CN111349676A - 一种羊乳乳清高f值寡肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高F值寡肽制备技术领域，尤其涉及一种羊乳乳清高F值寡肽的制备方法。所述方法包括步骤：(1)将羊乳依次进行脱脂、脱酪蛋白、脱小分子物质后冻干，制得乳清蛋白粉；(2)对所述乳清蛋白粉依次进行酶解、脱芳、离心过滤，得到羊乳乳清高F值寡肽液，即得。本发明使用两种酶分步水解，再使用活性炭将芳香族氨基酸去除，本发明得到了一种无异味，透明液体状的羊乳乳清高F值寡肽，其F值高达26.32，是一种高支链氨基酸低芳香族氨基酸的寡肽体系。
Description
技术领域
本发明涉及高F值寡肽制备技术领域，尤其涉及一种羊乳乳清高F值寡肽的制备方法。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
羊乳中含有丰富的干物质、蛋白质、脂肪和矿物质，现代研究证明它含有200多种营养物质和生物活性物质，其中脂肪酸64种，氨基酸20种，维生素20种，矿物质25种。钙、铁、锌、镁、钾、维生素A、B、C、D、K比例合适。其成分接近人奶，是人类营养补充最全面最完美的绿色食补品。羊乳清蛋白中必需氨基酸种类齐全，组成模式与人体相似，容易消化吸收，具有极高的生物利用效价；功能多样，来源于天然食品，是可获得的最经济的食物蛋白质资源之一。可以补充人体所需要的氨基酸，提高机体抗氧化能力，保护免疫细胞减轻疲劳。
高F值寡肽为支链氨基酸(BCAA，即Val、Ile、Leu)与芳香族氨基酸(AAA，即Tyr、Phe)含量的比值大于二十，且由3～7s个氨基酸残基短肽链物质组成的寡肽混合物。有研究表明，高F值寡肽可用于辅助治疗肝硬化和肝性脑病，纠正血浆及脑中氨基酸的病态模式，降低血氨。另外，高F值寡肽还具有抗疲劳、抗缺氧、降血脂以及醒酒等作用。食源性蛋白高F值寡肽可作为一种功效成分添加到食品中，且越来越受到食品以及医药食品界的关注。然而，本发明人发现：目前对于高F值寡肽的研究，其制备原料多来自于植物蛋白与水产品蛋白，乳源性蛋白仅有酪蛋白制备高F值寡肽的研究，因此，开发优质食源性蛋白尤其是乳源性蛋白用于生产高F值寡肽的研究，目前还比较缺乏。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明提出了一种羊乳乳清高F值寡肽的制备方法。羊乳乳清蛋白支链氨基酸所占比例为20％左右，支链氨基酸与苯丙氨酸的比值高达4.96，羊乳乳清作为氨基酸比例较优的一种乳源性蛋白，非常适合制备高F值寡肽。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
首先，本发明公开一种羊乳乳清高F值寡肽的制备方法，包括步骤：
(1)将羊乳依次进行脱脂、脱酪蛋白、脱除小分子物质后冻干，制得乳清蛋白粉。
(2)对所述乳清蛋白粉依次进行酶解、脱芳、离心过滤，得到羊乳乳清高F值寡肽液，即得。
进一步地，步骤(1)中，所述脱脂的方法为：将生鲜羊乳在3-4℃，4000-4500r/min冷冻离心10-15min，去除脂肪；至少再重复一次上述操作，得到脱脂羊乳。
进一步地，步骤(1)中，所述脱酪蛋白的方法为：调节脱脂羊乳的pH至酪蛋白等电点，静置后于3-4℃，4000-4200r/min冷冻离心8-10min，弃去沉淀，收集上清液。
进一步地，步骤(1)中，所述小分子物质的脱除方法为：将脱酪蛋白后收集的上清液进行透析，收集保留液真空冷冻干燥，得羊乳乳清蛋白粉。所述要脱除的小分子物质主要包括乳糖、无机盐等组分。
可选地，所述透析用3500Da的透析袋进行，使用20000的聚乙二醇作为缓冲，收集保留液。
进一步地，步骤(2)中，所述酶解为双步酶解；优选地，具体方法为：将羊乳乳清蛋白粉复溶，然后第一次调节pH值，加入胃蛋白酶在第一温度下酶解第一时间段后，进行第二次调节pH值，加入风味蛋白酶在第二温度下酶解第二时间段后灭酶，得到酶解液。
进一步地，所述胃蛋白酶的质量为乳清蛋白溶液的0.75-1.75％，所述第一次调节pH值为1-3，第一温度为40-60℃，第一时间段为2-6h。所述风味蛋白酶的质量为第一步水解液的0.25-1.25％，所述第二次调节pH值为6-8，第二温度为40-60℃，第二时间段为2-6h。
可选地，所述羊乳乳清蛋白粉复溶时，将羊乳乳清蛋白粉用蒸馏水复溶至5％。
可选地，所述调节等电点pH值使用10％乙酸溶液调节，所述酶解pH值用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的NaOH溶液调节。
