CN108865928A - 一种枯草芽孢杆菌及用于制备黄荆子微生态制剂的方法 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌及用于制备黄荆子微生态制剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌，是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21于2018年04月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号为CGMCC No：15544，还公开了采用该菌种进行半固体发酵制备中兽药黄荆子微生态制剂的具体方法。本发明开发出中兽药微生态制剂，芽孢数高，抑菌活力强，蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶活力强，可以应用于畜牧业的无抗养殖，能更好地达到防病控病，促进牲畜生长发育的目的，有很好的市场前景。

Description

一种枯草芽孢杆菌及用于制备黄荆子微生态制剂的方法
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，一种枯草芽孢杆菌及用于制备黄荆子微生态制剂的方法。
背景技术
抗生素在养殖业中大规模应用对动物养殖有积极的作用，但是也有负面的影响，比如抗生素残留、耐药菌出现的安全问题，故寻找抗生素的替代品成为科学研究的重点与热点。大量研究表明，以中药材为主要发酵基质制备的中兽药微生态制剂在无抗养殖中发挥重要作用。中兽药微生态制剂结合了中药材与有益菌的功效，既能充分发挥中药材本身的功效，弥补微生态制剂在生产应用中生效慢的缺陷，同时中兽药微生态制剂中微生物代谢产生的有益因子与中兽药本身的功效结合在一起，能发挥出一加一大于二的效果，故发酵中兽药有“中兽药、有益菌、酶制剂、益生素”四合一的特性，有望应用于畜牧业生产实现无抗养殖，从而能更好地达到防病控病，促进生长发育的目的，开发出中兽药微生态制剂，有很好的市场前景。
黄荆子，别名布荆子、黄金子、五指柑、土常山、黄荆条，来源于马鞭草科植物黄荆VitexnegundoL.的果实。根黄白色，产于山东、江苏、浙江、江西、湖南、四川、广西等地。味辛、苦，性温，归肺、胃、肝经；气香行散；具有祛风解表，化痰止咳，理气止痛的功效。主伤风感冒；咳嗽；哮喘；胃痛吞酸；消化不良；食积泻痢；胆囊炎，胆结石；疝气。黄荆子是马鞭草科牡荆属植物黄荆的果实，富含黄酮类化合物，有很好的消炎镇痛解热作用合抗氧化、增强免疫等功效，在畜牧业上黄荆子是一种优良的纯天然催肥促生长剂，饲料添加剂。目前采用枯草芽孢杆菌来兽药的有一些报道，但是采用枯草芽孢杆菌半固体发酵制备中兽药的报道还很少见。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供了一种枯草芽孢杆菌及用于制备黄荆子微生态制剂的方法。本发明开发出中兽药微生态制剂，该方法制备得到的黄荆子微生态制剂芽孢数高，达到1011～12cfu/g，抑菌活力强，其生产的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶活力强，可以应用于畜牧业的无抗养殖，能更好地达到防病控病，促进牲畜生长发育的目的，有很好的市场前景。
为了能够达到上述所述目的，本发明采用以下技术方案：
一种枯草芽孢杆菌，是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21于2018年04月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号为CGMCCNo：15544。
进一步地，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能用于生产surfactin、fengycin、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及纤维素酶。
进一步地，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能够单独或者联合其他有益菌发酵生产中兽药材。
进一步地，一种应用权利要求1～3任一项所述的枯草芽孢杆菌制备黄荆子微生态制剂的方法，包括以下步骤：
(1)培养基质制备：取黄荆子干燥粉末80～85份、黄豆粉5～10份、葡萄糖3～5份、尿素2～4份以及水12～18份，混合搅拌均匀，经高温湿热灭菌得到培养基基质；
(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21使用LB培养基制备成种子液，按5～8％比例向步骤(1)的培养基基质中接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21种子液，搅拌均匀，置于洁净的容器中，堆积高度为2～5cm，容器口用无菌纱布蒙住，发酵4～5d；
(3)在发酵完成的前一天，喷洒无菌氯化钙溶液，并搅拌均匀；
(4)发酵完成后，将黄荆子发酵所得产物置于50～70℃下干燥，粉碎装袋保藏，即得所述黄荆子微生态制剂。
进一步地，在步骤(1)，所述灭菌工艺为水浴煮沸20～30min。
进一步地，在步骤(2)，所述发酵工艺为半固态发酵，发酵的环境温度为25～37℃。
