CN107290469B - 虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法，包括如下步骤：1)、虾夷扇贝样品前处理，得样品液；2)、HLB/PDMS涂层搅拌棒的制备；3)、搅拌棒吸附萃取：先将HLB/PDMS涂层搅拌棒在甲醇中浸泡，然后置入5～10mL的样品液中，加酸调整pH值为3～7后进行富集；然后取出HLB/PDMS涂层搅拌棒放入乙腈中进行MCs解吸附，所得到的解吸附溶液用于液相色谱‑质谱分析；从而获得解吸附溶液中7种微囊藻毒素的浓度，最终获得虾夷扇贝样品7种微囊藻毒素的浓度。

Description

虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法

技术领域

本发明涉及一种虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法，属于生化分离技术领域，更具体涉及一种利用搅拌棒吸附分离虾夷扇贝中7种微囊藻毒素并利用超高效液相色谱-质谱分析对其定性、定量分析的方法。

背景技术

微囊藻毒素(Microcystins)为蓝藻水华释放的一类具有强烈致癌作用的肝毒素，其毒性较大，分布广泛，目前已发现异构体多约80余种，其结构由7个氨基酸组成，主要产自微囊藻(Microcystis aeruginosa)、鱼腥藻(Anabaena)、念珠藻(Nostocales)等浮游性蓝藻，其中MC-LR最为常见。调查表明，我国60％的水体由于过多接纳了氮和磷等营养物质而出现了蓝藻水华现象，该现象使水面湖靛堆积，大量消耗水中溶解氧致鱼类窒息死亡，藻体死亡分解过程中释放生物毒素类次级代谢产物，导致水体污染，水生动植物死亡。此外，已有研究证明，MCs进入人体肝细胞后，能强烈地抑制蛋白磷酸酶(PP1、PP2A)的活性，诱发细胞角蛋白高度磷酸化，导致肝细胞微丝分解、破裂和出血。因此，MCs通过食物链传递到水生动物中，并在水生动物体中积累富集而导致的人体健康潜在风险已经引起了国内外学者的普遍关注。因此建立一种淡水鱼肉中高效、准确、灵敏的MCs分析检测方法，对于水产品的质量安全与相关风险监测工作具有着重要意义。

目前，对于各种生物体中MCs的检测方法主要有酶联免疫(ELISA)法、聚合酶链式反应(PCR)、液相色谱(LC)法、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法等，其中LC-MS/MS方法通量较大，定性能力强，更适用于复杂基质中MCs的残留检测。

搅拌棒吸附萃取(SBSE)是一种新型的固相微萃取样品前处理技术，具有固定相体积大、萃取容量高、无需外加搅拌子、可避免竞争性吸附、能在自身搅拌的同时实现萃取富集等优点。目前广泛采用的涂层为非极性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)，这种涂层结构致密，且高度疏水、化学性质稳定，适用于水相中非极性和弱极性化合物的萃取。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高的虾夷扇贝中微囊藻毒素的检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法，包括如下步骤：

1)、虾夷扇贝样品前处理：

①、取1g待测虾夷扇贝肉进行匀浆；

②、在浆液中加入10～20mL甲醇后于80±5℃超声提取20～30min；

③、将超声提取所得物离心(冷冻离心机离心，即，控制温度为3～5℃)，取出上层清液；

④、以离心所得的沉淀替代步骤②中的浆液重复上述步骤②～步骤③的超声提取和离心；

⑤、将所有的上层清液合并后用氮气吹干，然后用5～10mL水复溶，得样品液；

2)、HLB/PDMS涂层搅拌棒的制备：

①、将搅拌棒清洗后烘干；

②、配制PDMS溶胶：

将100±5μL聚二甲基硅氧烷(PDMS)、100±5μL甲基三甲氧基硅烷(MTMS)、10±1μL聚甲基氢硅氧烷(PMHS)和100±5μL 95％三氟乙酸(TFA)混合，得PDMS溶胶；

95％三氟乙酸为由95％三氟乙酸和5％水混合而得，％为体积％；

③将步骤①所得的烘干搅拌棒浸入步骤②所得的PDMS溶胶(浸入时间约为5～10min)，取出后在搅拌棒的表面裹上HLB微粒(亲水亲油平衡微粒，粒径大小为10μL)，然后于60～80℃干燥(烘箱烘干)24～30h，得HLB/PDMS涂层搅拌棒；

3)、搅拌棒吸附萃取(搅拌棒吸附萃取样品中微囊藻毒素)：

先将HLB/PDMS涂层搅拌棒在甲醇中浸泡20～30min(目的是去除表面的有机杂质，有机杂质指的是合成过程中使用的各种化合物)，然后置入5～10mL步骤1)所得的样品液中，加酸调整pH值为3～7(即，使吸附萃取过程中萃取环境的pH值为3～7)，以600～1000rpm富集60～120min；

然后取出HLB/PDMS涂层搅拌棒放入含有100±20μL乙腈的离心管中超声10～20min，使样品中的MCs(微囊藻毒素)解吸附，所得到的解吸附溶液用于液相色谱-质谱分析；

说明：上述用于调节pH值的酸是浓度为1～5mol/L的盐酸溶液；

4)、液相色谱-质谱条件(利用超高效液相色谱-质谱分析定性、定量分析样品中微囊藻毒素)：

色谱柱：Waters XSelect HSS T3(2.1mm×150mm，3.5μm)，流动相：A为含0.1％甲酸的乙腈溶液，B为含0.1％甲酸的水溶液；

梯度洗脱程序：0～1min，75％B；1～5min，75％～5％B；5～9min，5％B；9～10min，5％～75％B；10～16min，75％B；上述％均为体积％；

柱温40℃，流速0.30mL/min，进样量10μL；

离子源为电喷雾离子源，正源模式，离子源温度500℃，电喷雾电压5.5kV，雾化气(GS1)压力45psi，辅助气(GS2)压力65psi，气帘气(CUR)压力30psi，扫描方式为多反应监测(MRM)模式；7种微囊藻毒素的质谱参数见下表1；

表1、7种微囊藻毒素的质谱参数

注：RR等字母表示微囊藻毒素多肽中两种可变氨基酸；

从而获得步骤3)所得的解吸附溶液中7种微囊藻毒素的浓度，最终经换算获得虾夷扇贝样品7种微囊藻毒素的浓度。

作为本发明的虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法的改进：所述步骤1)中，重复上述步骤②～步骤③的超声提取和离心的次数为1～3次。

作为本发明的虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法的进一步改进：所述步骤1)中，超声为20KHz，130W，50％变幅。

作为本发明的虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法的进一步改进：所述步骤2)的①为将搅拌棒依次浸入水、二氯甲烷、1mol/L NaOH和0.1mol/L HCl中清洗(每次浸入的时间至少为8h)，再用水冲洗，之后放入80～100℃烘箱烘干2～3h。

作为本发明的虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法的进一步改进：所述步骤2)的③中，重复上述浸入PDMS溶胶、取出后在搅拌棒的表面裹上HLB微粒，直至搅拌棒表面被HLB微粒完全包覆。

作为本发明的虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法的进一步改进：步骤3)使用后的HLB/PDMS涂层搅拌棒超声清洗5～10min以便重复利用。

在本发明步骤1)的样品前处理中，利用电动搅拌器均质虾夷扇贝样品组织，用探头式超声(20KHz，130W，50％变幅)提取。

在本发明的步骤3)中，将富集后的搅拌棒取出后，用滤纸擦干表面再将其放入乙腈中超声。

本发明方法微囊藻毒素的提取效率高，有很好的特异性、准确度以及重复性，灵敏度较高，可以对虾夷扇贝样品中的微囊藻毒素进行良好的检测，以确保公共卫生安全。

综上所述，本发明的方法利用搅拌棒吸附分离虾夷扇贝中7种微囊藻毒素并利用超高效液相色谱-质谱分析对其定性、定量分析，能高效、精确地提取被测样品中的微囊藻毒素，有良好的特异性、准确度以及重复性，检测灵敏度较高。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为HLB/PDMS涂层搅拌棒表面形貌；

(A)为放大倍数为18倍的扫描电子显微镜图片；

(B)为放大倍数为100倍的扫描电子显微镜图片；

(C)为放大倍数为500倍的扫描电子显微镜图片；

图2为7种微囊藻毒素的总离子流色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、一种虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法，依次进行以下步骤：

1)、样品前处理：

利用电动搅拌器均质虾夷扇贝样品组织，取1g样品(虾夷扇贝肉)进行匀浆，加入10mL甲醇，加热至80℃，并用探头式超声(20KHz，130W，50％变幅)提取20min。

之后用冷冻离心机离心(4℃、8000rpm离心15min)使固液分离，移出上层清液，并向沉淀中加入10mL甲醇重复上述的超声提取、离心操作2次。将3次提取的上清液合并，用氮气吹干，并用10mL水复溶；得样品液。

2)、搅拌棒制备：

①将搅拌棒依次浸入水、二氯甲烷、1mol/L NaOH和0.1mol/L HCl中清洗(每次浸入的时间至少为8h)，再用水冲洗，之后放入90℃烘箱烘干2h。

所述搅拌棒是商品化的外涂层为聚二甲基硅氧烷(PDMS)并内封一磁芯的玻璃管(10mm×0.5mm)。

②将100μL聚二甲基硅氧烷(PDMS)、100μL甲基三甲氧基硅烷(MTMS)、10μL聚甲基氢硅氧烷(PMHS)和100μL 95％三氟乙酸(TFA)混合，制得PDMS溶胶。

上述95％三氟乙酸(TFA)是指三氟乙酸(TFA)与水按照95：5的体积比进行混合。

③将步骤①所得的搅拌棒浸入步骤②所得的PDMS溶胶中7min，取出后在表面裹上HLB微粒(亲水亲脂平衡聚合物颗粒，粒径大小为30μm)，重复上述浸入、表面包裹步骤直至搅拌棒表面被HLB微粒完全包覆，将其放入65℃烘箱烘干24h。得HLB/PDMS涂层搅拌棒。

HLB微粒，例如可选用Waters OAsis HLB微粒(30μm)。

3)、搅拌棒吸附萃取

使用前，将HLB/PDMS涂层搅拌棒在甲醇中浸泡20min以去除表面的有机杂质。

精确称量5mL步骤1)所得的样品液于eppendorf管中，将上述HLB/PDMS涂层搅拌棒置于样品液中，加酸(浓度为1mol/L的盐酸溶液)调整pH值至5，以700～800rpm富集60～100min。将搅拌棒取出后，用滤纸擦干表面并将其放入含有100μL乙腈的离心管中超声(探头式超声，20KHz，130W，50％变幅)15min，使MCs解吸附，所得到的解吸附溶液可用于液相色谱-质谱分析。

HLB/PDMS涂层搅拌棒需超声清洗(200W，60Hz)5min以便重复利用。

4)、液相色谱-质谱条件

色谱柱：Waters XSelect HSS T3(2.1mm×150mm，3.5μm)，流动相：A为乙腈(含0.1％甲酸)，B为水溶液(含0.1％甲酸)，梯度洗脱程序为：

0～1min	75％B	25％A
			1～5min	75％～5％B	25％～95％A
5～9min	5％B	95％A
			9～10min	5％～75％B	95％～25％A
10～16min	75％B	25％A

柱温40℃，流速0.30mL/min，进样量10μL。

离子源为电喷雾离子源，正源模式，离子源温度500℃，电喷雾电压5.5kV，雾化气(GS1)压力45psi，辅助气(GS2)压力65psi，气帘气(CUR)压力30psi，扫描方式为多反应监测(MRM)模式。7种微囊藻毒素的质谱参数见表2。

表2、7种微囊藻毒素的质谱参数

表3、7种微囊藻毒素的定量曲线方程和定量限

说明：上述标准曲线中，x：质量浓度(μg/L)；y：峰面积。

y为实验所得峰面积，根据上表中的标准曲线可以计算得到吸附溶液中该化合物的浓度x。因为解吸附是在100μL乙腈中，所以换算公式为x(μg/L)*100(μL)/0.5(g)即可得到虾夷扇贝样品中该化合物浓度。

实验一、

步骤1)中，取7种微囊藻毒素原液以各0.1mg加入1mL乙腈中，混合均匀后得到微囊藻毒素标准品混合液，取该混合液10μL加入1g待测虾夷扇贝肉匀浆；

注：上述待测虾夷扇贝肉是事先已确定的不含7种微囊藻毒素的样品；

步骤3)中，以800rpm富集100min。

其余等同于实施例1。

结果如表4：

表4、7种微囊藻毒素的加标回收率及精密度(n＝6)

对比例1-1、将实验一步骤1)中的提取20min改成重复提取10min；其余等同于实验一。

对比例1-2、将实验一步骤1)中的重复提取2次改成重复提取0次；其余等同于实验一。

对比例2、将实验一步骤2)中的将搅拌棒浸入PDMS溶胶中7min改成浸入3min；其余等同于实验一。

对比例3-1、将实验一步骤3)中的提取环境pH值5改成7；其余等同于实验一。

对比例3-2、将实验一步骤3)中的富集提取100min改成富集提取30min；其余等同于实验一。

对比例4-1、将实验一步骤4)中的特征子离子m/z 135.0改为m/z 134.0；其余等同于实验一。

对比例4-2、将实验一步骤4)中的特征子离子m/z 135.0改为m/z 136.0；其余等同于实验一。

对比例4-3、将实验一步骤4)中MC-RR的去簇电压72eV改为40eV，MC-YR的去簇电压66eV改为35eV，MC-LR的去簇电压42eV改为25eV，MC-LA、MC-LF、MC-LW的去簇电压37eV改为20eV，MC-LY的去簇电压32eV改为20eV；其余等同于实验一。

对比例4-4、将实验一步骤4)中MC-RR的去簇电压72eV改为90eV，MC-YR的去簇电压66eV改为85eV，MC-LR的去簇电压42eV改为60eV，MC-LA、MC-LF、MC-LW的去簇电压37eV改为55eV，MC-LY的去簇电压32eV改为50eV；其余等同于实验一。

对比例4-5、将实验一步骤4)中MC-RR的碰撞电压50eV改为25eV，MC-YR、MC-LW、MC-LY的碰撞电压25eV改为15eV，MC-LR、MC-LA、MC-LF的碰撞电压20eV改为10eV；其余等同于实验一。

对比例4-6、将实验一步骤4)中MC-RR的碰撞电压50eV改为60eV，MC-YR、MC-LW、MC-LY的碰撞电压25eV改为30eV，MC-LR、MC-LA、MC-LF的碰撞电压20eV改为25eV；其余等同于实验一。

采用上述对比例所述方法所测得的各微囊藻毒素的回收率如表5所述。

表5、各方法所述各微囊藻毒素回收率(％)

综上可见，本发明的虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法对于微囊藻毒素的提取效率高，有很好的特异性、准确度以及重复性，灵敏度较高，可以对虾夷扇贝样品中的微囊藻毒素进行良好的检测，以确保公共卫生安全。此外，本发明提出的HLB/PDMS涂层搅拌棒吸附萃取及超高效液相色谱-质谱联用方法具有很大的潜力，为相关分析检测提供了新的思路。

实验二、将如下表6所述的5种虾夷扇贝按照实施例1所述方法进行检测，所得结果如下表6所示。

表6、本发明方法对每种虾夷扇贝中各微囊藻毒素含量的检测结果(μg/kg)

验证实验、将实验二中的5种虾夷扇贝按照本行业所公认的精度最高的国标法进行检查，所得结果如表7所示。

表7、国标法对每种虾夷扇贝中各微囊藻毒素含量的检测结果(μg/kg)

实验三、关于特异性：

步骤1)中，取实验二中的虾夷扇贝B组样品，取7种微囊藻毒素原液与节球藻毒素原液以各0.1mg加入1mL乙腈中，混合均匀后得到8种毒素标准品混合液，取该混合液10μL加入上述样品匀浆，

步骤3)中，步骤3)中，以800rpm富集100min。

其余等同于实施例1。所得结果见表8。

表8、加入节球藻毒素后对于检测微囊藻毒素含量的影响(μg/kg)

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法，其特征是包括如下步骤：

1)、虾夷扇贝样品前处理：

①、取1g待测虾夷扇贝肉进行匀浆；

②、在浆液中加入10～20mL甲醇后于80±5℃超声提取20～30min；

③、将超声提取所得物离心，取出上层清液；

④、以离心所得的沉淀替代步骤②中的浆液重复上述步骤②～步骤③的超声提取和离心；

⑤、将所有的上层清液合并后用氮气吹干，然后用5～10mL水复溶，得样品液；

2)、HLB/PDMS涂层搅拌棒的制备：

①、将搅拌棒清洗后烘干；

②、配制PDMS溶胶：

将100±5μL聚二甲基硅氧烷、100±5μL甲基三甲氧基硅烷、10±1μL聚甲基氢硅氧烷和100±5μL 95％三氟乙酸混合，得PDMS溶胶；

95％三氟乙酸为由95％三氟乙酸和5％水混合而得，％为体积％；

③将步骤①所得的烘干搅拌棒浸入步骤②所得的PDMS溶胶，取出后在搅拌棒的表面裹上HLB微粒，然后于60～80℃干燥24～30h，得HLB/PDMS涂层搅拌棒；

3)、搅拌棒吸附萃取：

先将HLB/PDMS涂层搅拌棒在甲醇中浸泡20～30min，然后置入5～10mL的步骤1)所得的样品液中，加酸调整pH值为3～7，以600～1000rpm富集60～120min；

然后取出HLB/PDMS涂层搅拌棒放入含有100±20μL乙腈的离心管中超声10～20min，使样品中的MCs解吸附，所得到的解吸附溶液用于液相色谱-质谱分析；

4)、液相色谱-质谱条件：

色谱柱：2.1mm×150mm、3.5μm的Waters XSelect HSS T3，流动相：A为含0.1％甲酸的乙腈溶液，B为含0.1％甲酸的水溶液；

梯度洗脱程序：0～1min，75％B；1～5min，75％～5％B；5～9min，5％B；9～10min，5％～75％B；10～16min，75％B；上述％均为体积％；

柱温40℃，流速0.30mL/min，进样量10μL；

离子源为电喷雾离子源，正源模式，离子源温度500℃，电喷雾电压5.5kV，雾化气(GS1)压力45psi，辅助气(GS2)压力65psi，气帘气(CUR)压力30psi，扫描方式为多反应监测(MRM)模式；7种微囊藻毒素的质谱参数见下表；

7种微囊藻毒素的质谱参数

从而获得步骤3)所得的解吸附溶液中7种微囊藻毒素的浓度，最终获得虾夷扇贝样品7种微囊藻毒素的浓度。

2.根据权利要求1所述的虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法，其特征在于：

所述步骤1)中，重复上述步骤②～步骤③的超声提取和离心的次数为1～3次。

3.根据权利要求1或2所述的虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法，其特征在于：

所述步骤1)中，超声为20KHz，130W，50％变幅。

4.根据权利要求1所述的虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法，其特征在于：

所述步骤2)的①为将搅拌棒依次浸入水、二氯甲烷、1mol/L NaOH和0.1mol/L HCl中清洗，再用水冲洗，之后放入80～100℃烘箱烘干2～3h。

5.根据权利要求1所述的虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法，其特征在于：

所述步骤2)的③中，重复上述浸入PDMS溶胶、取出后在搅拌棒的表面裹上HLB微粒，直至搅拌棒表面被HLB微粒完全包覆。

6.根据权利要求1所述的虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法，其特征在于：

步骤3)使用后的HLB/PDMS涂层搅拌棒超声清洗5～10min以便重复利用。