CN107632153A - 一种小反刍动物慢病毒间接elisa检测试剂盒 - Google Patents
一种小反刍动物慢病毒间接elisa检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107632153A CN107632153A CN201710667616.8A CN201710667616A CN107632153A CN 107632153 A CN107632153 A CN 107632153A CN 201710667616 A CN201710667616 A CN 201710667616A CN 107632153 A CN107632153 A CN 107632153A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oligopeptides
- standard items
- positive
- examination
- control standard
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小反刍动物慢病毒间接ELISA检测试剂盒，寡肽P1和寡肽P2，如SEQ ID No.1何SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。人工合成的两条寡肽作为抗原包被可特异性吸附寡肽的ELISA板，通过优化寡肽抗原包被浓度、被检血清浓度和HRP标记的兔抗山羊抗体的稀释度，建立了可以检测小反刍动物慢病毒血清抗体的间接ELISA方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小反刍动物慢病毒间接ELISA检测试剂盒。
背景技术
小反刍动物慢病毒，包括山羊关节炎-脑炎（CAEV）和梅迪-维斯纳病毒（MVV），可引起的山羊（CAEV）或绵羊（MVV）的一种慢性病毒性传染病。山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV），成年山羊的主要病症是以严重的腕关节炎（“大膝盖”）为特征，即使食欲没受到影响，受CAEV感染的动物会变得很瘦弱，产奶量也很少。血清学调查显示CAEV广泛散布于各大洲的山羊群中；感染梅迪-维斯那病毒（MVV）后，绵羊的主要病症包括慢性渐进性关节炎、肺炎、乳房炎和脑脊髓炎。此病的病原体是一种慢病毒，属于逆转录病毒的亚群。MVV感染涉及世界各国。目前为止，最重要的感染来源仍是阳性动物的乳汁。事实上，如果使用畜群的共用乳汁饲喂小山羊，那么所有的小山羊都将被一只阳性山羊感染。现在还没有有效的疫苗。因此，根除方案必须依赖于断绝初乳、并对感染动物实施隔离和血清学检测。
小反刍动物慢病毒的基因组同源性较高，可达70%以上，其诊断标记蛋白均主要为P28和GP135蛋白，具有较高的交叉反应原性，作为诊断抗原广泛用于琼脂糖凝胶扩散试验（AGID）和ELISA诊断方法。琼脂糖凝胶扩散试验（AGID）是用于检测血清中CAEV抗体的最常用的方法，也是国际兽医组织（OIE）推荐的检测方法。AGID的常用抗原是全病毒抗原，而衣壳蛋白P28和囊膜蛋白gp135也可以用做AGID的抗原，为血清学诊断标记蛋白。同时，由于ELISA更敏感、更经济，且能够用于大规模的血清学筛查，在2004年被OIE定为CAEV检测的标准方法。目前，常用于ELISA抗原包括全病毒抗原和重组抗原，重组抗原中P28蛋白和Gp135为重要的血清学诊断标蛋白。
发明内容
本发明的目的：本发明使用人工合成的两条寡肽作为抗原包被可特异性吸附寡肽的ELISA板，通过优化寡肽抗原包被浓度、被检血清浓度和HRP标记的兔抗山羊抗体的稀释度，建立了可以检测小反刍动物慢病毒血清抗体的间接ELISA筛选方法，由于寡肽合成快速、价格低廉、使用量低（pg–ng级）更适用于试剂盒的制造。
本发明的技术方案：一种用于检测小反刍动物慢病毒的两条寡肽，包含与SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列一致性不小于90%的其它序列的寡肽P1；和包含与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列一致性不小于90%的其它序列的寡肽P2。
进一步，寡肽P1其具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列和寡肽P2具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
一种检测小反刍动物慢病毒的试剂盒，含有权利要求1或2所述的SEQ ID No.1所示的氨基酸序列和/或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
进一步，使用人工合成的寡肽P1和P2质量浓度比例为1.6∶1的混合物作为包被待检测抗原制备成寡肽抗原，其使用混合浓度为300 pg/mL，采用间接ELISA检测方法进行检测。