进一步地，在步骤(3)，所述无菌氯化钙溶液的质量浓度为0.2％。
进一步地，在步骤(3)，所述无菌氯化钙溶液的用量为黄荆子干燥粉末的0.5～1％。
进一步地，在步骤(4)，所述干燥工艺为干燥至发酵产物水分含量在10％以下。
进一步地，在步骤(4)，所述黄荆子微生态制剂的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S21芽孢数达到1011～12cfu/g。
本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21筛选鉴定如下：
在无菌条件下，取采集的枯叶样品6～10g，置于无菌离心管中，加入100～200mL无菌蒸馏水，混合均匀，置于85～90℃水浴锅中水浴10～20min，冷却至42～43℃，取50μL样品液均匀涂布于LB固体培养基上，在37℃下培养24h，挑取大小、形态不一致的菌落分别继续划线培养2次，得纯培养菌落，采用25％甘油-70℃保藏待用。
挑取甘油保藏的菌株，使用适量LB液体培养基活化，活化的菌株划线培养于LB固态培养基上，待长出菌落后，挑取菌落接种于LB液体培养基，在37℃下180rpm振荡培养15h得到种子液，挑取种子液，按照1％比例接种于Landy培养基上，在37℃下180rpm振荡培养24h，8000g离心去除菌体，以金黄色葡萄球菌及大肠杆菌为指示菌，采用琼脂扩散法测试上清液抑菌活性，筛选对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有抑制效果的菌株，提取纯化其16SrDNA，测序分析，NCBI的GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)数据库和http://www.ezbiocloud.net数据库分析，根据序列同源性，确定菌株的种属关系，最终筛选得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21的特征：能够产抗菌脂肽surfactin、fenycin、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及纤维素酶，且能够单独或者联合其他有益菌发酵生产中兽药材，例如黄荆子微生态制剂，制成的中兽药微生态制剂中枯草芽孢杆菌芽孢数达到1011～12cfu/g，其16SrDNA序列为：
CTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGCCGAA。
本发明方法制成的中兽药黄荆子微生态制剂可用于饲养动物，能提升动物饲料利用率。
由于本发明采用了以上技术方案，具有以下有益效果：
(1)本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能用于生产surfactin、fengycin、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶以及用于发酵生产中兽药材，且其制备中兽药中发酵方式采用半固体发酵，其生产的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶活力强。
(2)本发明的黄荆子微生态制剂在提高家禽日增重和降低死亡率上均有显著效果。
(3)本发明开发出中兽药微生态制剂，该方法制备得到的黄荆子微生态制剂芽孢数高，达到1011～12cfu/g，抑菌活力强，可以应用于畜牧业的无抗养殖，能更好地达到防病控病，促进牲畜生长发育的目的，有很好的市场前景。
(4)本发明方法制备得到的黄荆子微生态制剂具有抑制有害菌活性，提高有益菌活性的作用，如提高蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶的活性，用于饲喂动物能够提升饲料利用率，具有促进其生长，提升免疫力的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实例或现有技术中的技术方案，下面将对实施实例或现有技术描述中所需要的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
图1为本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21产抗菌脂肽一级质谱图；
图2为本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21产surfactin鉴定流程图；
图3为本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21产fengycin鉴定过程图；
图4为本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21产酶特性实验图。
