CN104297384A - 一种肉品中硝基呋喃类药物代谢物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种肉品中硝基呋喃类药物代谢物的检测方法，该检测方法包括以下步骤：(1)前处理，将样品放入前处理液中振荡，然后离心分离，去清液，得到固体残渣；(2)所述固体残渣的处理，样品固体残渣提取液中加入衍生化剂，在加热、酸性、惰性气体保护条件下进行衍生化处理，所述衍生化处理完成后再冷却、调节pH至中性，再离心取得上清液，再将所述上清液通过固相萃取柱，然后用淋洗液进行淋洗，再用洗脱液进行洗脱处理，得到洗脱液，所述洗脱液浓缩干燥，再用复溶液进行复溶，便得样品溶液。本发明的检测方法可以适用于各种动物源性样品，可以将水解衍生化过程缩短至30-60分钟，整个检测过程缩短到60-120分钟。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物残留检测的监测方法，尤其涉及一种肉品中硝基呋喃类药物代谢物的检测方法。
背景技术
目前，农业部193号公告明确规定硝基呋喃类药物严禁用于食用动物，但因为其在治疗肠道细菌感染等方面疗效明显，并且价格低廉，在畜禽养殖中还存在非法使用。硝基呋喃类药物残留主要检测其代谢物：3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、1-氨基乙内酰脲(AHD)。大部分硝基呋喃代谢物与蛋白结合紧密，只有小部分以游离态形式存在，其水解衍生化是检测的关键环节。
目前检测硝基呋喃类药物代谢物残留的代表性的方法主要有：
(1)“GB/T 20752-2006猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法”
(2)酶联免疫法
(3)《中华人民共和国国家标准农业部1077号公告-2-2008》“水产品中硝基呋喃类代谢物残留量-高效液相色谱法”
上述方法(1)和(2)的前处理，均需要经过16小时的水解衍生化过程。方法(3)只用于检测水产品中的代谢物，并且试剂较为复杂，不能对鸡肉、猪肉，动物肝脏等动物源性食品中硝基呋喃代谢物进行准确的检测。
发明内容
本发明旨在解决现有技术只能检测水产品中的代谢物，并且试剂较为复 杂，不能对鸡肉、猪肉，动物肝脏等动物源性食品中硝基呋喃代谢物进行准确的检测的问题，进而提出一种可以快速检测硝基呋喃类药物代谢物残留的检测方法。
本申请提供了一种肉品中硝基呋喃类药物代谢物的检测方法，该检测方法包括以下步骤：
(1)前处理
将样品放入前处理液中振荡，然后离心分离，去清液，得到固体残渣；
(2)所述固体残渣的处理
样品固体残渣提取液中加入衍生化剂，在加热、酸性条件下进行衍生化处理，衍生化完成后冷却、调节pH至中性，再离心取得上清液，再将所述上清液通过固相萃取柱，然后用淋洗液进行淋洗，再用洗脱液进行洗脱处理，得到洗脱液，所述洗脱液浓缩干燥，再用复溶液进行复溶，便得样品溶液。
其中，在进行所述衍生化处理时，所述提取液中所述衍生化剂的浓度为0.1mmol/L。
其中，所述衍生化剂为2-硝基苯甲醛的二甲基亚砜溶液。
其中，所述衍生化处理的条件为：在惰性气体保护的条件下进行所述衍生化处理，pH为0.9-1.1，温度为90-104℃，时间为30-60分钟。
其中，所述冷却的温度为0-15℃。
其中，在将所述上清液通过固相萃取柱之前还包括以下步骤：使用过滤器对所述样品溶液进行过滤。
其中，所述萃取液为甲醇的水溶液，甲醇体积含量为50％-90％。
其中，所述淋洗液为水，
所述洗脱液为乙酸乙酯，
所述复溶液为氨水的甲醇溶液。
其中，所述固相萃取柱为亲脂亲水平衡体反相萃取柱。
其中，所述硝基呋喃类药物代谢物为呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、 呋喃西林代谢物和呋喃妥因代谢物中的一种或几种。
与有关技术相比，本发明实施例的有益效果如下：
(1)本发明实施例的肉品中硝基呋喃类药物代谢物的检测方法，适用于各种动物源性样品，样品先用甲醇/水洗后，再检测样品固体残渣中结合态的硝基呋喃代谢物，并且所使用的水解衍生化剂进行衍生化前处理，可以将硝基呋喃类药物代谢物残留检测的水解衍生化过程缩短至30-60分钟，整个检测过程缩短到60-120分钟。
(2)本发明实施例的肉品中硝基呋喃类药物代谢物的检测方法，前处理过程适合于猪、牛、鸡等动物的肌肉、肝、肾等组织以及鸡蛋、水产品等动物源性食品。
(3)本发明实施例的肉品中硝基呋喃类药物代谢物的检测方法，试剂和反应条件相对简单，使残留检测的前处理更为方便、高效、标准。
具体实施方式
下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
实施例1
(1)前处理
称量2g均质好的样品(猪肉)在带盖的离心管中；加入10ml甲醇/水溶液(甲醇含量70％)，混匀，离心，弃去上清液，样品固体残渣留作下一步处理用。
(2)衍生化处理
样品固体残渣提取液中加入2-硝基苯甲醛的二甲基亚砜溶液(在提取液中的浓度为0.1mmol/L)和盐酸溶液(在提取液中的浓度为0.1-0.2mol/L，即pH约为0.9-1.1)，然后充入氮气，并在氮气环境中密封盖好离心管盖(这样可以密闭避光，防止2-硝基苯甲醛和硝基呋喃代谢物的衍生物不被氧化，提高衍生化效率)；在90-99℃水浴或90-104℃的空气浴中衍生30-60分钟； 冷却水解衍生液至15℃以下；调节水解衍生液的pH值至中性，并离心，取得上清液。
(3)过柱和复溶
将上清液通过固相萃取小柱(亲脂亲水平衡体反相萃取柱60mg填料，6mL容积，可直接上样)，用水淋洗，并抽干，用乙酸乙酯洗脱；吹干洗脱液，用复溶液(氨水的甲醇溶液，其体积比为50/50)进行复溶，得到样品溶液。
样品溶液可用于液相色谱-紫外、液相色谱串联质谱、酶联免疫等方法检测。
实施例2
(1)前处理
称量2g均质好的样品(鸡肝)在带盖的离心管中；加入20ml甲醇/水溶液(甲醇含量50％)，混匀，离心，弃去上清液，样品固体残渣留作下一步处理用。