进一步，所述间接ELISA检测方法进行检测，优化后的检测体系具体为：1）寡肽抗原300 pg/mL，100μL/孔，4℃过夜；2）1.25% 牛血清白蛋白PBS-BSA封闭液孵育30min，200μL/孔， PBS-Tween 20（0.3%）清洗；3）100μL/孔加入被测血清，封闭液100倍稀释，孵育1h，PBS-Tween 20（0.3%）清洗；4）100μL/孔加入封闭液2000倍稀释的HRP标记二抗孵育40min，PBS-Tween 20（0.3%）清洗；5）100μL/孔加入TMB，显色10 min；6）50μL/孔加入H2SO4终止液终止反应；7）满足阳性标准对照品OD值与阴性对照标准品比值≥2.8，空白对照OD值<0.30，此时待检血清孔OD值与阴性对照标准品比值≥2.1者判为阳性。
进一步，还包括间接ELISA检测方法中阳性对照标准品和阴性对照标准品的制备，具体如下：
A检测山羊关节炎-脑炎（CAEV）血清抗体的标准品：
a阳性对照标准品：使用CAEV 毒株人工感染0-3月龄山羊10只，感染后60天经筛查为血清抗体阳性，感染后90-300天期间，每间隔2周采集50mL/羊抗凝血，分离血浆，经筛查判定为阳性，将血浆等比例混合制备阳性对照标准品；
b阴性对照标准品：经筛查判定为血清抗体阴性的10只3-20月龄山羊，每间隔2周采集50mL/羊抗凝血，分离血浆，经筛查判定为阴性，将血浆等比例混合制备阴性对照标准品；
B检测绵羊梅迪-维斯纳病毒（MVV）血清抗体的标准品：
c阳性对照标准品：使用MVV 毒株人工感染0-3月龄绵羊10只，感染后60天经筛查判定为血清抗体阳性，感染后90-300天期间，每间隔2周采集50mL/羊抗凝血，分离血浆，经筛查判定为阳性，将血浆等比例混合制备阳性对照标准品；
d阴性对照标准品：经筛查判定为血清抗体阴性的10只3-20月龄绵羊，每间隔2周采集50 mL/羊抗凝血，分离血浆，经筛查判定为阴性，将血浆等比例混合制备阴性对照标准品。
有益效果：本申请使用人工合成的两条寡肽作为抗原包被可特异性吸附寡肽的ELISA板，通过优化寡肽抗原包被浓度、被检血清浓度和HRP标记的兔抗山羊抗体的稀释度，建立了可以检测小反刍动物慢病毒血清抗体的间接ELISA方法。
具体实施方式
实施例、
1．寡肽的氨基酸序列及合成
根据小反刍动物慢病毒的血清学诊断标物p28和gp135蛋白的二级和三级结构设计了两条寡肽，并进行了相关参数分析，见表1，委托生物技术公司进行合成。
表 两条寡肽的序列和相关参数
| 名称 | 氨基酸序列（C-N） | 参数 |
| P-1 | AQANMDQAR | PI:5.88；MW:1004.09；GRAVY:-1.244 |
| P-2 | NPPGPNVLTV | PI:5.52；MW:1007.15；GRAVY:-0.070 |
2．间接ELISA检测方法的建立
2.1 标准品制备
检测山羊关节炎-脑炎（CAEV）血清抗体的标准品：
阳性对照标准品：使用CAEV ATCC VR-905 毒株人工感染0-3月龄山羊10只，感染后60天经IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒（产品编号：CVT1135T）筛查判定为血清抗体阳性，感染后90-300天期间，每间隔2周采集50mL/羊抗凝血，分离血浆，经IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒（产品编号：CVT1135T）筛查判定为阳性，将血浆等比例混合制备标准阳性血清。
阴性对照标准品：
经IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒（产品编号：CVT1135T）筛查判定为血清抗体阴性的10只3-20月龄山羊，每间隔2周采集50mL/羊抗凝血，分离血浆，经IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒（产品编号：CVT1135T）筛查判定为阴性，将血浆等比例混合制备标准阴性血清。
检测绵羊梅迪-维斯纳病毒（MVV）血清抗体的标准品：
阳性对照标准品：使用MVV 新疆分离毒株人工感染0-3月龄绵羊10只，感染后60天经IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒（产品编号：CVT1135T）筛查判定为血清抗体阳性，感染后90-300天期间，每间隔2周采集50mL/羊抗凝血，分离血浆，经IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒（产品编号：CVT1135T）筛查判定为阳性，将血浆等比例混合制备标准阳性血清。
阴性对照标准品：经IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒（产品编号：CVT1135T）筛查判定为血清抗体阴性的10只3-20月龄绵羊，每间隔2周采集50 mL/羊抗凝血，分离血浆，经IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒（产品编号：CVT1135T）筛查判定为阴性，将血浆等比例混合制备标准阴性血清。