微生物保藏情况说明：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21，该菌种于2018年04月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)保藏，菌种保藏号为CGMCCNo：15544。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S21于2018年04月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号为CGMCCNo：15544；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能用于生产surfactin、fengycin、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及纤维素酶；所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S21能够单独或者联合其他有益菌发酵生产中兽药材。
一种应用上述所述的枯草芽孢杆菌制备黄荆子微生态制剂的方法，包括以下步骤：
(1)培养基质制备：取黄荆子干燥粉末80份、黄豆粉5份、葡萄糖3份、尿素2份以及水12份，混合搅拌均匀，经高温湿热灭菌得到培养基基质；所述灭菌工艺为水浴煮沸20min；
(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21使用LB培养基制备成种子液，按5％比例向步骤(1)的培养基基质中接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21种子液，搅拌均匀，置于洁净的容器中，堆积高度为2cm，容器口用无菌纱布蒙住，发酵4d；所述发酵工艺为半固态发酵，发酵的环境温度为25℃；
(3)在发酵完成的前一天，喷洒无菌氯化钙溶液，并搅拌均匀；所述无菌氯化钙溶液的质量浓度为0.2％；所述无菌氯化钙溶液的用量为黄荆子干燥粉末的0.5％；
(4)发酵完成后，将黄荆子发酵所得产物置于50℃下干燥，粉碎装袋保藏，即得所述黄荆子微生态制剂；所述干燥工艺为干燥至发酵产物水分含量在10％以下；所述黄荆子微生态制剂的枯草芽孢杆菌芽孢数达到1011～12cfu/g。
实施例2
一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S21于2018年04月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号为CGMCCNo：15544；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能用于生产surfactin、fengycin、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及纤维素酶；所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S21能够单独或者联合其他有益菌发酵生产中兽药材。
一种应用上述所述的枯草芽孢杆菌制备黄荆子微生态制剂的方法，包括以下步骤：
(1)培养基质制备：取黄荆子干燥粉末85份、黄豆粉10份、葡萄糖5份、尿素4份以及水18份，混合搅拌均匀，经高温湿热灭菌得到培养基基质；所述灭菌工艺为水浴煮沸30min；
(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21使用LB培养基制备成种子液，按8％比例向步骤(1)的培养基基质中接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21种子液，搅拌均匀，置于洁净的容器中，堆积高度为5cm，容器口用无菌纱布蒙住，发酵5d；所述发酵工艺为半固态发酵，发酵的环境温度为37℃；
(3)在发酵完成的前一天，喷洒无菌氯化钙溶液，并搅拌均匀；所述无菌氯化钙溶液的质量浓度为0.2％；所述无菌氯化钙溶液的用量为黄荆子干燥粉末的1％；
(4)发酵完成后，将黄荆子发酵所得产物置于70℃下干燥，粉碎装袋保藏，即得所述黄荆子微生态制剂；所述干燥工艺为干燥至发酵产物水分含量在10％以下；所述黄荆子微生态制剂的枯草芽孢杆菌芽孢数达到1011～12cfu/g。
实施例3
一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S21于2018年04月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号为CGMCCNo：15544；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能用于生产surfactin、fengycin、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及纤维素酶；所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S21能够单独或者联合其他有益菌发酵生产中兽药材。
一种应用上述所述的枯草芽孢杆菌制备黄荆子微生态制剂的方法，包括以下步骤：
(1)培养基质制备：取黄荆子干燥粉末81份、黄豆粉6份、葡萄糖3.5份、尿素2.5份以及水13份，混合搅拌均匀，经高温湿热灭菌得到培养基基质；所述灭菌工艺为水浴煮沸22min；
(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21使用LB培养基制备成种子液，按6％比例向步骤(1)的培养基基质中接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21种子液，搅拌均匀，置于洁净的容器中，堆积高度为3cm，容器口用无菌纱布蒙住，发酵4.2d；所述发酵工艺为半固态发酵，发酵的环境温度为26℃；
(3)在发酵完成的前一天，喷洒无菌氯化钙溶液，并搅拌均匀；所述无菌氯化钙溶液的质量浓度为0.2％；所述无菌氯化钙溶液的用量为黄荆子干燥粉末的0.6％；
(4)发酵完成后，将黄荆子发酵所得产物置于55℃下干燥，粉碎装袋保藏，即得所述黄荆子微生态制剂；所述干燥工艺为干燥至发酵产物水分含量在10％以下；所述黄荆子微生态制剂的枯草芽孢杆菌芽孢数达到1011～12cfu/g。
实施例4
一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S21于2018年04月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号为CGMCCNo：15544；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能用于生产surfactin、fengycin、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及纤维素酶；所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S21能够单独或者联合其他有益菌发酵生产中兽药材。
一种应用上述所述的枯草芽孢杆菌制备黄荆子微生态制剂的方法，包括以下步骤：
(1)培养基质制备：取黄荆子干燥粉末84份、黄豆粉9份、葡萄糖4.5份、尿素3.5份以及水17份，混合搅拌均匀，经高温湿热灭菌得到培养基基质；所述灭菌工艺为水浴煮沸29min；
(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21使用LB培养基制备成种子液，按5～8％比例向步骤(1)的培养基基质中接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21种子液，搅拌均匀，置于洁净的容器中，堆积高度为4cm，容器口用无菌纱布蒙住，发酵4.8d；所述发酵工艺为半固态发酵，发酵的环境温度为34℃；
(3)在发酵完成的前一天，喷洒无菌氯化钙溶液，并搅拌均匀；所述无菌氯化钙溶液的质量浓度为0.2％；所述无菌氯化钙溶液的用量为黄荆子干燥粉末的0.9％；
(4)发酵完成后，将黄荆子发酵所得产物置于65℃下干燥，粉碎装袋保藏，即得所述黄荆子微生态制剂；所述干燥工艺为干燥至发酵产物水分含量在10％以下；所述黄荆子微生态制剂的枯草芽孢杆菌芽孢数达到1011～12cfu/g。
实施例5
一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S21于2018年04月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号为CGMCCNo：15544；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能用于生产surfactin、fengycin、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及纤维素酶；所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S21能够单独或者联合其他有益菌发酵生产中兽药材。
一种应用上述所述的枯草芽孢杆菌制备黄荆子微生态制剂的方法，包括以下步骤：
(1)培养基质制备：取黄荆子干燥粉末83份、黄豆粉8份、葡萄糖4份、尿素3份以及水15份，混合搅拌均匀，经高温湿热灭菌得到培养基基质；所述灭菌工艺为水浴煮沸25min；
(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21使用LB培养基制备成种子液，按6.5％比例向步骤(1)的培养基基质中接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21种子液，搅拌均匀，置于洁净的容器中，堆积高度为3.5cm，容器口用无菌纱布蒙住，发酵4.5d；所述发酵工艺为半固态发酵，发酵的环境温度为31℃；
(3)在发酵完成的前一天，喷洒无菌氯化钙溶液，并搅拌均匀；所述无菌氯化钙溶液的质量浓度为0.2％；所述无菌氯化钙溶液的用量为黄荆子干燥粉末的0.75％；
(4)发酵完成后，将黄荆子发酵所得产物置于60℃下干燥，粉碎装袋保藏，即得所述黄荆子微生态制剂；所述干燥工艺为干燥至发酵产物水分含量在10％以下；所述黄荆子微生态制剂的枯草芽孢杆菌芽孢数达到1011～12cfu/g。
为了进一步说明本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能够产surfactin、fengycin、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及纤维素酶，能用于单独或者联合其他有益菌发酵生产中兽药材，例如黄荆子微生态制剂，且枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21半固体发酵得到的黄荆子微生态制剂能够增加牲畜重量，提高牲畜抗病率，做以下实验：
1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21产抗菌脂肽surfactin、fenycin实验
