CN103901140B - 一种用于生物染毒后粪便中四溴双酚a分析的前处理方法 - Google Patents

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一种用于生物暴露染毒后粪便中四溴双酚A分析的前处理方法，涉及生物样品中有机污染物的检测分析技术，可为生物暴露染毒后粪便样品中四溴双酚A含量的测定提供前处理技术。生物暴露染毒后粪便样品冷冻干燥后，加入等体积混合的甲基叔丁基醚与正己烷溶剂，经超声波清洗仪超声提取三次，取一定量提取液稀释后经Li-SI固相萃取小柱富集净化。处理后样品经超高效液相色谱-串联质谱仪测定，表明方法具有净化效果好，操作简单，回收率较高的优点，通过稀释的方法降低基质干扰，使得该前处理方法特别适用于生物暴露染毒粪便样品中四溴双酚A含量的测定的前处理过程。

Description

一种用于生物染毒后粪便中四溴双酚A分析的前处理方法
技术领域
本发明涉及生物样品中有机污染物的检测分析技术，特别是涉及分析一种生物暴露染毒后所得粪便样品中四溴双酚A含量的样品提取、净化方法。
背景技术
近年来，四溴双酚A作为使用量巨大的溴系阻燃剂之一被广泛应用于家用电器和日常用品中，如计算机、打印机、手机、电视机、洗衣机等电子产品以及纺织品、泡沫家具、建筑材料等。根据欧洲溴科学和环境论坛(BrominatedScience and Environmental Forum，BSEF)报告，除约旦、以色列、美国、日本等，我国也是四溴双酚A主要生产国。由于相关产品生产规模的不断增长、含四溴双酚A电子废弃物的不断增加，以及可释放到环境中四溴双酚A数量的增加，使得人们开始关注四溴双酚A潜在的环境污染问题和对人体健康的影响。
调查显示，由于四溴双酚A使用广泛，世界上很多国家和地区的土壤、沉积物、水体和大气等多种环境介质以及生物样品中均检测到四溴双酚A的赋存，且含量较高。由于频繁在环境介质及生物介质中检测出四溴双酚A，使得公众对四溴双酚A的生物毒性倍加关注。目前研究发现四溴双酚A及其代谢产物在生物体反复暴露的情况下具有潜在的生物蓄积性，及细胞、免疫和内分泌干扰等生物毒性。近年来，四溴双酚A被认为是一种值得探讨和关注的潜在内分泌干扰物，也有研究认为四溴双酚A具有潜在环境持久性和生物累积性，可能引起持久性有机污染问题。欧洲保护东北大西洋海洋环境公约组织(OSPAR)自2001年将四溴双酚A纳入优化控制污染物后至今未将其取消，其报告中认为四溴双酚A具有持久性污染问题。基于此，通过动物实验模拟四溴双酚A进入生物体后在粪便中的分布规律对四溴双酚A的影响研究具有重要作用。
粪便样品作为非创伤性获取的生物介质，可准确反应生物体经四溴双酚A暴露后的内暴露剂量，可通过监测生物粪便中四溴双酚A含量评价污染物的健康损害。粪便样品基质复杂，不适宜的前处理技术影响检测结果，同时生物经暴露染毒后会获得大量样品，便捷的前处理技术可大大缩短检测时间。因此前处理技术是分析样品中四溴双酚A含量技术的关键。
发明内容
本发明的目的是针对生物暴露染毒后粪便样品的前处理问题，提供一种回收率高、除杂效果好、准确迅速的净化技术，实现对生物暴露染毒后粪便样品中四溴双酚A定量分析的技术。本发明与现有技术的区别在于，利用超声清洗仪采用超声的方式提取粪便样品中四溴双酚A，并用稀释与固相萃取小柱联合的方式避免基质杂质的干扰，保证了提取效率并避免复杂的净化步骤损失样品中四溴双酚A含量。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述。
一种适用于分析生物暴露染毒后粪便样品中四溴双酚A的前处理方法(图1)，包括以下步骤：
(1)采集生物暴露染毒的粪便样品，用镊子挑出杂质，经冷冻干燥后研磨粉碎；
(2)准确称取干燥后粪便样品；
(3)加入等体积混合的甲基叔丁基醚与正己烷试剂，超声提取；
(4)置离心机内低速离心5分钟，移出上层提取液；
(5)重复步骤(3)-(4)两次；
(6)合并三次提取液，经无水硫酸钠干燥，定容至一定体积，并充分混合均匀；
(7)取10～20μL混合均匀的提取液，加入C13标记的四溴双酚A以及正己烷，混合均匀后经活化好的Li-SI小柱富集，甲醇洗脱后定容到一定体积，用0.2μm过滤器过滤，过滤后至超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测四溴双酚A浓度。
该方法所述暴露染毒方式包括经口灌胃暴露、腹腔注射暴露、皮肤暴露、经呼吸暴露。
本方法中提取方式为超声波清洗仪超声提取，时间为提取30分钟，并重复三次；净化方式为稀释与固相萃取小柱结合的方式，这与四溴双酚A在生物体中以粪便代谢为主有关。
本发明的优点和积极效果是：生物暴露染毒四溴双酚A后，主要通过粪便代谢出体外，粪便中四溴双酚A浓度很高，同时粪便基质复杂，净化要求较高，因此快速方便的对生物暴露染毒后粪便样品进行前处理非常重要。本发明中样品经甲基叔丁基醚与正己烷混合试剂超声提取，取一定量提取液稀释后经Li-SI小柱富集净化。采用超高效液相色谱-串联质谱仪测定，检出限为0.02ng/g干重。通过稀释与固相萃取小柱结合的净化方式降低基质干扰，使得该前处理方法具有净化效果好，操作简单，回收率较高的优点，特别适用于生物暴露染毒粪便样品中四溴双酚A含量的测定的前处理过程。
本前处理方法的加标回收率如表1所示。
表1本前处理方法的加标回收率
附图说明
图1为分析方法流程图；
图2为标准曲线图；
图3为粪便样品不同提取溶剂的回收率比较图；
图4为粪便样品不同超声提取时间的回收率比较图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
(1)粪便的提取与净化
采集生物暴露染毒的粪便样品后，用镊子挑出杂质，冷冻干燥研磨粉碎。准确称取干燥后粪便样品，加入15mL等体积混合的甲基叔丁基醚与正己烷试剂，经超声清洗仪超声提取30分钟，之后置离心机内以3000转每分钟的速度离心5分钟，移出上层提取液，重复三次；合并三次提取液，经无水硫酸钠干燥，定容到50mL；于充分混匀的提取液中移取20μL，加入10ng C13标记的四溴双酚A以及2mL正己烷，混合均匀后用活化好的Li-SI小柱富集，1.4mL甲醇洗脱，定容到1.5mL，用0.2μm PTFE过滤器(美国Pull公司)过滤，过滤后至超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测四溴双酚A浓度。
(2)利用超高效液相色谱-串联质谱分析四溴双酚A浓度
仪器型号：超高效液相色谱-串联质谱联用仪ACQUITY UPLC-MS/MS(美国Waters公司)，包括四元梯度液相色谱泵，高压二元梯度泵，以及Masslynx4.1工作站。
色谱条件：采用美国Waters公司生产的ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(1.7甲，500mm×2.1mm I.D)；柱温40℃；流速0.30mL/min；进样量10μL；流动相A为超纯水，流动相B为甲醇；采用梯度洗脱，初始浓度为70％B，0～0.5min为70％B线性升高到100％B，0.5～2min为100％B，2min为瞬间降至70％B，2～3min为70％B，总体运行时间共计3min。
质谱条件：采用电喷雾负离子检测模式(ESI-)；毛细管电压为3.5kV；离子源温度为120℃；脱溶剂气为氮气(N2)；锥孔反吹气流速为50L/h；脱溶剂气温度为350℃；脱溶剂气流速为800L/h；碰撞室压力为3.8×10-3mbar；质量分析器低端分辨率LM1为13.0，LM2为13.0；高端分辨率HM1为13.0V，HM2为13.0V；离子能量1为1.0，2为4.0；采用MRM多通道检测。
(3)标准曲线的绘制
取混合均匀的空白粪便样品，按照步骤(1)中所述粪便样品的前处理方法分别对样品进行处理。待处理结束后，用获得的空白粪便样品配置系列浓度的四溴双酚A与C13标记的四溴双酚A标准曲线。以四溴双酚A对C13标记的四溴双酚A的峰面积比与浓度值做定量标准曲线(图2)，用以计算样品中分析物的量。
(4)样品浓度及回收率的测定
粪便样品采集于实验用品系为Wistar的大鼠。将18只大鼠于实验动物房内适应性饲养一周，观察无异常后随机分为3组，分别为对照组、低剂量组、高剂量组。对照区大鼠不做处理，低剂量组大鼠于上午8时经口灌胃给予10mg/kg剂量的四溴双酚A的羧甲基纤维素钠悬浊液，高剂量组大鼠于上午8时经口灌胃给予30mg/kg剂量的四溴双酚A的羧甲基纤维素钠悬浊液，之后将大鼠放代谢笼单笼饲养，于次日收集24小时粪便样品，置于保温箱内迅速带回实验室，于-80℃低温冰箱内贮藏。按照步骤(1)用镊子挑出样品中杂质，经冷冻干燥后研磨粉碎，准确称取干燥后粪便样品，加入15mL等体积混合的甲基叔丁基醚与正己炕试剂超声提驭，置离心机内以3000转每分钟的速度离心5分钟，移出上层提取液，提取重复三次；合并后的提取液过无水硫酸钠干燥，定容到50mL充分混合均匀；取20μL充分混合的提取液加入2mL正己烷，经Li-SI小柱富集净化，用1.4mL甲醇洗脱后氮吹定容到1mL；用0.2μm过滤器过滤，过滤后至超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测四溴双酚A浓度。与步骤(3)中标准曲线对照，以样品检测得到的四溴双酚A对C13标记的四溴双酚A的峰面积比代入步骤(3)中的标准曲线公式，求得的浓度即为样品中四溴双酚A的浓度。
根据样品中C13标记的四溴双酚A的峰面积与相同浓度标准曲线中C13标记的四溴双酚A的峰面积做对比，计算回收率。方法回收率按照下式进行计算：
R＝(A/A0)×100％
R-回收率，％；
A-测定样品中C13标记的四溴双酚A的峰面积；
A0-标准曲线中相同浓度下C13标记的四溴双酚A峰面积。
利用本发明检测经口暴露不同剂量四溴双酚A大鼠粪便中四溴双酚A浓度，结果如表2所示。
表2实际粪便样品中四溴双酚A浓度
剂量组 样品量n 四溴双酚A浓度(μg/g)
对照区 6 0.00±0.00
低剂量组 6 34.52±11.51
高剂量组 6 431.22±412.91

Claims (1)

1.一种用于生物染毒后粪便中四溴双酚A分析的前处理方法，其特征在于：该方法包括如下步骤，
(1)采集生物暴露染毒的粪便样品，用镊子挑出杂质，经冷冻干燥后研磨粉碎；
(2)准确称取干燥后粪便样品；
(3)加入等体积混合的甲基叔丁基醚与正己烷试剂，超声提取；
(4)置离心机内低速离心5分钟，移出上层提取液；
(5)重复步骤(3)-(4)两次；
(6)合并三次提取液，经无水硫酸钠干燥，定容至一定体积，并充分混合均匀；
(7)取20μL混合均匀的提取液，加入10ng C13标记的四溴双酚A以及2mL正己烷，混合均匀后经活化好的LC-Si小柱富集，甲醇洗脱后定容到一定体积，用0.2μm过滤器过滤，过滤后至超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测四溴双酚A浓度，
该方法所述暴露染毒生物包括实验动物中的大鼠、小鼠、豚鼠或兔子；该方法所述暴露染毒方式包括经口灌胃暴露、腹腔注射暴露、皮肤暴露或经呼吸暴露，
所述的超声提取为超声波清洗仪超声提取，时间为提取30分钟。
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