ELISA板：
选择Thermo Scientific™公司的Pierce™ Maleic Anhydride Activated Plates，Clear，96-Well。
1.2间接ELISA检测方法的建立
使用合成的寡肽P1和P2质量浓度比例为1.6∶1的混合物作为包被抗原，使用混合浓度为300 pg/mL。
1）寡肽抗原（300 pg/mL），100μL/孔，4℃过夜；2）1.25% 牛血清白蛋白（PBS-BSA）封闭液孵育30min，200μL/孔，清洗（PBS-Tween 20（0.3%））；3）100μL/孔加入被测血清（封闭液100倍稀释），孵育1h，清洗（PBS-Tween 20（0.3%））；4）100μL/孔加入封闭液2000倍稀释的HRP标记二抗孵育40min，清洗（PBS-Tween 20（0.3%））；5）100μL/孔加入TMB，显色10 min；6）50μL/孔加入H2SO4终止液终止反应；7）满足阳性对照OD值与阴性对照比值≥2.8，空白对照OD值<0.30，此时待检血清孔OD值与阴性对照比值≥2.1者判为阳性。
实际应用举例
实例1. 间接ELISA方法诊断CAEV感染山羊
山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV）感染山羊后，刺激产生抗体，使用建立间接ELISA方法检测被检山羊血清抗体，可以用于CAE的血清学诊断。
1.1 材料
血清：IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒（产品编号：CVT1135T）筛查，山羊阳性血清样本30份，阴性60份；
1.2 试验方法
按照本申请技术方案中间接ELISA检测方法进行。
2. 结果
经建立的iELISA方法检测，30份山羊阳性血清样本中28份为阳性，8份为阴性；60份阴性样本全部为阴性。与IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒相比：符合率为97.7%，特异性为100%，敏感性为93.3%。
实例2. 间接ELISA方法诊断MVV感染绵羊
梅迪-维斯纳病毒（MVV）感染绵羊后，刺激产生抗体，使用建立间接ELISA方法检测被检血清抗体，可以用于MVV的血清学诊断。
1.1 材料
血清：IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒（产品编号：CVT1135T）筛查，绵羊阳性血清样本23份，阴性67份；
1.2 试验方法
按照本申请技术方案中间接ELISA检测方法进行。
2. 结果
经建立的iELISA方法检测，23份绵羊阳性血清样本中19份为阳性，4份为阴性；67份阴性样本全部为63份阴性，4份为阳性。与IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒相比：符合率为91.1%，特异性为94.0%，敏感性为82.6%。
SEQUENCE LISTING
<110> 新疆畜牧科学院
<120> 一种小反刍动物慢病毒间接ELISA检测试剂盒
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 1
<400> 1
Ala Gln Ala Asn Met Asp Gln Ala Arg
1 5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asn Pro Pro Gly Pro Asn Val Leu Thr Val
1 5 10
Claims (6)
1.一种用于检测小反刍动物慢病毒的两条寡肽，其特征在于：包含与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列一致性不小于90%的其它序列的寡肽P1；和包含与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列一致性不小于90%的其它序列的寡肽P2。
2.如权利要求1所述的一种用于检测小反刍动物慢病毒的两条寡肽，其特征在于：寡肽P1其具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列和寡肽P2具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.一种检测小反刍动物慢病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的SEQID No.1所示的氨基酸序列和/或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，使用人工合成的寡肽P1和P2质量浓度比例为1.6∶1的混合物作为包被待检测抗原制备成寡肽抗原，其使用混合浓度为300 pg/mL，采用间接ELISA检测方法进行检测。