吸取微量-70℃保藏的枯草芽孢杆菌S21菌液，转置于LB培养基，37℃过夜培养至菌长出，挑取菌液接种于LB固体培养基上并划线培养，待长出菌落，挑取长势良好的单菌落接种于landy培养基上，37℃培养12h得到种子液，种子液按照1％(v/v)接种于landy培养基上，180rpm，37℃培养36h，得到发酵液。用3mol/LHCL调节发酵液pH值至2，搅拌均匀后，静置于4℃温度下12h后，8000g离心得沉淀，沉淀加入原发酵液0.5倍体积的甲醇，调节pH至7，磁力搅拌十分钟，8000g离心得上清液，重复甲醇萃取沉淀一次，合并甲醇萃取液，旋转蒸干，残渣用少量蒸馏水溶解，得粗抗菌脂肽提取物。粗抗菌脂肽初提物使用LH-20进一步分离纯化，洗脱液为纯甲醇，流速1mL/5min，以金黄色葡萄球菌(ATCC25923)做为指示菌，采用琼脂扩散法(制备带金黄色葡萄球菌平板，5mm打孔器打孔，孔中加入洗脱液80μL，37℃下培养24h后测量抑菌圈直径)检测各管洗脱液的活性，得抗菌脂肽精提物。将抗菌脂肽精提物使用安捷伦1100型液相色谱HPLC检测，色谱条件：色谱柱，5TC-C18，波长，210nm，流速，1mL/min，时间：0-20min，90％乙腈(有机相和水相均含0.1％三氟乙酸)。使用安捷伦G6400三重四极杆质谱联用仪进行质谱鉴定，质谱鉴定结果见图1，根据质谱图推断其结构。由图1可知，出现了994.5，1008.5，1022.6，1036.5四个<M+H>离子峰，之间相隔分子量为14，即CH2-，且分子量与surfactin同系物一致，判断为surfactin的同系物。
选择液相图中保留时间靠后的三个峰进一步进行质谱分析，质谱分析结果见图2(A,B,C)，从图2(A)中可知，出现了<M+H>为1008.9的加H离子峰，<M+Na>为1030.7的加Na离子峰，从图2(B)可知，出现了<M-CH2+H>为10022.6的H离子峰，<M-CH2+Na>为1044.5的加Na离子峰，从图2(C)可知，出现了<M-CH2-CH2+H>为10036.5的H离子峰，<M-CH2-CH2+Na>为1058.3的加Na离子峰。对1008.5，1022.6，1036.5进行二级质谱鉴定，结果见图2(a,b,c)，根据二级质谱裂解碎片及文献资料，可以推断出此抗菌脂肽结构为：β-OH-C13-15-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu(Ile)。分别对应分子量1007，1021，1035。其中第七位Leu还有可能为Ile，具体是哪一个氨基酸残基有待进一步分析，推断过程见图2所示。一级质谱中出现的994加H离子峰，根据Surfactin同系物相差CH2-的特性，推断其结构为β-OH-C12-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu(Ile)。可见，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21产Surfactin的四种同系物为：β-OH-C12-15-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu(Ile)。
如图3所示，质谱分析还出现了<M+H>为1462.9的加H离子峰，<M+Na>为1484.1的加Na离子峰，<M-CH2+H>为1476.9加H离子峰，<M-CH2+H>为1499.6的加Na离子峰，<M-CH2-CH2+H>为1490.9加H离子峰，<M-CH2-CH2+H>为1513.6的加Na离子峰，对<M+H>为1476.9进行二级质谱，发现出现了1109和995的加氢碎片离子，而1108和994是fengycinB的特征性片段，故推断枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21产的抗菌脂肽为fengycinB(C14-16)，氨基酸残基序列为Glu--Orn--Tyr--Thr--Glu--Val--Pro--Gln--Tyr--Ile。因此，可知本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能够产抗菌脂肽surfactin、fenycin。
2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21产酶特性实验
(1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21产蛋白酶实验
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21使用LB培养基活化，点接种于添加了10％的无菌脱脂奶粉的LB培养基上，37℃下培养60h，观察菌落周围是否出现蛋白水解圈，实验结果见图4。
(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21产脂肪酶实验
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21使用LB培养基活化，点接种于添加了1％的无菌三丁酸甘油酯的LB培养基上，37℃下培养72h，观察菌落周围是否出现脂肪水解圈，实验结果见图4。
(3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21产纤维素酶实验
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21使用LB培养基活化，点接种于无菌纤维素酶检测培养基上，37℃下培养48h，无菌条件下，往平板表面倾入0.1％的无菌刚果红溶液(盖住菌落即可)，静置30min，倒出刚果红溶液，再往平板倾入5％无菌氯化钠溶液，轻轻摇晃10min，倒出氯化钠溶液，观察菌落周围是否出现透明水解圈，实验结果见图4。
(4)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21产淀粉酶实验
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21使用LB培养基活化，点接种于添加了1％淀粉的LB培养基上，37℃下培养48h，无菌条件下，往平板倒入无菌碘液，观察菌落周围是否非蓝色圈，实验结果见图4。
从图4可知，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能够产蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶。
3、黄荆子微生态制剂酶活量实验
测试采用本发明实施例1方法制备得到的黄荆子微生态制剂的酶活量，测定方法按照中国国标(行业标准)关于蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的相关标准进行，测定结果如下表1所示。
表1黄荆子微生态制剂酶活量
由表1实验数据可知，本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21和本发明方法制备得到的黄荆子微生态制剂酶活力强。
4、应用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21半固体发酵生产得到的黄荆子微生态制剂对雏鸡生长性能实验
为了进一步说明本发明黄荆子微生态制剂能达到所述技术效果，做以下实验：选取120只大小、体重相当的健康鸡苗，随机平均分成6组，实验组有3组，对照组有3组，实验组1～3分别在基础日粮中添加实施例1发酵制备得到的黄荆子微生态制剂，各组添加物质及添加量如下：
实验组1在基础日粮添加0.25％实施例1制备得到的黄荆子微生态制剂；
实验组2在基础日粮添加0.5％实施例1制备得到的黄荆子微生态制剂；
实验组3在基础日粮添加0.75％实施例1制备得到的黄荆子微生态制剂；
对照组1在基础日粮添加0.5％未发酵黄荆子粉；
对照组2在基础日粮添加金霉素30mg/kg；
对照组3为空白对照组(基础日粮不添加其他物质)。
每一组内设4个平行，每一个平行鸡苗5只。饲喂方法均为：早晚喂食一次，自由采食，定期清理粪便，保持鸡舍卫生。对鸡进行生长性能的测定，分别于21日龄、35日龄、50日龄对各小组空腹称重，记录每小组喂食量及自然死亡情况，计算各大组的平均日增重，死亡率及料重比。其中，基础日粮如下表2所示，黄荆子微生态制剂对雏鸡生长性能的影响结果如下表3所示，黄荆子微生态制剂对雏鸡死亡率和料重比的影响结果如下表4所示。
表2基础日粮表
项目 含量 项目 含量
日粮组成 营养水平
玉米/％ 60.0 代谢能/(MJ·kg-1) 11.23
豆粕/％ 29.0 赖氨酸/％ 1.02
麸皮/％ 10.0 粗蛋白/％ 19.42
骨粉/％ 0.5 钙/％ 1.21
鱼粉/％ 0.5 磷/％ 0.41
表3黄荆子微生态制剂对雏鸡生长性能的影响
注：表3中，同列数据肩标大写字母完全不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母完全不同表示差异显著(P<0.05)，含相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
由表3实验数据可知，实验组1～3对雏鸡的增重作用显著优于对照组1～3，在35～50d内，其中，实验组2对雏鸡的增重效果最明显，实验组2平均日增重显著高于对照组3(P<0.01)，提升了约33.7％，显著高于阳性金霉素对照组2(P<0.01)，提升了27％，显著高于对照组1(P<0.01)，提升了28％。本发明制备得到的黄荆子微生态制剂对家禽的增重作用效果良好，在家禽基础日粮添加黄荆子微生态制剂的量为0.5％效果是最好的，未发酵黄荆子粉对家禽的增重作用有一定效果，但是本发明黄荆子微生态制剂对家禽的增重作用效果高于未发酵黄荆子粉。
表4黄荆子微生态制剂对雏鸡死亡率和料重比的影响
组别 死亡率/％ 料重比
实验组1 8.00 1.68b±0.16
实验组2 6.00 1.61a±0.09
实验组3 9.00 1.69b±0.13
对照组1 17.00 1.75b±0.09
对照组2 10.00 1.63a±0.07
对照组3 20.00 1.77c±0.11
注：表4中，同行数据右肩不同小写字母表示显著差异(P<0.05)，同行相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
由表4实验数据可知，黄荆子微生态制剂、未发酵黄荆子粉和金霉素能降低雏鸡死亡率，整个实验期间，虽然对照组2的金霉素比对照组1的未发酵黄荆子粉对雏鸡抗病效果好，但是均没有本发明的黄荆子微生态制剂抗病效果好；在料重比上，实验组2和对照组3有显著差异(P<0.05)，其中，实验组2较对照组3下降幅度为9.9％。
综上所述，本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能用于生产surfactin、fengycin、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶以及用于发酵生产中兽药微生态制剂，且其制备中兽药中发酵方式采用半固体发酵，其生产的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶活力强。本发明开发出中兽药微生态制剂，该方法制备得到的黄荆子微生态制剂芽孢数高，达到1011～12cfu/g，抑菌活力强，可以应用于畜牧业的无抗养殖，能更好地达到防病控病，促进牲畜生长发育的目的，具有很好的市场前景。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同腰间的含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。
Sequence Listing
<110> 铜仁职业技术学院
<120> 一种枯草芽孢杆菌及用于制备黄荆子微生态制剂的方法
<160> 1
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<400> 1
ctatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttaggagccagccgccgaa 1428

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21于2018年04月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号为CGMCCNo：15544。
2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能产surfactin、fengycin、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及纤维素酶。
3.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21能够单独或者联合其他有益菌发酵生产中兽药材。
4.一种应用权利要求1～3任一项所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21制备黄荆子微生态制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养基质制备：取黄荆子干燥粉末80～85份、黄豆粉5～10份、葡萄糖3～5份、尿素2～4份以及水12～18份，混合搅拌均匀，经高温湿热灭菌得到培养基基质；
(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21使用LB培养基制备成种子液，按5～8％比例向步骤(1)的培养基基质中接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21种子液，搅拌均匀，置于洁净的容器中，堆积高度为2～5cm，容器口用无菌纱布蒙住，发酵4～5d；
(3)在发酵完成的前一天，喷洒无菌氯化钙溶液，并搅拌均匀；
(4)发酵完成后，将黄荆子发酵所得产物置于50～70℃下干燥，粉碎装袋保藏，即得所述黄荆子微生态制剂。
5.根据权利要求4所述的一种应用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21制备黄荆子微生态制剂的方法，其特征在于：在步骤(1)，所述灭菌工艺为水浴煮沸20～30min。
6.根据权利要求4所述的一种应用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21制备黄荆子微生态制剂的方法，其特征在于：在步骤(2)，所述发酵工艺为半固态发酵，发酵的环境温度为25～37℃。
7.根据权利要求4所述的一种应用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21制备黄荆子微生态制剂的方法，其特征在于：在步骤(3)，所述无菌氯化钙溶液的质量浓度为0.2％。
8.根据权利要求4所述的一种应用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21制备黄荆子微生态制剂的方法，其特征在于：在步骤(3)，所述无菌氯化钙溶液的用量为黄荆子干燥粉末的0.5～1％。
9.根据权利要求4所述的一种应用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21制备黄荆子微生态制剂的方法，其特征在于：在步骤(4)，所述干燥工艺为干燥至发酵产物水分含量在10％以下。
10.根据权利要求4所述的一种应用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21制备黄荆子微生态制剂的方法，其特征在于：在步骤(4)，所述黄荆子微生态制剂的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21芽孢数达到1011～12cfu/g。
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