CN111207991A - 一种硝基呋喃类代谢物的前处理方法及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种硝基呋喃类代谢物的前处理方法及其检测方法。其中，硝基呋喃类代谢物的前处理方法为：将样品搅碎后加入盐酸和2‑硝基苯甲醛，超声混合均匀后，在160～500W微波条件下反应1.5～5min；再加入功能化纳米磁珠悬浮液，超声混匀后静置、分离，获得待测液。本发明的样品衍生化反应采用低功率微波处理，反应可以在短时间内迅速完成，反应时间短，衍生效率高，且该前处理方法可有效缩短检测时间；采用具有较高的特异性识别能力，吸附能力强的功能化纳米磁珠富集硝基呋喃类代谢物，可通过外加磁场快速方便的从复杂基质中分离出来，不需要额外的离心或过滤过程，操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及硝基呋喃类代谢物检测领域，尤其涉及一种硝基呋喃类代谢物的前处理方法及其检测方法。
背景技术
硝基呋喃类药物(Nitrofurans)主要指呋喃唑酮(Furazalidone，NZD)、呋喃它酮(Furaltadone，FTD)、呋喃妥因(Furantoin，NFT)和呋喃西林(Nitrofurazone，NFZ)，是一类广谱抗生素，曾在水产养殖过程中被广泛用于预防和治疗细菌性疾病。有关研究证明，硝基呋喃类药物及其代谢物毒副作用较强，能在体内蓄积，导致慢性中毒，甚至致癌、致畸、致突变。美国、日本、欧盟等国家已禁止硝基呋喃类药物用于畜禽及水产动物食品，我国农业部第235号公告同样规定了在动物源性食品中不得检出硝基呋喃类药物，并在饲养过程中禁止使用。但由于硝基呋喃类药物价格低廉且药效显著，多年来一直屡禁不止，不仅危害人类身体健康，也给我国养殖业带来巨大经济损失。
胶体金免疫层析法因其简单、快速、直观等特点，已成为食品安全快速检测的有效方法。但硝基呋喃类药物残留的测定，一般通过检测其代谢物来实现。鉴于其代谢物分子量小、不具有抗原性质，且与蛋白结合稳定，故需要对样品进行水解和衍生化处理。专利CN101949897A公开了一种硝基呋喃类代谢物前处理检测方法，包括样品匀浆提取、衍生化、乙酸乙酯萃取、过柱净化、乙腈萃取等12个步骤，操作过程繁琐，耗时达7h，且涉及大量有机溶剂；专利CN110361490A公开了硝基呋喃类代谢物的前处理法，采用50～65℃超声衍生化和HLB柱固相萃取，但衍生化时间过长(1～1.5h)，萃取柱缺乏高选择性。此外，在前处理过程中常采用高温或高温高压进行衍生化的方法来进一步缩短前处理时间，如：专利CN104297384A公开了一种肉品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，该方法在90～104℃下进行衍生化处理30-60min；专利CN107677524A公开了一种含有硝基呋喃代谢物的动物源性样品测定的前处理方法，采用ASE加速溶剂萃取仪，在80～120℃，10342kPa的条件下进行，整个衍生过程需要30min。上述方法由于采用高温或高温高压条件，容易引起盐酸挥发而酸解不完全、反应物碳化、衍生效率低下等问题，且需要特殊设备，不适用于大批量检测和现场快速检测。
专利CN109632427A公开了一种硝基呋喃类代谢物快速检测的前处理方法及其检测方法，样品在60～85℃水浴中衍生化10～20min，加入乙酸乙酯萃取得上清液，加入正己烷、NaCl和磷酸盐缓冲液静置分层，取下层检测液进行检测。该方法虽然操作简便、耗时相对较短，但复杂的基质会导致测定困难和干扰，尤其是在分析浓度极低的样品，达不到检测要求。
综上，目前硝基呋喃类代谢物的前处理方法存在以下问题：(1)衍生反应时间长：现有技术衍生时间长达1h以上，不能满足快速检测要求。同时，邻硝基苯甲醛衍生化反应不宜高温加热，通过高温或高温高压的方式缩短衍生反应时间，容易引起盐酸挥发而酸解不完全、反应物碳化、衍生效率低下等问题，且对仪器设备提出更高要求。(2)萃取柱虽然品种繁多，但缺乏高选择性，容易引起基质效应影响检测结果。(3)处理过程涉及大量有机溶剂，对环境不友好，成本高。(4)操作过程复杂，单纯简化操作虽然能带来时间上的优势，但复杂的基质会导致测定困难和干扰，尤其是在分析浓度极低的样品，达不到检测要求。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种硝基呋喃类代谢物的前处理方法及其检测方法，样品衍生化反应时间短，衍生效率高；并且检测速度快。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
本发明提供一种硝基呋喃类代谢物的前处理方法，将样品搅碎后加入盐酸和2-硝基苯甲醛，超声混合均匀后，在160～500W微波条件下反应1.5～5min；再加入功能化纳米磁珠的悬浮液，超声混匀后静置、分离，获得待测液。
在一个具体实施例中，将样品搅碎后加入盐酸和2-硝基苯甲醛，超声混合均匀后，在160W微波条件下反应5min；再加入功能化纳米磁珠的悬浮液，超声混匀后静置、分离，获得待测液。
在一个具体实施例中，将样品搅碎后加入盐酸和2-硝基苯甲醛，超声混合均匀后，在350W微波条件下反应3min；再加入功能化纳米磁珠的悬浮液，超声混匀后静置、分离，获得待测液。
在一个具体实施例中，将样品搅碎后加入盐酸和2-硝基苯甲醛，超声混合均匀后，在500W微波条件下反应1.5min；再加入功能化纳米磁珠的悬浮液，超声混匀后静置、分离，获得待测液。
在一个具体实施例中，功能化纳米磁珠的制备方法包括以下步骤：步骤S1：在60～80℃、惰性气体条件下向FeCl3和FeSO4的水溶液中加入氨水调整至pH值为9～11，优选地，pH为10，反应1～2h后，分离、洗涤、干燥，获得Fe3O4，其中，Fe3+、Fe2+的摩尔比为2:(1～1.5)；步骤S2：将Fe3O4溶于无水乙醇、氨水的混合溶液中，混合均匀后，加入四乙氧基硅烷，反应5～7h后磁性分离，并洗涤、干燥，获得Fe3O4@SiO2纳米颗粒；步骤S3：将Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于无水乙醇中，加入γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷并分散均匀，在50～70℃条件下反应10～13h，分离、洗涤、干燥后获得改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒；步骤S4：将所述改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于惰性有机溶剂中，加入N-乙烯基吡咯烷酮、二乙烯基苯、偶氮二异丁腈并混合均匀，在55～70℃条件下反应8～12h后，分离、洗涤、干燥，获得功能化纳米磁珠。
在一个具体实施例中，在步骤S1中，将3.28g FeC13·6H2O和1.68g FeSO4·7H2O超声溶于200mL水中，在75℃、氮气保护下搅拌加入20mL质量分数为25％的氨水，反应1.5h后冷却，在磁场作用下进行分离后依次用无水乙醇和去离子水洗涤，40℃真空干燥，获得Fe3O4。
在一个具体实施例中，在步骤S2中，将1.0g Fe3O4加入100mL去离子水、800mL无水乙醇和10mL质量分数为25％的氨水的混合液中，超声混匀后加入8mL四乙氧基硅烷，30℃搅拌、反应6h后分离，并依次用无水乙醇和去离子水洗涤，40℃真空干燥，获得Fe3O4@SiO2纳米颗粒。
在一个具体实施例中，在步骤S3中，将0.4g所述Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于80mL的无水乙醇中，加入4mLγ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，超声15min分散均匀，在60℃、氮气保护下振荡反应12h后磁性分离，并依次用无水乙醇和去离子水洗涤，40℃真空干燥，获得改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒。
在一个具体实施例中，在步骤S4中，将0.2mg所述改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于惰性有机溶剂中，加入0.5g N-乙烯基吡咯烷酮、0.3mg二乙烯基苯、0.1g偶氮二异丁腈，超声混匀后在65℃条件下振荡反应10h后冷却、磁性分离，并依次用乙醇和去离子水洗涤，40℃真空干燥，获得功能化纳米磁珠。
本发明还提供一种硝基呋喃类代谢物的检测方法，将上述任一实施例所述的前处理方法获得的待测液滴加到免疫胶体金检测板上，3～5min读取结果。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明的样品衍生化反应采用低功率微波处理，反应可以在短时间内迅速完成，反应时间短，衍生效率高，且该前处理方法可有效缩短检测时间；采用具有较高的特异性识别能力、吸附能力强的功能化纳米磁珠富集硝基呋喃类代谢物，可通过外加磁场快速方便的从复杂基质中分离出来，不需要额外的离心或过滤过程，操作简便。
具体实施方式
以下将对本发明进行更为详细的描述，需要说明的是，以下对本发明进行的描述仅是示意性的，而非限制性的。各个不同实施例之间可以进行相互组合，以构成未在以下描述中示出的其他实施例。