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述间接ELISA检测方法进行检测，优化后的检测体系具体为：1）寡肽抗原300 pg/mL，100μL/孔，4℃过夜；2）1.25% 牛血清白蛋白PBS-BSA封闭液孵育30min，200μL/孔， PBS-Tween 20（0.3%）清洗；3）100μL/孔加入被测血清，封闭液100倍稀释，孵育1h， PBS-Tween 20（0.3%）清洗；4）100μL/孔加入封闭液2000倍稀释的HRP标记二抗孵育40min，PBS-Tween 20（0.3%）清洗；5）100μL/孔加入TMB，显色10min；6）50μL/孔加入H2SO4终止液终止反应；7）满足阳性标准对照品OD值与阴性对照标准品比值≥2.8，空白对照OD值<0.30，此时待检血清孔OD值与阴性对照标准品比值≥2.1者判为阳性。
6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括间接ELISA检测方法中阳性对照标准品和阴性对照标准品的制备，具体如下：
A检测山羊关节炎-脑炎（CAEV）血清抗体的标准品：
a阳性对照标准品：使用CAEV 毒株人工感染0-3月龄山羊10只，感染后60天经筛查为血清抗体阳性，感染后90-300天期间，每间隔2周采集50mL/羊抗凝血，分离血浆，经筛查判定为阳性，将血浆等比例混合制备阳性对照标准品；
b阴性对照标准品：经筛查判定为血清抗体阴性的10只3-20月龄山羊，每间隔2周采集50mL/羊抗凝血，分离血浆，经筛查判定为阴性，将血浆等比例混合制备阴性对照标准品；
B检测绵羊梅迪-维斯纳病毒（MVV）血清抗体的标准品：
c阳性对照标准品：使用MVV 毒株人工感染0-3月龄绵羊10只，感染后60天经筛查判定为血清抗体阳性，感染后90-300天期间，每间隔2周采集50mL/羊抗凝血，分离血浆，经筛查判定为阳性，将血浆等比例混合制备阳性对照标准品；
d阴性对照标准品：经筛查判定为血清抗体阴性的10只3-20月龄绵羊，每间隔2周采集50 mL/羊抗凝血，分离血浆，经筛查判定为阴性，将血浆等比例混合制备阴性对照标准品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710667616.8A CN107632153B (zh) | 2017-08-07 | 2017-08-07 | 一种小反刍动物慢病毒间接elisa检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710667616.8A CN107632153B (zh) | 2017-08-07 | 2017-08-07 | 一种小反刍动物慢病毒间接elisa检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107632153A true CN107632153A (zh) | 2018-01-26 |
| CN107632153B CN107632153B (zh) | 2019-05-24 |
Family
ID=61099385
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710667616.8A Expired - Fee Related CN107632153B (zh) | 2017-08-07 | 2017-08-07 | 一种小反刍动物慢病毒间接elisa检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107632153B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114409806A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-04-29 | 内蒙古农业大学 | 一种ca-tm融合蛋白及其在检测梅迪-维斯纳病毒中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1219881A (zh) * | 1996-03-15 | 1999-06-16 | 南加利福尼亚大学 | 山羊关节炎－脑炎病毒提供抗hiv－1感染的免疫保护 |
| CN107447045A (zh) * | 2017-08-29 | 2017-12-08 | 新疆畜牧科学院 | 一种小反刍动物慢病毒的病原学检测试剂盒 |
-
2017
- 2017-08-07 CN CN201710667616.8A patent/CN107632153B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1219881A (zh) * | 1996-03-15 | 1999-06-16 | 南加利福尼亚大学 | 山羊关节炎－脑炎病毒提供抗hiv－1感染的免疫保护 |