(2)衍生化处理
样品固体残渣提取液中加入2-硝基苯甲醛的二甲基亚砜溶液(在提取液中的浓度为0.1mmol/L)和盐酸溶液(在提取液中的浓度为0.1-0.2mol/L，即pH约为0.9-1.1)，然后充入氮气，并在氮气环境中密封盖好离心管盖(这样可以密闭避光，防止2-硝基苯甲醛和硝基呋喃代谢物的衍生物不被氧化，提高衍生化效率)；在99℃水浴中衍生60分钟；冷却水解衍生液至4℃；调节水解衍生液的pH值至中性，并离心，取得上清液。
(3)过柱和复溶
将上清液通过固相萃取小柱(亲脂亲水平衡体反相萃取柱60mg填料，6mL容积，可直接上样)，用水淋洗，并抽干，用乙酸乙酯洗脱；吹干洗脱液，用复溶液(氨水的甲醇溶液，其体积比为50/50)进行复溶，得到样品溶液。
样品溶液可用于液相色谱-紫外、液相色谱串联质谱、酶联免疫等方法检测。
实施例3
(1)前处理
称量2g均质好的样品(鸡蛋)在带盖的离心管中；加入10ml甲醇/水溶液(甲醇含量90％)，混匀，离心，弃去上清液，样品固体残渣留作下一步处理用。
(2)衍生化处理
样品固体残渣提取液中加入2-硝基苯甲醛的二甲基亚砜溶液(在提取液中的浓度为0.1mmol/L)和盐酸溶液(在提取液中的浓度为0.1-0.2mol/L，即pH约为0.9-1.1)，然后充入氮气，并在氮气环境中密封盖好离心管盖(这样可以密闭避光，防止2-硝基苯甲醛和硝基呋喃代谢物的衍生物不被氧化，提高衍生化效率)；在90-104℃的空气浴中衍生30分钟；冷却水解衍生液至1℃；调节水解衍生液的pH值至中性，并离心，取得上清液。
(3)过柱和复溶
将上清液通过固相萃取小柱(亲脂亲水平衡体反相萃取柱60mg填料，6mL容积，可直接上样)，用水淋洗，并抽干，用乙酸乙酯洗脱；吹干洗脱液，用复溶液(氨水的甲醇溶液，其体积比为50/50)进行复溶，得到样品溶液。
样品溶液可用于液相色谱-紫外、液相色谱串联质谱、酶联免疫等方法检测。
测试例
(1)对实施例1-3的样品进行检测分析，其检测分析条件如下：
分析条件参照：GB/T 21311-2007《动物源性食品中硝基呋喃类药物药物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法》进行。具体质谱多反应检测 (MRM)参数如下表所示：
硝基呋喃类药物药物残留量检测MRM参数
(2)硝基呋喃药物的重复性和变异系数
称取经测定空白试样2g，分别加入0.5，1和2ng/g浓度水平的硝基呋喃药物混合标准溶液，充分混匀,按照实施例1的方法进行前处理并测定含量,每个添加水平平行测定6份。所有药物回收率,变异系数见下。
表1
虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容只是为了便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属技术领域内 的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式上及细节上作任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
Claims (10)
1.一种肉品中硝基呋喃类药物代谢物的检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
(1)前处理
将样品放入前处理液中振荡，然后离心分离，去清液，得到固体残渣；
(2)所述固体残渣的处理
样品固体残渣提取液中加入衍生化剂，在加热、酸性条件下进行衍生化处理，衍生化完成后冷却、调节pH至中性，再离心取得上清液，再将所述上清液通过固相萃取柱，然后用淋洗液进行淋洗，再用洗脱液进行洗脱处理，得到洗脱液，所述洗脱液浓缩干燥，再用复溶液进行复溶，便得样品溶液。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在进行所述衍生化处理时，所述提取液中所述衍生化剂的浓度为0.1mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，所述衍生化剂为2-硝基苯甲醛的二甲基亚砜溶液。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，所述衍生化处理的条件为：在惰性气体保护的条件下进行所述衍生化处理，pH为0.9-1.1，温度为90-104℃，时间为30-60分钟。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，所述冷却的温度为0-15℃。
6.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，在将所述上清液通过固相萃取柱之前还包括以下步骤：使用过滤器对所述样品溶液进行过滤。
7.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，所述萃取液为甲醇的水溶液，甲醇体积含量为50％-90％。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述淋洗液为水，
所述洗脱液为乙酸乙酯，
所述复溶液为氨水的甲醇溶液。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述固相萃取柱为亲脂亲水平衡体反相萃取柱。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述硝基呋喃类药物代谢物为呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物和呋喃妥因代谢物中的一种或几种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150121 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |