 발효액 1 ㎏을 톨루엔 0.5 리터와 배합하여 2상 시스템을 형성하였다. 이 두 상을 원심분리기를 사용하여 분리하였다. 톨루엔 상을 제거하여 모든 뉴모칸딘 B0가 정제된 발효액에 남아있었다.
이 정제된 발효액을 그 다음 이소-부탄올 500 ㎖로 추출하였다. 그 후에 별도의 이소-부탄올 500 ㎖를 사용하여 추출을 반복하였다. 2종의 얻어진 이소-부탄올 상을 배합하여 이소-부탄올 상 1120 ㎖를 얻었다.
단계 b: 결정화
이소-부탄올 상을 감압하에 12 g으로 농축시켰다. 그 다음 이소-부틸아세테이트 12 ㎖ 및 아세토니트릴 36 ㎖를 첨가하였다. 얻어진 용액을 0∼5℃로 냉각시켰다. 이 용액을 대략 20 시간 동안 정치시키고, 그동안 결정화가 일어났다. 그 다음 생성된 결정을 용액으로부터 여과하고 건조하였다. 미정제 생성물의 수율은 52%였다.
실시예 5
단계 a: 정제
뉴모칸딘 B0를 함유하는 발효액 1 ㎏을 헥산 0.5 리터와 배합하여 2상 시스템을 형성하였다. 이 두 상을 원심분리기를 사용하여 분리하였다. 헥산 상을 제거하여 모든 뉴모칸딘 B0가 정제된 발효액에 남아있었다.
이 정제된 발효액을 그 다음 이소-부탄올 500 ㎖로 추출하였다. 그 후에 별도의 이소-부탄올 500 ㎖를 사용하여 추출을 반복하였다. 2종의 얻어진 이소-부탄올 상을 배합하여 이소-부탄올 상 910 ㎖를 얻었다.
단계 b: 결정화
이소-부탄올 상을 감압하에 18 g으로 농축시켰다. 그 다음 이소-부틸아세테 이트 18 ㎖ 및 아세토니트릴 54 ㎖를 첨가하였다. 얻어진 용액을 0∼5℃로 냉각시켰다. 이 용액을 대략 20 시간 동안 정치시키고, 그동안 결정화가 일어났다. 그 다음 생성된 결정을 용액으로부터 여과하고 건조하였다. 미정제 생성물의 수율은 88%였다.
실시예 6
발효된 배양액을 여과하고, 여과된 균사체를 몇개의 부분으로 쪼개었다. 여과된 균사의 각 부분을 여과된 균사체 부분의 질량 2배가 되는 부피의 용매에 현탁시켰다. 교반 후, 균사를 용매로부터 여과하였다. 각각의 용매는 불순물을 제거하였다. 에틸 아세테이트, 헥산, 석유 에테르 및 디클로로메탄과 같은 용매로 무시할만한 손실이 있는 정제를 하였다. 아세톤, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올 및 아세토니트릴과 같은 용매로 상당한 손실이 있는 정제를 하였다.
실시예 7
단계 a:
190 ㎏ 뉴모칸딘 발효된 배양액(뉴모칸딘 B0 414.8 g을 함유)을 pH 5.0∼7.0에서 이소-부탄올 95 L로 추출하였다. 별도의 이소부탄올 95 L를 사용하여 추출 단계를 반복하였다. 2종의 이소부탄올 상들을 혼합하여 이소부탄올 상 191 L를 얻었다.
혼합한 이소-부탄올 상을 증발시켜 부피 25 L가 되었다. 이 농축액을 pH 4.0∼4.5에서 12.5 L의 물로 두 차례 세척하였다. 산성 세척 후, 상기 농축액을 pH 6.0∼6.5에서 6 L의 물로 두 차례 세척하였다.
세척한 농축액을 활성탄 193 g을 사용하여 맑게 하였다. 숯 처리 후, 상기 농축액을 증발시켜 부피 4.8 L가 되었다. 최종 농축액에 이소-부틸 아세테이트 3.6 L를 넣고, 용액을 증발시켜 4.8 L가 되었다. 이 단계를 반복하였다.
얻어진 최종 농축액은 296.7 g 뉴모칸딘 B0를 수득하였다. 수율은 71.5% 이었다.
단계 b: 다른 담체로의 미정제 뉴모칸딘 B 0 의 침전:
1. 규조토(사용된 유형은 FW-14) 59.4 g을 부피가 250 ㎖인 최종 농축액에 넣었다. 이 현탁액에 400 ㎖의 아세토니트릴을 넣고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 더 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴-이소부틸 아세테이트(1:1) 혼합물 500 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 12 시간 동안 40℃에서 건조하였다. 미정제 생성물 87.2 g(뉴모칸딘 B0 13.88 g을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 89.9% 이었다.
2. 밀가루 59.4 g을 부피 250 ㎖인 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 400 ㎖를 현탁액에 넣고, 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 더 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴-이소부틸 아세테이트(1:1) 혼합물 500 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 12 시간 동안 40℃에서 건조하였다. 미정제 생성물 77.09 g(뉴모칸딘 B0 8.72 g을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 56.5% 이었다.
3. 옥수수 전분 59.4 g을 부피 250 ㎖인 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트 릴 400 ㎖를 현탁액에 넣고, 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 더 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴-이소부틸 아세테이트(1:1) 혼합물 500 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 12 시간 동안 40℃에서 건조하였다. 미정제 생성물 80.02 g(뉴모칸딘 B0 12.63 g을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 81.8% 이었다.
4. 감자 전분 59.4 g을 부피 250 ㎖인 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 400 ㎖를 현탁액에 넣고, 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 더 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴-이소부틸 아세테이트(1:1) 혼합물 500 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 12 시간 동안 40℃에서 건조하였다. 미정제 생성물 78.31 g(뉴모칸딘 B0 14.56 g을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 94.3% 이었다.
5. 벤토나이트(사용된 유형은 S-100) 59.4 g을 부피 250 ㎖의 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 400 ㎖를 현탁액에 넣고, 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 더 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴-이소부틸 아세테이트(1:1) 혼합물 500 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 12 시간 동안 40℃에서 건조하였다. 미정제 생성물 80.97 g(뉴모칸딘 B0 11.14 g을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 72.2% 이었다.
6. 벤토나이트(사용된 유형은 T2-350) 59.4 g을 부피 250 ㎖의 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 400 ㎖를 현탁액에 넣고, 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 더 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴-이소부틸 아 세테이트(1:1) 혼합물 500 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 12 시간 동안 40℃에서 건조하였다. 미정제 생성물 81.14 g(뉴모칸딘 B0 10.70 g을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 69.3% 이었다.
7. 활성탄 59.4 g을 부피 500 ㎖의 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 800 ㎖를 현탁액에 넣고, 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 더 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴-이소부틸 아세테이트(1:1) 혼합물 1000 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 12 시간 동안 40℃에서 건조하였다. 미정제 생성물 109.02 g(뉴모칸딘 B0 25.44 g을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 82.4% 이었다.
8. 펄라이트(사용된 유형은 CP-800) 19.8 g을 부피 250 ㎖의 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 400 ㎖를 현탁액에 넣고, 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 더 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴-이소부틸 아세테이트(1:1) 혼합물 500 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 12 시간 동안 40℃에서 건조하였다. 미정제 생성물 47.46 g(뉴모칸딘 B0 13.54 g을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 87.7% 이었다.
9. 아비셀(사용된 유형은 200) 59.4 g을 부피 250 ㎖의 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 400 ㎖를 현탁액에 넣고, 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 더 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴-이소부틸 아세테이트(1:1) 혼합물 500 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 12 시간 동안 40℃에서 건조 하였다. 미정제 생성물 81.65 g(뉴모칸딘 B0 9.62 g을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 62.3% 이었다.
10. 활성 갈탄 29.7 g을 부피 250 ㎖의 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 400 ㎖를 현탁액에 넣고, 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 더 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴-이소부틸 아세테이트(1:1) 혼합물 500 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 12 시간 동안 40℃에서 건조하였다. 미정제 생성물 53.56 g(뉴모칸딘 B0 13.45 g을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 87.1% 이었다.
11. 소수성 펄라이트 19.8 g을 부피 250 ㎖의 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 400 ㎖를 현탁액에 넣고, 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 더 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴-이소부틸 아세테이트(1:1) 혼합물 500 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 12 시간 동안 40℃에서 건조하였다. 미정제 생성물 43.83 g(뉴모칸딘 B0 13.43 g을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 86.9% 이었다.
실시예 8
단계 a:
100.0 ㎏의 WF-11899A 희석 발효된 배양액(대략 36.5 g의 WF-11899A를 함유)을 pH 5.0∼7.0에서 이소-부탄올 100.0 L로 추출하였다. 별도의 이소-부탄올 60.0 L를 사용하여 추출 단계를 반복하였다. 2종의 얻어진 이소-부탄올 상을 혼합하여 이소-부탄올 상 161.0 L를 얻었다.
혼합한 이소-부탄올 상을 증발시켜 부피 12.3 L가 되었다. 이 농축액을 pH 4.0∼4.5에서 물 6.0 L로 세척하였다. 산성 세척 후, 농축액을 pH 6.0∼6.5에서 물 6.0 L로 세척하였다.
세척한 농축액을 활성탄 9.1 g을 사용하여 맑게 하였다. 숯 처리 후, 농축액을 두 부분으로 구분하였다. 제1의 부분(6.9 L)을 증발시켜 부피 1.3 L가 되었다. 동등한 부피(1.3 L)의 이소부틸 아세테이트를 농축액에 넣고, 이 용액을 다시 증발시켜 이전 단계의 부피가 되었다. 이 단계를 두 차례 반복하였다. 제1의 최종 농축액 중량은 740.41 g 이었다.
제2의 부분(3.3 L)을 증발시켜 중량 337.3 g이 되었다. 부피(300 ㎖)의 이소부틸 아세테이트를 농축액에 넣고, 이 용액을 다시 증발시켜 이전 단계의 부피가 되었다. 이 단계를 두 차례 반복하였다. 제2의 최종 농축액 중량은 316.07 g 이었다.
얻어진 최종 농축액은 20.25 g의 WF-11899A를 함유하였다. 수율은 55.5% 이었다.
단계 b: 다른 담체로의 미정제 WF -11899A ( FR -901379)의 침전:
1. 규조토(사용된 유형은 FW-14) 6.0 g 및 이소프로필 아세테이트 5.0 ㎖를 중량 10 g인 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 35 ㎖를 현탁액에 넣고, 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 더 교반하였다. 이 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴 10 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 40℃에서 12 시간 동안 건조하였다. 10.0 g의 미정제 생성물(WF-11899A 213.1 ㎎을 함유)을 제조하였다. 침전 수율 은 98.6% 이었다.
2. 규조토(사용된 유형은 FW-14) 300.0 g 및 이소프로필 아세테이트 178.0 ㎖를 중량 336.0 g인 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 1176 ㎖를 현탁액에 넣고, 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 더 교반하였다. 이 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴 336 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 40℃에서 12 시간 동안 건조하였다. 451.6 g의 미정제 생성물(WF-11899A 6.66 g을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 91.7% 이었다.
3. 펄라이트(사용된 유형은 CP-800) 6.0 g 및 이소프로필 아세테이트 5.0 ㎖를 중량 10 g인 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 35 ㎖를 현탁액에 넣고, 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 더 교반하였다. 이 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴 10 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 40℃에서 12 시간 동안 건조하였다. 9.61 g의 미정제 생성물(WF-11899A 221.3 ㎎을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 98.3% 이었다.
4. 아비셀(사용된 유형은 200) 6.0 g 및 이소프로필 아세테이트 5.0 ㎖를 중량 10 g인 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 35 ㎖를 현탁액에 넣고, 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 더 교반하였다. 이 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴 10 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 40℃에서 12 시간 동안 건조하였다. 9.71 g의 미정제 생성물(WF-11899A 202.4 ㎎을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 93.6% 이었다.
5. 아비셀(사용된 유형은 200) 400.0 g 및 이소프로필 아세테이트 200.0 ㎖ 를 중량 404.0 g인 최종 농축액에 넣었다. 아세토니트릴 1414 ㎖를 현탁액에 넣고, 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 더 교반하였다. 이 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴 404 ㎖로 현탁시켰다. 여과 케이크를 40℃에서 12 시간 동안 건조하였다. 549.2 g의 미정제 생성물(WF-11899A 8.31 g을 함유)을 제조하였다. 침전 수율은 95.5% 이었다.
실시예 9:
단계 a:
에키노칸딘 발효된 배양액을 pH 5.0∼7.0에서 절반 부피의 이소-부탄올을 사용하여 추출한다. 별도의 절반 부피의 이소-부탄올을 사용하여 상기 추출 단계를 반복하였다. 2종의 얻어진 이소-부탄올 상을 혼합한다.
혼합한 이소-부탄올 상을 농축시키고, 산성 및 중성 pH에서 세척한다. 세척한 농축액을 활성탄을 사용하여 맑게 한다. 숯 처리 후, 농축액을 증발시켜 유성 잔여물을 얻었다. 이소부틸 아세테이트를 최종 농축액에 넣고, 이 용액을 다시 증발시켜 출발 부피가 되었다. 이 단계를 반복하였다.
단계 b: 미정제 에키노칸딘의 침전:
규조토(사용된 유형은 FW-14)를 최종 농축액에 첨가한다. 아세토니트릴을 현탁액에 넣고 미정제 생성물을 침전시킨다. 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 더 교반한다. 이 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴-이소부틸 아세테이트(1:1) 혼합물로 현탁시킨다. 여과 케이크를 12 시간 동안 40℃에서 건조한다.
실시예 10: 담체로부터 활성 물질( 뉴모칸딘 B 0 )의 분리
활성 물질 1307 g을 함유하는 뉴모칸딘 B0 미정제 생성물(규조토 상에서, 분석: 13.07 %, HPLC 순도 35.7%) 10 ㎏을 약 1 시간 동안 노말 프로판올 100 L와 교반하였다. 규조토를 여과하고, 노말 프로판올 10 L를 사용하여 세척하였다. 혼합한 프로판올성 용액(대략 110 L)을 감압하에 증발시켜 부피 11.4 L가 되었다. 이소프로필 아세테이트 46 L를 이 농축액에 넣고, 혼합물을 (-)10℃∼(-)20℃로 냉각시켰다. 혼합물을 (-)10℃∼(-)20℃에서 추가 16∼18 시간 동안 교반하였다. 침전된 물질을 여과하고, 이소프로필 아세테이트 10 L로 세척하였다. 뉴모칸딘 B0를 대략 12 시간 동안 40℃에서 건조하였다. 생성물의 질량은 4.89 ㎏이었다. 분석치는 26.21% 이었고, HPLC 순도는 41.12였다. 이 단계의 수율은 98%였다.

Claims (67)

  1. (a) 1종 이상의 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매로 에키노칸딘형 화합물을 함유하는 원액(whole broth)으로부터 불순물을 추출하여, 수상 및 유기상을 포함하는 제1의 2상 시스템을 얻는 단계;
    (b) 상기 유기상을 제거하여 수상을 얻는 단계;
    (c) 수불혼화성 유기 용매를 사용하여 수상으로부터 에키노칸딘형 화합물을 추출하여, 제2의 2상 시스템을 얻는 단계; 및
    (d) 정제된 에키노칸딘형 화합물을 회수하는 단계
    를 포함하며, 단계 (a)에서의 수불혼화성 유기 용매와 (c)에서의 수불혼화성 유기 용매는 상이한 것인 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 에키노칸딘형 화합물은 뉴모칸딘 B0, WF-11899 및 에키노칸딘으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 에키노칸딘형 화합물은 원액 중에 약 0.2 g/L∼약 15 g/L의 농도로 존재하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비극성 또는 약극성의 수불 혼화성 유기 용매는 C5 -8 지방족 알칸, C6 -8 방향족 탄화수소, C4 -8 에테르 및 C3 -6 에스테르로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매는 헵탄, 헥산, 옥탄, 시클로헥산, 톨루엔, 디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 디부틸에테르, 이소-부틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, n-프로필 아세테이트, 이소프로필 아세테이트 또는 에틸 아세테이트인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매는 이소-부틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, n-프로필 아세테이트, 이소프로필 아세테이트 또는 에틸 아세테이트인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 2상 시스템 중 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매의 양은 원액의 약 5 부피%∼약 90 부피%인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매의 양은 원액의 약 50 부피%∼약 90 부피%인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매의 양은 원액의 약 10 부피%∼약 50 부피%인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 비극성 또는 약극성의 수불혼화성 유기 용매의 양은 원액의 약 30 부피%∼약 50 부피%인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서의 수불혼화성 유기 용매는 수불혼화성 알코올인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 수불혼화성 알코올은 C4 -6 알코올인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 C4 -6 알코올은 이소부탄올 또는 n-부탄올인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 추출을 반복하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 1종 이상의 역용매와 회수된 에키노칸딘형 화합물을 혼합하는 단계를 포함하는 공정으로 에키노칸딘형 화합물을 결정화하는 단계를 더 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 역용매는 에틸 아세테이트, 이소부틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, tert-부틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴(ACN), 에틸아세테이트와 아세토니트릴의 혼합물 및 아세토니트릴(ACN)과 이소-부틸아세테이트의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 역용매는 아세토니트릴인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 역용매는 에틸아세테이트 또는 이소부틸 아세테이트이고, 침전은 냉각 단계 또는 제2의 역용매의 첨가 단계 중 하나에 의해 유도하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 냉각 단계는 약 5℃∼약 -20℃의 온도까지 실시하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 냉각은 약 5℃∼약 0℃의 온도까지 실시하는 것인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 제2의 역용매는 아세톤 또는 아세토니트릴인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제2의 역용매는 아세토니트릴 또는 아세톤이고, 침전은 약 5℃∼약 -20℃의 온도로 냉각시켜 유도하는 것인 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 에키노칸딘형 화합물과 역용매의 혼합물을 약 15분 이상의 시간 동안 약 5℃∼약 -20℃의 온도로 냉각시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 냉각은 약 5℃∼약 0℃의 온도까지 실시하는 것인 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 시간은 약 10 시간∼약 24 시간인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 시간은 약 20 시간인 방법.
  27. 1종 이상의 역용매를 사용하여 에키노칸딘형 화합물을 결정화하는 단계를 포함하는, 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법.
  28. 제27항에 있어서, 출발 에키노칸딘형 화합물은 발효액의 추출로부터 얻어진 것인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 역용매는 에틸 아세테이트, 이소부틸 아세테이트, n- 부틸 아세테이트, tert-부틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴(ACN), 에틸아세테이트와 아세토니트릴의 혼합물 및 아세토니트릴(ACN)과 이소-부틸아세테이트의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 역용매는 아세토니트릴인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 역용매는 에틸아세테이트 또는 이소부틸 아세테이트이고, 침전은 냉각 단계 또는 제2의 역용매의 첨가 단계 중 하나에 의해 유도하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 냉각 단계는 약 5℃∼약 -20℃의 온도까지 실시하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 냉각은 약 5℃∼약 0℃의 온도까지 실시하는 것인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 제2의 역용매는 아세톤 또는 아세토니트릴인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 제2의 역용매는 아세토니트릴 또는 아세톤이고, 침전은 약 5℃∼약 -20℃의 온도로 냉각시켜 유도하는 것인 방법.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 에키노칸딘형 화합물과 역용매의 혼합물을 약 15분 이상의 시간 동안 약 5℃∼약 -20℃의 온도로 냉각시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 냉각은 약 5℃∼약 0℃의 온도까지 실시하는 것인 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 시간은 약 10 시간∼약 24 시간인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 시간은 약 20 시간인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 에키노칸딘형 화합물을 카스포펀진(caspofungin), 아니둘라펀진(anidulafungin) 또는 마이카펀진(mycafungin)으로 전환하는 단계를 더 포함하는 방법.
  41. (a) 수불혼화성 유기 용매를 사용하여 발효액으로부터 또는 발효액에서 얻어진 여과된 균사체로부터 에키노칸딘형 화합물을 추출하여, 수상 및 유기상을 포함하는 2상 시스템을 얻거나 또는 함수 유기상을 얻는 단계;
    (b) 에키노칸딘형 화합물을 회수하는 단계; 및
    (c) 회수된 에키노칸딘형을 1종 이상의 역용매 및 고체 담체와 함께 배합하 여 정제된 에키노칸딘형 화합물을 얻는 단계
    를 포함하는 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법.
  42. 제41항에 있어서, 단계 (a)에서의 수불혼화성 유기 용매는 수불혼화성 알코올인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 수불혼화성 알코올은 C4 -6 알코올인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 C4 -6 알코올은 이소부탄올 또는 n-부탄올인 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서의 추출은 pH 약 2∼약 8에서 수행하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 pH는 약 5∼약 7인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 pH는 약 2∼약 4이고, 추출은 약 10℃ 미만의 온도로 냉각하면서 수행하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 냉각은 약 0℃∼약 10℃의 온도까지 실시하는 것인 방법.
  49. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 추출 단계 (a)를 반복하는 것인 방법.
  50. 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서, 회수된 에키노칸딘형 화합물을 역용매 및 고체 담체와 배합하기 이전에, 회수된 에키노칸딘형 화합물을 세척하는 단계를 더 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 세척 단계는 회수된 에키노칸딘형 화합물을 물과 배합하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 세척 단계는 두 단계를 포함하며, 제1 단계는 pH가 약 4∼약 6.5인 물을 사용하고, 제2 단계는 pH가 약 4∼약 6.5인 물을 사용하는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 제1 단계 세척은 pH가 약 4∼약 4.5인 물을 사용하고, 제2 단계 세척은 pH가 약 6∼약 6.5인 물을 사용하는 것인 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 세척은 발효액으로부터 유래된 고체 잔여물의 약 20 중량%∼약 50 중량%를 제거하는 것인 방법.
  55. 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서와 같이, 회수된 에키노칸딘형 화합물을 역용매 및 고체 담체와 배합하기 이전에, 회수된 에키노칸딘형 화합물을 활성탄으로 처리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  56. 제41항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 에키노칸딘형 화합물을 1종 이상의 역용매 및 고체 담체와 배합하여 정제된 에키노칸딘형 화합물을 얻는 단계를 포함하는, 에키노칸딘형 화합물의 결정화 단계를 더 포함하는 방법.
  57. 제41항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 담체는 활성탄, 규조토, 밀가루, 옥수수 전분, 감자 전분, 벤토나이트, 펄라이트, 아비셀, 소수성 펄라이트, 활성 갈탄분, 탄소 및 셀룰로스 생성물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  58. 제41항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역용매는 에틸 아세테이트, 이소부틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, tert-부틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴(ACN), 에틸아세테이트와 아세토니트릴의 혼합물 및 이소-부틸아세테이트와 아세토니트릴(ACN)의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  59. 제41항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 에키노칸딘형 화합물을 회수하는 단계는 에키노칸딘형 화합물, 고체 담체 및 역용매의 혼합물을 여과하는 단계, 및 에키노칸딘형 화합물이 흡수되어 있는 여과된 고체 담체를 아세토니트릴, 아세톤 또는 2종의 유기 용매의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 용매에 현탁시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 2종의 유기 용매의 혼합물은 이소부틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 에틸 아세테이트, 옥탄으로 이루어진 군 중에서 선택되는 제1의 용매, 및 아세토니트릴 또는 아세톤으로 이루어진 군 중에서 선택되는 제2의 용매를 포함하는 것인 방법.
  61. 제41항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 에키노칸딘형 화합물이 흡수되어 있는 고체 담체를 에키노칸딘형 화합물이 용해될 수 있는 용매와 배합하는 단계에 의해 고체 담체로부터 에키노칸딘형 화합물을 분리하는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 에키노칸딘형 화합물이 용해될 수 있는 용매는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올, 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭시드(DMSO), 이들의 혼합물, 및 이들의 수중 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  63. 에키노칸딘형 화합물을 1종 이상의 역용매 및 고체 담체와 배합하는 단계를 포함하는, 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법.
  64. 제63항에 있어서, 출발 에키노칸딘형 화합물은 발효액의 추출로부터 얻어진 것인 방법.
  65. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 에키노칸딘형 화합물을 카스포펀진, 아니둘라펀진 또는 마이카펀진으로 전환하는 단계를 더 포함하는 방법.
  66. 항진균성 에키노칸딘의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
  67. 제66항에 있어서, 상기 항진균성 에키노칸딘은 카스포펀진, 마이카펀진 및 아니둘라펀진인 용도.
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