| CN107447045A (zh) * | 2017-08-29 | 2017-12-08 | 新疆畜牧科学院 | 一种小反刍动物慢病毒的病原学检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 刘慧敏等: "山羊关节炎-脑炎病毒P28蛋白的表达与间接ELISA方法的建立", 《中国预防兽医学报》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114409806A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-04-29 | 内蒙古农业大学 | 一种ca-tm融合蛋白及其在检测梅迪-维斯纳病毒中的应用 |
| CN114409806B (zh) * | 2022-01-24 | 2023-07-07 | 内蒙古农业大学 | 一种ca-tm融合蛋白及其在检测梅迪-维斯纳病毒中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107632153B (zh) | 2019-05-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105829892B (zh) | Csfv抗体的改进的诊断测试 | |
| CN102323416A (zh) | 一种快速检测样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及检测方法 | |
| JP5435844B2 (ja) | インフルエンザウイルスｈ５亜型の免疫検出法 | |
| CN106405093A (zh) | 抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒 | |
| CN109142724B (zh) | 一种用于检测i群禽腺病毒4型抗体的阻断elisa试剂盒及其应用 | |
| CN102731615A (zh) | Prrsv的检测试剂和检测方法 | |
| CN105542014A (zh) | Tp重组抗原及其制备方法和应用 | |
| CN105837686A (zh) | 一种单克隆抗体及其应用 | |
| CN107449912B (zh) | 抗h7n9亚型禽流感病毒单克隆抗体抗原表位及其筛选方法和应用 | |
| CN106771181A (zh) | 一种禽流感h7n9血凝素ha抗原检测 elisa 试剂盒及检测方法 | |
| CN106771208A (zh) | 布鲁氏菌抗体检测试纸条 | |
| CN109810191B (zh) | 一种抗羊骨骼肌肌钙蛋白i单克隆抗体及其应用 | |
| CN109799351A (zh) | 猪圆环病毒2型双抗体夹心elisa试剂盒及其应用 | |
| CN104404000B (zh) | 分泌抗烟草花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN106632691A (zh) | Hiv重组抗原、表达基因、表达载体以及hiv检测试剂盒 | |
| CN108752471A (zh) | 抗pcv2单克隆抗体的制备方法及其应用 | |
| CN109852588A (zh) | 一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其细胞株和应用 | |
| CN107632153B (zh) | 一种小反刍动物慢病毒间接elisa检测试剂盒 | |
| CN106701687A (zh) | 一种杂交瘤细胞株及其产生的狂犬病毒磷蛋白单克隆抗体 | |
| CN1557838A (zh) | Sars冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体、产生该抗体的杂交瘤和含此抗体的检测试剂及其用途 | |
| CN102590505A (zh) | 抗肠道病毒71型衣壳蛋白1 IgM AlphaLISA检测试剂盒 | |
| CN105567643B (zh) | 可分泌抗ev71病毒蛋白vp1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 | |
| CN109884314B (zh) | 猪流行性腹泻病毒s2蛋白间接elisa抗体检测方法及其试剂盒 | |
| CN111398594A (zh) | 一种特异性检测黄热病毒ns1抗原的免疫诊断试剂盒 | |
| CN104628834A (zh) | 一种结核感染t细胞免疫检测抗原及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190524 Termination date: 20210807 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |