CN108531537A - 大黄鱼抗氧化肽的制备工艺及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，属于抗氧化肽技术领域，包括如下步骤：步骤一，预处理、第一次冷冻干燥；步骤二，碎粒；步骤三，脱脂；步骤四，去除残留异丙醇；步骤五，酶解；步骤六，灭活；步骤七，离心、过滤；步骤八，浓缩；步骤九，第二次冷冻干燥；本发明中采用的原料的蛋白质含量高、来源广泛且可合理捕捞，且获得的抗氧化肽具有较好的清除羟自由基的优点。
Description
技术领域
本发明涉及抗氧化肽技术领域，更具体地说，它涉及一种大黄鱼抗氧化肽的制备工艺。
背景技术
抗氧化肽多来源于食物蛋白，不但具有良好的抗氧化活性，且安全性极高，在保健食品以及生物医药领域的应用前景十分广阔。
海产品，包括海洋鱼、虾、蟹中均含有丰富的蛋白质，营养价值高，但目前对海产品主要以烹饪食用为主，大多数研究集中在海产品的养殖、保鲜和初级冷冻加工等方面，在精深加工方面仍比较薄弱，严重制约了海产品产业的发展。
申请公布号为CN106244657A、申请公布日为2016年12月21日的中国专利公开了一种鲨鱼蛋白抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
1）以脱脂鲨鱼鱼肉作为原料，按固液比1g:15mL~20mL加入缓冲液，用HCl或NaOH调节pH到5.0~7.0，得混合液；
2）将混合液温度升至50℃~60℃搅拌预热5min~10min，按照脱脂鱼肉质量的0.8%~1.2%加入木瓜蛋白酶，酶解温度为50℃~60℃，酶解时间1h~3h，得酶解产物；
3）将得到的酶解产物先经灭酶处理得酶解液，再将酶解液依次经脱盐、超滤和层析，得到抗氧化肽。
现有技术采用路氏双髻鲨鱼肉作为原料制备获得抗氧化肽，然而，路氏双髻鲨鱼属于国家二级保护动物，且存在着灭绝的危机，采用路氏双髻鲨鱼肉作为原料不合法。因此，一种可获得品质较佳的抗氧化肽、且采用合法的海洋鱼作为原料的制备方法，具有广阔的市场前景。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的一在于提供一种大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，原料的蛋白质含量高、来源广泛且可合理捕捞，且获得的抗氧化肽具有较好的清除羟自由基的优点。
为实现上述目的一，本发明提供了如下技术方案：
一种大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，包括如下步骤：
步骤一，预处理、第一次冷冻干燥：将冰鲜的大黄鱼去内脏和骨架，清洗，再切至厚度为1-2mm的片状，并充分去除血水，冷冻干燥至含水量为20-30wt%，获得冷冻干燥鱼片；
步骤二，碎粒：将步骤一中获得的冷冻干燥鱼片粉碎至粒径为1mm以下的鱼肉颗粒；
步骤三，脱脂：将步骤二中获得的鱼肉颗粒浸没于异丙醇中，超声波处理15-25min，超声波处理的频率为35-40kHz，获得脱脂鱼肉颗粒；
步骤四，去除残留异丙醇：将步骤三中获得的脱脂鱼肉颗粒与异丙醇分离，通风处理5-10min，风的温度为18-25℃；
步骤五，酶解：将步骤四中获得的经充分脱除异丙醇后的脱脂鱼肉颗粒置于磷酸盐缓冲液中，脱脂鱼肉颗粒的体积百分比为25-27%，置于45-50℃的水浴环境中，一次搅拌，搅拌时间为60-75s，再加入中性蛋白酶，酶添加量为2000-2400IU/g；再沿同一方向进行二次搅拌，搅拌的速度为55-65rpm，搅拌时间为80-125s，之后进行进行静置酶解，酶解的时间为5-5.5h，获得混合浆液；
步骤六，灭活：将步骤五中获得的混合浆液均匀加热至70-75℃，并保温15-20min；
步骤七，离心、过滤：将步骤六中获得的混合浆液冷却至25±2℃，依次离心、过滤，离心转速为10000-12000rpm，离心时间为5-8min，获得水解液；
步骤八，浓缩：将步骤七中获得的水解液进行浓缩，浓缩的温度为30-40℃，浓缩的蒸发量为0.2-0.4t/h，浓缩的时间为3-5min，获得浓缩液；
步骤九，第二次冷冻干燥：将步骤八中获得的浓缩液，进行第二次冷冻干燥处理，获得大黄鱼抗氧化肽；
所述步骤七中，过滤采用截留分子量为3000-4000D的透析袋进行。
通过上述技术方案，步骤一中，采用冰鲜的大黄鱼，可使鱼肉保持较为柔软的质感。第一次冷冻干燥时，将切好的片状海洋鱼进行平铺，不易相互粘连，且可均匀、充分地进行干燥。步骤二中，将冷冻干燥鱼片进行碎粒处理，有利于获得颗粒均匀的鱼肉颗粒，且使鱼肉颗粒的整体性更佳，此外，鱼肉颗粒之间不易出现粘黏的现象。
大黄鱼的鱼肉的粗蛋白含量较高，同时脂肪含量也较高，然而，原料中脂肪含量较高易造成水解过程中，影响水解效率。在步骤三中，超声波有助于使异丙醇充分进入鱼肉颗粒内部的孔隙中，从而使鱼肉颗粒内部的脂肪被充分脱除。步骤四中，该温度范围内的风不易使脱脂鱼肉颗粒发生腐败，且可使脱脂鱼肉颗粒中残留的异丙醇充分挥发。
步骤五中，一次搅拌的搅拌时间较长，使中性缓冲液与脱脂鱼肉颗粒形成的混合物的温度均匀上升且达到与水浴环境的温度相同，加入中性蛋白酶后，沿同一方向进行二次搅拌，则是将加入的中性蛋白酶跟中性缓冲液与脱脂鱼肉颗粒形成的混合物之间形成充分的混合，且不易造成中性蛋白酶受到损伤，并且在中性蛋白酶较适宜生存的温度下，进行酶解反应，有助于提高获得的抗氧化肽的含量。
步骤六中，在该温度下，可使混合浆液中的中性蛋白酶充分失活，不易对后续的抗氧化肽的含量造成影响。
步骤七中，通过高速离心作用，将沉淀的物质分离，再进行透析袋的作用，将小分子杂质去除，获得较为澄清的水解液，从而便于步骤八中进行浓缩，最后进行第二次冷冻干燥处理，最大程度上保护抗氧化肽不易受到破坏，并且使最终获得的抗氧化肽具有较好的品质。
此外，本申请中采用大黄鱼中的鱼肉部分作为原料，首先，因为大黄鱼的资源丰富，不构成违法操作，且成本相对较为合理；其次，制作获得的抗氧化肽的纯度较高，海洋鱼的内脏、鱼鳞虽然含有蛋白质，但其中也存在着其他杂质，易对最终获得的抗氧化肽的纯度以及抗氧化肽所具有的对羟自由基的清除能力产生影响。此外，本申请中，将鱼肉进行切片后再第一次冷冻干燥，不易使切成片状的大黄鱼出现腐败等现象，从而有助于较大程度上保存大黄鱼中的蛋白质含量，且更易控制其干燥的均匀效果。
进一步优选为：所述步骤一中，对切片后的大黄鱼的鱼肉依次进行按压处理和扎孔操作。
通过上述技术方案，有助于使切片后的鱼肉的质地更为松软，扎孔后，可使鱼肉中具有较多的孔隙，在冷冻干燥的过程中，所扎的孔可为冷冻干燥的提供更多的接触空间，提高冷冻干燥的效率，并进一步降低片状的鱼肉中的含水量。
进一步优选为：按压处理时采用的作用力为3-5N；扎孔操作时，孔径为0.1-0.3mm，孔的排布数量为10-18个/cm2。
通过上述技术方案，采用轻微的作用力对切成的片状的鱼肉进行按压处理，使鱼肉更为松软，且由于鱼肉的厚度较小，不宜采用过大的作用力进行按压，以免造成鱼肉被压碎或者压糊。孔的排布较为均匀，且数量较为适中，在第一次冷冻干燥的过程中，有助于使片状的鱼肉获得较为快速的冷冻干燥作用。
进一步优选为：所述步骤三中，超声波处理结束后，进行正反方向交替搅拌，搅拌的速度为115-130rpm，沿顺时针方向和逆时针方向搅拌的时间各为1-2min。
通过上述技术方案，沿顺时针和逆时针方向进行交替搅拌，有助于使异丙醇充分地与鱼肉颗粒发生接触，进而使鱼肉颗粒中的脂肪被异丙醇分解，增加鱼肉颗粒中蛋白质的含量。
进一步优选为：交替搅拌次数为2-5次。
通过上述技术方案，沿顺时针、逆时针的搅拌方向交替进行，有助于使鱼肉颗粒被松散开，更有利于鱼肉颗粒与异丙醇之间发生充分的接触，进而有助于去除鱼肉颗粒中的脂肪，减少脂肪对后期水解的影响。
进一步优选为：所述步骤五中，所述二次搅拌为沿顺时针方向搅拌，重复2-3次，两次重复操作之间间隔0.5h。
通过上述技术方案，搅拌速度较低，不易损伤中性蛋白酶，且顺时针的搅拌方式，有助于继续打开脱脂鱼肉颗粒中的孔隙，使中性蛋白酶对脱脂鱼肉颗粒具有更为充分的酶解作用。
进一步优选为：所述步骤九中，第二次冷冻干燥的预冷温度为-13~-20℃，所述第二次冷冻干燥的温度为-40~-30℃，真空度为15-17Pa，第二次冷冻干燥的时间为15-18h。
通过上述技术方案，采用第二次冷冻干燥的操作方式，有助于使获得的抗氧化蛋白具有更好的抗氧化作用。
本发明的目的二在于提供一种大黄鱼抗氧化肽的应用。
为实现上述目的二，本发明提供了如下技术方案：
一种大黄鱼抗氧化肽的应用，大黄鱼氧化肽应用于制备保健品、抗氧化药物。
通过上述技术方案，将获得的大黄鱼氧化肽应用于制备保健品、抗氧化药物，从而有助于提高对羟自由基的清除能力。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.大黄鱼资源丰富、蛋白质含量高且可合理捕捞；
2.酶解所需的时间较短，且酶解充分，有助于降低生产周期，从而提高生产效率；
3.获得的抗氧化肽具有较高清除羟自由基的能力。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行详细描述。
实施例1：大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，采用如下步骤：
步骤一，预处理、第一次冷冻干燥：将冰鲜的大黄鱼去内脏和骨架，清洗，再切至厚度为1-2mm的片状，并充分去除血水，冷冻干燥至含水量为20-30wt%，获得冷冻干燥鱼片；
步骤二，碎粒：将步骤一中获得的冷冻干燥鱼片粉碎至粒径为1mm以下的鱼肉颗粒；
步骤三，脱脂：将步骤二中获得的鱼肉颗粒浸没于异丙醇中，超声波处理20min，超声波处理的频率为35kHz，获得脱脂鱼肉颗粒；
步骤四，去除残留异丙醇：将步骤三中获得的脱脂鱼肉颗粒与异丙醇分离，通风处理10min，风的温度为18℃；
步骤五，酶解：将步骤四中获得的经充分脱除异丙醇后的脱脂鱼肉颗粒置于磷酸盐缓冲液中，脱脂鱼肉颗粒的体积百分比为26%，置于50℃的水浴环境中，一次搅拌，搅拌时间为75s，再加入中性蛋白酶，酶添加量为2400IU/g；再沿同顺时针方向进行二次搅拌，搅拌时间为125s，之后进行进行静置酶解，酶解的时间为5h，获得混合浆液；
步骤六，灭活：将步骤五中获得的混合浆液均匀加热至75℃，并保温15min；
步骤七，离心、过滤：将步骤六中获得的混合浆液冷却至25℃，依次离心、过滤，离心转速为10000rpm，离心时间为8min，采用截留分子量为4000D的透析袋进行过滤，获得水解液；
步骤八，浓缩：将步骤七中获得的水解液进行浓缩，浓缩的温度为40℃，浓缩的蒸发量为0.4t/h，浓缩的时间为3min，获得浓缩液；
步骤九，第二次冷冻干燥：将步骤八中获得的浓缩液，进行第二次冷冻干燥处理，预冷温度为-20℃，第二次冷冻干燥的温度为-40℃，真空度为17Pa，第二次冷冻干燥的时间为18h，获得大黄鱼抗氧化肽。
其中，磷酸盐缓冲液购自赛默飞世尔；中性蛋白酶（酶活为60000IU/g）购自购自北京索莱宝生物科技有限公司。
实施例2：大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，与实施例1的区别在于，步骤三中，超声波处理的时间为15min，超声波处理的频率为40kHz，获得脱脂鱼肉颗粒；步骤四中，通风处理的时间为8min，风的温度为20℃；步骤五中，脱脂鱼肉颗粒的体积百分比为25%，置于45℃的水浴环境中，一次搅拌，再加入中性蛋白酶，酶添加量为2400IU/g；再沿同顺时针方向进行二次搅拌，搅拌时间为80s，之后进行进行静置酶解，酶解的时间为5.5h，获得混合浆液；步骤八中，浓缩的温度为30℃，浓缩的蒸发量为0.4t/h，浓缩的时间为5min，获得浓缩液。
实施例3：大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，与实施例1的区别在于，步骤三中，超声波处理的时间为25min，超声波处理的频率为37kHz，获得脱脂鱼肉颗粒；步骤四中，通风处理的时间为5min，风的温度为25℃；步骤五中，脱脂鱼肉颗粒的体积百分比为27%，置于47℃的水浴环境中，一次搅拌，再加入中性蛋白酶，酶添加量为2400IU/g；再沿同顺时针方向进行二次搅拌，搅拌时间为100s，之后进行进行静置酶解，酶解的时间为5.5h，获得混合浆液；步骤八中，浓缩的温度为35℃，浓缩的蒸发量为0.3t/h，浓缩的时间为4min，获得浓缩液。
实施例4：大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，与实施例1的区别在于，步骤一中，对切片后的大黄鱼的鱼肉依次进行按压处理和扎孔操作，按压处理时采用的作用力为3N；扎孔操作时，孔径为0.3mm，孔的排布数量为10个/cm2。
实施例5：大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，与实施例1的区别在于，按压处理时采用的作用力为5N；扎孔操作时，孔径为0.1mm，孔的排布数量为18个/cm2。
实施例6：大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，与实施例1的区别在于，步骤三中，超声波处理结束后，进行正反方向交替搅拌，搅拌的速度为130rpm，沿顺时针方向和逆时针方向搅拌的时间各为1min，交替搅拌次数为2次。
实施例7：大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，与实施例1的区别在于，步骤三中，超声波处理结束后，进行正反方向交替搅拌，搅拌的速度为115rpm，沿顺时针方向和逆时针方向搅拌的时间各为2min，交替搅拌次数为5次。
实施例8：大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，与实施例1的区别在于，步骤五中，二次搅拌为沿顺时针方向搅拌，重复3次，两次重复操作之间间隔0.5h。
对比例1：大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，与实施例1的区别在于，以申请公布号为CN106244657A中实施例1的方法进行制备。
对比例2：大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，与实施例1的区别在于，采用大黄鱼的内脏作为原料。
试验：
试验样品：选取实施例1-8中获得的抗氧化肽作为试验样品1-8，选取对比例1-2中获得的抗氧化肽作为对照样1-2。
试验方法：采用试剂：1.865mmol/L邻二氮菲、无水乙醇溶液、0.2M的pH7.4磷酸盐缓冲液、1.865mmol/L的FeSO4·7H2O溶液、0.03%(v/v)的H2O2、抗坏血酸取1.0mL浓度为1.865mmol/L邻二氮菲的无水乙醇溶液于带塞试管中，分别加入浓度为0.2M的pH7.4磷酸盐缓冲液2mL和1mL不同的试验样品，充分混匀后加入1.0mL浓度为1.865mmol/L的FeSO4·7H2O溶液，再次混匀后加入1.0mL0.03%(v/v)的H2O2，于37℃恒温水浴，60min后，在536nm下分别测量各组混合溶液的吸光度值得AS，以蒸馏水代替试验样品作为空白组测吸光度值得Ab，以蒸馏水替代H2O2作为损伤组，吸光度值An，以抗坏血酸代替样品作为阳性对照，抗氧化剂的羟自由基清除率按以下公式计算：
羟自由基清除率(%)=[(As-An)/(Ab-An)]×100%。
试验结果：试验样1-8、对照样1-2对羟自由基的清除率如表1所示。
表1 试验样1-8、对照样1-2对羟自由基的清除率
| 样品 | 对羟自由基的清除率（%） |
| 试验样1 | 80.25 |
| 试验样2 | 80.21 |
| 试验样3 | 80.24 |
| 试验样4 | 81.09 |
| 试验样5 | 80.82 |
| 试验样6 | 81.56 |
| 试验样7 | 81.63 |
| 试验样8 | 81.25 |
| 对照样1 | 53.61 |
| 对照样2 | 47.33 |
由表1可知，试验样1-8，对羟自由基的清除率要分别高于对照样1-2中对羟自由基的清除率。由此可见，相对于对照样1，说明采用预处理、第一次冷冻干燥--碎粒--脱脂--去除残留异丙醇--酶解--灭活--离心、过滤--浓缩--第二次冷冻干燥的工艺来制备抗氧化肽，有助于提高抗氧化肽对羟自由基的清除作用；相对于对照样2，说明采用大黄鱼的鱼肉部分作为原料，最终获得的抗氧化肽具有更好的清除羟自由基的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，预处理、第一次冷冻干燥：将冰鲜的大黄鱼去内脏和骨架，清洗，再切至厚度为1-2mm的片状，并充分去除血水，冷冻干燥至含水量为20-30wt%，获得冷冻干燥鱼片；
步骤二，碎粒：将步骤一中获得的冷冻干燥鱼片粉碎至粒径为1mm以下的鱼肉颗粒；
步骤三，脱脂：将步骤二中获得的鱼肉颗粒浸没于异丙醇中，超声波处理15-25min，超声波处理的频率为35-40kHz，获得脱脂鱼肉颗粒；
步骤四，去除残留异丙醇：将步骤三中获得的脱脂鱼肉颗粒与异丙醇分离，通风处理5-10min，风的温度为18-25℃；
步骤五，酶解：将步骤四中获得的经充分脱除异丙醇后的脱脂鱼肉颗粒置于磷酸盐缓冲液中，脱脂鱼肉颗粒的体积百分比为25-27%，置于45-50℃的水浴环境中，一次搅拌，搅拌时间为60-75s，再加入中性蛋白酶，酶添加量为2000-2400IU/g；再沿同一方向进行二次搅拌，搅拌的速度为55-65rpm，搅拌时间为80-125s，之后进行进行静置酶解，酶解的时间为5-5.5h，获得混合浆液；
步骤六，灭活：将步骤五中获得的混合浆液均匀加热至70-75℃，并保温15-20min；
步骤七，离心、过滤：将步骤六中获得的混合浆液冷却至25±2℃，依次离心、过滤，离心转速为10000-12000rpm，离心时间为5-8min，获得水解液；
步骤八，浓缩：将步骤七中获得的水解液进行浓缩，浓缩的温度为30-40℃，浓缩的蒸发量为0.2-0.4t/h，浓缩的时间为3-5min，获得浓缩液；
步骤九，第二次冷冻干燥：将步骤八中获得的浓缩液，进行第二次冷冻干燥处理，获得大黄鱼抗氧化肽；
所述步骤七中，过滤采用截留分子量为3000-4000D的透析袋进行。
2.根据权利要求1所述的大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，其特征在于，所述步骤一中，对切片后的大黄鱼的鱼肉依次进行按压处理和扎孔操作。
3.根据权利要求2所述的大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，其特征在于，按压处理时采用的作用力为3-5N；扎孔操作时，孔径为0.1-0.3mm，孔的排布数量为10-18个/cm2。
4.根据权利要求1所述的大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，其特征在于，所述步骤三中，超声波处理结束后，进行正反方向交替搅拌，搅拌的速度为115-130rpm，沿顺时针方向和逆时针方向搅拌的时间各为1-2min。
5.根据权利要求4所述的大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，其特征在于，交替搅拌次数为2-5次。
6.根据权利要求1所述的大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，其特征在于，所述步骤五中，所述二次搅拌为沿顺时针方向搅拌，重复2-3次，两次重复操作之间间隔0.5h。
7.根据权利要求1所述的大黄鱼抗氧化肽的制备工艺，其特征在于，所述步骤九中，第二次冷冻干燥的预冷温度为-13~-20℃，所述第二次冷冻干燥的温度为-40~-30℃，真空度为15-17Pa，第二次冷冻干燥的时间为15-18h。
8.一种大黄鱼抗氧化肽的应用，其特征在于，所述权利要求1-7中制备获得的大黄鱼氧化肽应用于制备保健品、抗氧化药物。
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2018
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