本发明提供一种硝基呋喃类代谢物的前处理方法，将样品搅碎后加入盐酸和2-硝基苯甲醛，超声混合均匀后，在160～500W微波条件下反应1～5min；再加入功能化纳米磁珠悬浮液，超声混匀后静置、分离，获得待测液。
在一个具体实施例中，样品搅碎后加入盐酸和2-硝基苯甲醛，超声混合均匀后，在160W微波条件下反应5min；再加入功能化纳米磁珠悬浮液，超声混匀后静置、分离，获得待测液。
在一个具体实施例中，将样品搅碎后加入盐酸和2-硝基苯甲醛，超声混合均匀后，在350W微波条件下反应3min；再加入以上任一制备方法制备的功能化纳米磁珠悬浮液，超声混匀后静置、分离，获得待测液。
在一个具体实施例中，将样品搅碎后加入盐酸和2-硝基苯甲醛，超声混合均匀后，在500W微波条件下反应1.5min；再加入以上制备方法制备的功能化纳米磁珠悬浮液，超声混匀后静置、分离，获得待测液。
本发明中功能化纳米磁珠的制备方法包括以下步骤：步骤S1—Fe3O4磁性纳米颗粒的制备：在60～80℃、惰性气体条件下向FeCl3和FeSO4的水溶液中加入氨水，调整溶液的pH值为9～11，如pH为10，反应1～2h后，分离、洗涤、干燥，获得Fe3O4，其中，Fe3+、Fe2+的摩尔比为2:(1～1.5)；步骤S2—磁性Fe3O4@SiO2纳米颗粒的制备：将Fe3O4溶于无水乙醇、氨水的混合溶液中，混合均匀后，加入四乙氧基硅烷，反应5～7h后磁性分离，并洗涤、干燥，获得Fe3O4@SiO2纳米颗粒；步骤S3—磁性Fe3O4@SiO2纳米颗粒的改性：将Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于无水乙醇中，加入γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷并分散均匀，在50～70℃条件下反应10～13h，分离、洗涤、干燥后获得改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒；步骤S4—功能化纳米磁珠的制备：将所述改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于惰性有机溶剂中，加入N-乙烯基吡咯烷酮、二乙烯基苯、偶氮二异丁腈并混合均匀，在55～70℃条件下反应8～12h后，分离、洗涤、干燥，获得功能化纳米磁珠。
上述制备方法对Fe3O4@SiO2纳米颗粒硅烷改性后生成改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒，再对改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒修饰上吡咯烷酮和苯基结构，利用吡咯烷酮和苯基结构的协同作用，可以选择性吸附样本中衍生化的硝基呋喃类代谢物(2-NBA-AOZ、2-NBA-AMOZ、2-NBA-SEM、2-NBA-AHD)。并且该功能化纳米磁珠制备简单，价廉易得，重复性高。
在一个具体实施例中，在步骤S1Fe3O4纳米磁性颗粒的制备方法为：将3.28gFeC13·6H2O和1.68g FeSO4·7H2O超声溶于200mL水中，在75℃、氮气保护下搅拌加入20mL质量分数为25％的氨水，反应1.5h后冷却至室温，在外加磁场作用下进行分离，获得固体产物，将所述固体产物依次用无水乙醇和去离子水分别洗涤三次，40℃真空干燥至恒重，获得Fe3O4纳米磁性颗粒。
在一个具体实施例中，在步骤S2中磁性Fe3O4@SiO2纳米颗粒制备方法为：称取1.0gFe3O4，向Fe3O4中依次加入100mL去离子水、800mL无水乙醇和10mL质量分数为25％的氨水，超声混匀后向混合溶液中加入8mL四乙氧基硅烷，在30℃水浴中机械搅拌反应6h。反应完毕后磁性分离获得固体产物，将上述固体产物依次用无水乙醇和去离子水分别洗涤3次，40℃真空干燥至恒重，获得Fe3O4@SiO2纳米颗粒。
在一个具体实施例中，在步骤S3中磁性Fe3O4@SiO2纳米颗粒的改性方法为：称取0.4g Fe3O4@SiO2纳米颗粒并将Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于80mL的无水乙醇中，加入4mLγ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，超声15min使其分散均匀，在60℃、氮气保护下振荡反应12h后磁性分离，并依次用无水乙醇和去离子水分别洗涤3次，40℃真空干燥至恒重，获得改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒。
在一个具体实施例中，在步骤S4中功能化纳米磁珠制备方法为：将0.2mg改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于惰性有机溶剂中，加入0.5g N-乙烯基吡咯烷酮、0.3mg二乙烯基苯、0.1g偶氮二异丁腈，超声混匀后在65℃恒温水浴条件下振荡反应10h后冷却。反应完全后冷却至室温，将产物磁性分离，并依次用乙醇和去离子水分别洗涤3次，40℃真空干燥至恒重，获得功能化纳米磁珠。
其中，惰性有机溶剂为乙腈、乙醚、甲醚、甲苯、丙酮、异丙醇、乙醇、甲醇、苯、四氢呋喃、二甲基甲酰胺和二氧六环；优选为乙腈、甲苯、异丙醇和乙醇，更优选为乙腈。
功能化纳米磁珠的回收率和精密度试验
在鱼肉样品中，分别按1.0μg/kg、2.0μg/kg、5.0μg/kg添加4种硝基呋喃类代谢物标准溶液进行回收试验，每个添加水平取5个平行样本，计算各添加水平的回收率和精密度。4种硝基呋喃类代谢物(呋喃唑酮代谢物AOZ、呋喃他酮代谢物AMOZ、呋喃西林代谢物SEM、呋喃妥因代谢物AHD)的总体回收率在88.31～94.08％之间，相对标准偏差(RSD)≤4.89％，说明制备的功能化纳米磁珠对硝基呋喃类代谢物的回收率高，精密度好。
表1硝基呋喃类代谢物添标回收率及相对标准偏差(n＝5)
实施例1：称取5.0g±0.05g搅碎的鱼肉于离心管中，加入5mL 0.1mol/L盐酸和0.6mL 2％的2-硝基苯甲醛，超声混匀后，置于350W微波条件下反应3min；加入400μL 50mg/mL分散于去离子水的功能化纳米磁珠悬浮液，超声混匀后静置5min，再进行磁分离。用200μL磷酸缓冲液(PB溶液)洗脱2次，收集待测液。
实施例2：称取5.0g±0.05g搅碎的鱼肉于离心管中，加入5mL 0.1mol/L盐酸和0.6mL 2％的2-硝基苯甲醛，超声混匀后，置于160W微波条件下反应5min；加入400μL 50mg/mL分散于去离子水的功能化纳米磁珠悬浮液，超声混匀后静置5min，再进行磁分离。用200μL磷酸缓冲液(PB溶液)洗脱2次，收集待测液。
实施例3：称取5.0g±0.05g搅碎的鱼肉于离心管中，加入5mL 0.1mol/L盐酸和0.6mL 2％的2-硝基苯甲醛，超声混匀后，置于500W微波条件下反应1.5min；加入400μL50mg/mL分散于去离子水的功能化纳米磁珠悬浮液，超声混匀后静置5min，再进行磁分离。用200μL磷酸缓冲液(PB溶液)洗脱2次，收集待测液。
对比例：称取5g±0.05g均质组织样品于50mL离心管中，依次加入4mL去离子水、5ML 1mol/L盐酸和0.2mL 10mmol/L邻硝基苯甲醛溶液，充分振荡3min；将上述离心管在60℃水浴下孵育60min；再依次加入5mL 0.1mol/L磷酸氢二钾溶液、0.4mL 1mol/L氢氧化钠溶液、6mL乙酸乙酯充分混合3min，在室温(20-25℃)下4000r/min离心5min；移取离心后的上层液体3mL于15mL离心管中，加入10mL 10％乙酸乙酯-乙醇溶液，上下颠倒混合4-5次，4000r/min离心1min(底部会有部分沉淀)。连接好固相萃取装置，并在固相萃取柱上方连接30mL注射器针筒，将上述上清液全部倒入30mL针筒中，用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使注射器中的液体全部流过固相萃取柱，再重复推压注射器活塞2次，以尽可能将固相萃取柱中的溶液去除干净。将固相萃取柱下方的接液管更换为洁净的离心管，再向固相萃取柱中加1mL 10mmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液。用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使固相萃取柱中的液体全部流至离心管中后，离心管中的液体即为待测液。
免疫胶体金快速检测试剂板检测
本发明还提供一种硝基呋喃类代谢物的检测方法，将以上任意实施例所述的前处理方法获得的待测液滴加到免疫胶体金检测板上，3～5min读取结果。具体地，水平放置四合一免疫胶体金检测板，用滴管分别吸取待检样品处理溶液100μL，滴加到加样孔中，加样后开始计时，结果应在3～5min读取，其他时间判读无效。其中，实施例1、实施例2、实施例3的整个检测过程不到20min，而对比例需要80min左右。
本发明的样品衍生化反应采用低功率微波处理，反应时间短，衍生效率高。微波辐射下，反应可以在短时间内迅速完成，且该前处理方法可有效缩短检测时间，整个检测过程不到20min；且不存在常规加热方式中易出现的局部过热现象。硝基呋喃类代谢物的净化富集过程采用功能化纳米磁珠富集，功能化纳米磁珠具有较高的特异性识别能力，吸附能力强，且可通过外加磁场快速方便的从复杂基质中分离出来，不需要额外的离心或过滤过程，操作简便。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种硝基呋喃类代谢物的前处理方法，其特征在于，将样品搅碎后加入盐酸和2-硝基苯甲醛，超声混合均匀后，在160～500W微波条件下反应1.5～5min；再加入功能化纳米磁珠的悬浮液，超声混匀后静置、分离，获得待测液。
2.如权利要求1所述的硝基呋喃类代谢物的前处理方法，其特征在于，将样品搅碎后加入盐酸和2-硝基苯甲醛，超声混合均匀后，在160W微波条件下反应5min；再加入功能化纳米磁珠的悬浮液，超声混匀后静置、分离，获得待测液。
3.如权利要求1所述的硝基呋喃类代谢物的前处理方法，其特征在于，将样品搅碎后加入盐酸和2-硝基苯甲醛，超声混合均匀后，在350W微波条件下反应3min；再加入功能化纳米磁珠的悬浮液，超声混匀后静置、分离，获得待测液。
4.如权利要求1所述的硝基呋喃类代谢物的前处理方法，其特征在于，将样品搅碎后加入盐酸和2-硝基苯甲醛，超声混合均匀后，在500W微波条件下反应1.5min；再加入功能化纳米磁珠的悬浮液，超声混匀后静置、分离，获得待测液。
5.如权利要求1～4中任一项所述的硝基呋喃类代谢物的前处理方法，其特征在于，所述功能化纳米磁珠的制备方法包括以下步骤：
步骤S1：在60～80℃、惰性气体条件下向FeCl3和FeSO4的水溶液中加入氨水调整至pH值为9～11，反应1～2h后，分离、洗涤、干燥，获得Fe3O4，其中，Fe3+、Fe2+的摩尔比为2:(1～1.5)；
步骤S2：将Fe3O4溶于无水乙醇、氨水的混合溶液中，混合均匀后，加入四乙氧基硅烷，反应5～7h后磁性分离，并洗涤、干燥，获得Fe3O4@SiO2纳米颗粒；
步骤S3：将Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于无水乙醇中，加入γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷并分散均匀，在50～70℃条件下反应10～13h，分离、洗涤、干燥后获得改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒；
步骤S4：将所述改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于惰性有机溶剂中，加入N-乙烯基吡咯烷酮、二乙烯基苯、偶氮二异丁腈并混合均匀，在55～70℃条件下反应8～12h后，分离、洗涤、干燥，获得功能化纳米磁珠。
6.如权利要求5所述的硝基呋喃类代谢物的前处理方法，其特征在于，在步骤S1中，将3.28g FeC13·6H2O和1.68g FeSO4·7H2O超声溶于200mL水中，在75℃、氮气保护下搅拌加入20mL质量分数为25％的氨水，反应1.5h后冷却，在磁场作用下进行分离后依次用无水乙醇和去离子水洗涤，40℃真空干燥，获得Fe3O4。
7.如权利要求5所述的硝基呋喃类代谢物的前处理方法，其特征在于，在步骤S2中，将1.0g Fe3O4加入100mL去离子水、800mL无水乙醇和10mL质量分数为25％的氨水的混合液中，超声混匀后加入8mL四乙氧基硅烷，30℃搅拌、反应6h后分离，并依次用无水乙醇和去离子水洗涤，40℃真空干燥，获得Fe3O4@SiO2纳米颗粒。
8.如权利要求5所述的硝基呋喃类代谢物的前处理方法，其特征在于，在步骤S3中，将0.4g所述Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于80mL的无水乙醇中，加入4mLγ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，超声15min分散均匀，在60℃、氮气保护下振荡反应12h后磁性分离，并依次用无水乙醇和去离子水洗涤，40℃真空干燥，获得改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒。
9.如权利要求5所述的硝基呋喃类代谢物的前处理方法，其特征在于，在步骤S4中，将0.2mg所述改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于惰性有机溶剂中，加入0.5g N-乙烯基吡咯烷酮、0.3mg二乙烯基苯、0.1g偶氮二异丁腈，超声混匀后在65℃条件下振荡反应10h后冷却、磁性分离，并依次用乙醇和去离子水洗涤，40℃真空干燥，获得功能化纳米磁珠。
10.一种硝基呋喃类代谢物的检测方法，其特征在于，将权利要求1～9中任一项所述的前处理方法获得的待测液滴加到免疫胶体金检测板上，3～5min读取结果。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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