进一步地，步骤(2)中，所述脱芳为使用活性炭脱除酶解液中芳香族氨基酸的工序。具体方法为：调节酶解液pH至1-5，然后按料液比1：(3-7)向酶解液中加入活性炭，静置1-5h，即得。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以羊乳乳清蛋白为原料，思路新颖，乳清是食品工业上生产干酪或干酪素的副产品，羊乳乳清蛋白中功能性成分配比合理，致敏性低，且具有高支链氨基酸、低芳香族氨基酸的优势，是高F值寡肽的理想来源，同时为羊乳乳清的高值化加工和应用提供了重要依据。
(2)本发明使用酶解法水解羊乳乳清蛋白，相较于酸碱水解对蛋白质的破坏，酶解法优化了蛋白质的功能、生物学和营养特性；利用内切酶和外切酶进行双步水解，更大限度的保证了酶解的高效率。
(3)本发明使用活性炭进行芳香族氨基酸的吸附以及脱色处理，不仅吸附效果好，达到纯化寡肽的目的，同时提高了寡肽的F值。
(4)本发明采用双酶水解的的寡肽制备工艺，既避免了乳清蛋白的过度水解又保证了水解液的F值，从而提高了羊乳乳清高F值寡肽的质量和水解效率。
(5)本发明优化了活性炭吸附工艺，尽可能的吸附芳香族氨基酸的同时，最大限度的保留了支链氨基酸，提高了F值。
(6)本发明使用双酶分步水解羊乳乳清蛋白，脱芳后制备高F值寡肽，工艺简单，可作为进一步研究其生理活性的参考实验。
(7)本发明得到了一种无异味、透明液体状的羊乳乳清高F值寡肽，其F值高达26.32，是一种高支链氨基酸低芳香族氨基酸的寡肽。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中制备羊乳乳清高F值寡肽的工艺流程图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如前文所述，开发优质食源性蛋白尤其是乳源性蛋白用于生产高F值寡肽的研究，目前还比较缺乏。因此，本发明提出了羊乳乳清制备高F值寡肽的方法；现结合说明书附图和具体实施方式对本发明进一步说明。
需要说明的是，下列实施例中，所述水解度使用pH-stat法进行测量，所述F值为使用紫外分光光度计在220nm和280nm处吸光度的比值。
第一实施例
羊乳乳清高F值寡肽的制备，参考图1，包括如下步骤：
原料及辅料：羊乳、10％乙酸溶液、1mol/L的HCl溶液、1mol/L的NaOH溶液，胃蛋白酶，风味蛋白酶，蒸馏水。
羊乳乳清蛋白粉的制备：以生鲜羊乳为原料，通过脱脂，脱脂的方法为将生鲜羊乳采用冷冻离心，在4℃、4500r/min冷冻离心10min，重复两次得到脱脂羊乳。使用10％乙酸调节脱脂羊乳的pH为4.1，4℃静置30min，于4℃，4000r/min冷冻离心10min，弃去沉淀的酪蛋白，收集上清液，过3500D透析袋去除乳糖等小分子，收集保留液进行真空冷冻干燥得到羊乳乳清蛋白粉。
将本实施例制备的羊乳乳清蛋白粉于蒸馏水中复溶5％，得到羊乳乳清蛋白液，然后取50ml该蛋白液均分为5组，依次序编号1-5组，每组中均加入质量(g)为乳清蛋白溶液质量(下同)的1.25％的胃蛋白酶，采用1mol/L的HCl溶液调节pH至2，在45℃下对1-5组溶液依次序酶解2、3、4、5、6小时，具体结果见表1。
表1酶解时间对酶解液水解度和F值影响
将本实施例制备的羊乳乳清蛋白粉于蒸馏水中复溶5％，得到羊乳乳清蛋白液，然后取50ml该蛋白液均分为5组，依次序编号6-10组，每组中均加入质量(g)为乳清蛋白溶液1.5％的胃蛋白酶，采用1mol/L的HCl溶液调节pH至2，对6-10组溶液依次序在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下酶解2小时，具体结果见表2。
表2酶解温度对酶解液水解度和F值影响
将本实施例制备的羊乳乳清蛋白粉于蒸馏水中复溶5％，得到羊乳乳清蛋白液，然后取50ml该蛋白液均分为5组，依次序编号11-15组，每组中均加入质量(g)为乳清蛋白溶液1.5％的胃蛋白酶，采用1mol/L的HCl溶液将11-15组溶液的pH依次序调节为1、1.5、2、2.5、3，然后在45℃条件下酶解3小时，具体结果见表3。
表3酶解pH对酶解液水解度和F值影响
将本实施例制备的羊乳乳清蛋白粉于蒸馏水中复溶5％，得到羊乳乳清蛋白液，然后取50ml该蛋白液均分为5组，依次序编号16-20组，采用1mol/L的HCl溶液将每组溶液的pH调节为2，然后在16-20组的溶液中依次序加入质量(g)为乳清蛋白溶液0.75％、1％、1.25％、1.5％、1.75％的胃蛋白酶，最后在45℃下酶解3h，具体结果见表4。
表4加酶量对酶解液水解度和F值影响
从上述的测试结果可以看出，在合适的酶解条件下，羊乳乳清蛋白可被酶解为氨基酸及多肽。进一步地，本发明以F值作为主要指标，以水解度作为参考，通过试验，选择2h作为胃蛋白酶酶解时间，50℃作为胃蛋白酶酶解温度，酶解pH为2，加酶量(g)为乳清蛋白溶液的1％，并以上述优选的水解条件为试验参数进行第二实施例。
第二实施例
确定风味蛋白酶水解的各项指标：按照第一实施例优选的水解条件制备第一步酶解液进行第二步酶解，包括如下步骤：
将第一实施例制备的羊乳乳清蛋白粉于蒸馏水中复溶5％，得到羊乳乳清蛋白液，然后取50ml该蛋白液均分为5组，依次序编号1-5组，每组中均加入质量(g)为第一步水解液1％的风味蛋白酶，采用1mol/L的NaOH溶液调节pH至6.5，然后在45℃下对1-5组溶液依次序酶解2、3、4、5、6小时，具体结果见表5。
表5酶解时间对酶解液水解度和F值影响
将第一实施例制备的羊乳乳清蛋白粉于蒸馏水中复溶5％，得到羊乳乳清蛋白液，然后取50ml该蛋白液均分为5组，依次序编号6-10组，每组中均加入质量(g)为第一步水解液0.75％的风味蛋白酶，采用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的NaOH溶液调节pH为7，对6-10组溶液依次序在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下酶解3小时，具体结果见表6。
表6酶解温度对酶解液水解度和F值影响
将第一实施例制备的羊乳乳清蛋白粉于蒸馏水中复溶5％，得到羊乳乳清蛋白液，然后取50ml该蛋白液均分为5组，依次序编号11-15组，每组中均加入质量(g)为第一步水解液1％的风味蛋白酶，采用1mol/L的NaOH溶液将11-15组溶液的pH依次序调节为1、1.5、2、2.5、3，然后在45℃条件下均酶解3小时，具体结果见表7。
表7酶解pH对酶解液水解度和F值影响
将第一实施例制备的羊乳乳清蛋白粉于蒸馏水中复溶5％，得到羊乳乳清蛋白液，然后取50ml该蛋白液均分为5组，依次序编号15-20组，采用1mol/L的NaOH溶液将溶液的pH调节为7，然后在15-20组溶液中依次序加入质量(g)为第一步水解液0.25％、0.5％、0.75％、1％、1.25％的风味蛋白酶，最后在45℃下酶解3h，具体结果见表8。
表8加酶量对酶解液水解度和F值影响
从上述的测试结果可以看出，在合适的酶解条件下，羊乳乳清蛋白可被酶解为氨基酸及多肽。进一步地，本发明以F值作为主要指标，以水解度作为参考，通过试验，选择3h作为风味蛋白酶酶解时间，45℃作为风味蛋白酶酶解温度，酶解pH为7，加酶量为(g)第一步水解液0.5％，并以上述优选的水解条件为试验参数进行第三实施例。
第三实施例
确定活性炭脱芳的各项指标：以第一实施例和第二实施例2的水解条件分别作为双步酶解法的第一步和第二步，进行酶解液的制备，并将得到的酶解液采用活性炭进行脱芳，具体包括如下步骤：
取50ml酶解液均分为5组，依次序编号1-5组，采用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的NaOH溶液调节酶解液的pH至3，在每组酶解液中按照炭液比1：5加入活性炭后，对1-5组酶解液依次序吸附30min、1h、2h、3h、4h，离心过滤后测F值，具体结果见表9。
表9脱芳时间对F值影响
取50ml酶解液均分为5组，依次序编号6-10组，采用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的NaOH溶液将6-10组酶解液的pH依次序调节为1、2、3、4、5，然后按照炭液比1：10在每组酶解液中均加入活性炭后吸附3h，离心过滤后测F值，具体结果见表10。
表10脱芳pH对F值影响
取50ml酶解液均分为5组，依次序编号11-15组，采用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的NaOH溶液将酶解液的pH调节至3，然后在11-15组酶解液中依次序按照炭液比1:3、1:4、1:5、1:6、1:7加入活性炭后吸附3h，离心过滤后测F值，具体结果见表11。
表11脱芳炭液比对F值影响
从上述的测试结果可以看出，在合适的脱芳条件下，羊乳乳清蛋白酶解液中芳香族氨基酸能够最大限度的去除并且保留更高比例的支链氨基酸，并对酶解液具有一定的脱色作用。进一步地，本发明以F值作为参考指标指标，通过试验，选择2h作为脱芳时间，脱芳pH为2，炭液比为1:5为优选的脱芳参数，进行第四实施例。
第四实施例
一种羊乳乳清蛋白高F寡肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)羊乳乳清蛋白粉的制备：同第一实施例。
(2)乳清蛋白粉的酶解：将乳清蛋白粉复溶5％，使用HCl溶液调节pH为2，加入1％胃蛋白酶，在50℃条件下酶解2h。将第一步酶解液使用NaOH溶液调节pH为7，加入0.5％风味蛋白酶，在45℃条件下酶解3h，灭酶。
(3)酶解液的脱芳：使用HCl溶液将酶解液pH调至2，按照炭液比为1:5加入活性炭，吸附2h后在8000r/min条件下离心10min，过滤得到滤液即为寡肽液。
(4)按照实施例4进行F值得测定：使用紫外分光光度计，测量波长220nm下的吸光度A220，测量波长280nm下的吸光度A280，F值计算公式为：
(5)使用氨基酸自动分析仪进行氨基酸测序，结果如表12所示，检测结果显示羊乳乳清高F值寡肽的F值高达26.32，氨基酸自动分析仪检测结果显示芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)几乎不存在。本发明使用两种分步水解，在使用活性炭将芳香族去除，成功获得羊乳乳清高F值寡肽。
表12氨基酸自动分析仪分析结果
应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种羊乳乳清高F值寡肽的制备方法，其特征在于，包括步骤：对羊乳乳清蛋白粉依次进行双步酶解、脱芳、离心过滤，即得。
2.如权利要求1所述的羊乳乳清高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述羊乳乳清蛋白粉的制备方法为：将羊乳依次进行脱脂、脱酪蛋白、脱除小分子物质后冻干，制得乳清蛋白粉。
3.如权利要求2所述的羊乳乳清高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述脱脂的方法为：将生鲜羊乳在3-4℃，4000-4500r/min冷冻离心10-15min，去除脂肪；至少再重复一次上述操作，得到脱脂羊乳。
4.如权利要求2所述的羊乳乳清高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述脱酪蛋白的方法为：调节脱脂羊乳的pH至酪蛋白等电点，静置后于3-4℃，4000-4200r/min冷冻离心8-10min，弃去沉淀，收集上清液；
优选地，所述调节等电点pH值使用10％乙酸溶液调节，所述酶解pH值用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的NaOH溶液调节。
5.如权利要求2所述的羊乳乳清高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述小分子物质的脱除方法为：将脱酪蛋白后收集的上清液进行透析，收集保留液真空冷冻干燥，得羊乳乳清蛋白粉；所述小分子物质主要包括乳糖、无机盐；
优选地，所述透析用3500Da的透析袋进行，使用20000的聚乙二醇作为缓冲，收集保留液。
6.如权利要求1所述的羊乳乳清高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述双步酶解的方法为：将羊乳乳清蛋白粉复溶，然后第一次调节pH值，加入胃蛋白酶在第一温度下酶解第一时间段后，进行第二次调节pH值，加入风味蛋白酶在第二温度下酶解第二时间段后灭酶，得到酶解液。
7.如权利要求6所述的羊乳乳清高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述胃蛋白酶的质量为乳清蛋白溶液的0.75-1.75％，所述第一次调节pH值为1-3，第一温度为40-60℃，第一时间段为2-6h。
8.如权利要求6所述的羊乳乳清高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述风味蛋白酶的质量为第一步水解液的0.25-1.25％，所述第二次调节pH值为6-8，第二温度为40-60℃，第二时间段为2-6h。
9.如权利要求6所述的羊乳乳清高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述羊乳乳清蛋白粉复溶时，将羊乳乳清蛋白粉用蒸馏水复溶至5％。
10.如权利要求1-9任一项所述的羊乳乳清高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述脱芳为使用活性炭脱除酶解液中芳香族氨基酸的工序；
优选地，脱芳的方法为：调节酶解液pH至1-5，然后按料液比1：(3-7)向酶解液中加入活性炭，静置1-5h，即得。
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