CN109655449B - 利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法，包括步骤A的样品处理、步骤C的微囊藻毒素提取、步骤D的仪器分析、步骤E的计算；在步骤A和步骤C之间设置步骤B的激光解吸附微囊藻毒素：取步骤A所得的2g组织匀浆液A1放置于具塞试管中，再加入3±0.5mL溶剂I，混合后进行磁力搅拌；启动激光器，对具塞试管中混合液进行激光处理，得到样品B1；将所得的样品B1进行步骤C。本发明仅需简单样品前处理、可实现样品中微囊藻毒素的高效提取，可促进食品安全理论与技术研究。

Description

利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法
技术领域
本发明涉及一种激光解吸附组织中微囊藻毒素的方法，特别是一种利用激光解吸附鱼肉肌肉组织中微囊藻毒素，并通过液相色谱串联质谱联用检测的方法。
背景技术
微囊藻毒素(Microcystins)为蓝藻水华释放的一类具有强烈致癌作用的肝毒素，其毒性较大，分布广泛，目前已发现异构体多约80余种，其结构由7个氨基酸组成，主要产自微囊藻(Microcystis aeruginosa)、鱼腥藻(Anabaena)、念珠藻(Notoc)等浮游性蓝藻，化学结构如图1所示，其中MC-LR最为常见。调查表明，我国60％的水体由于过多接纳了氮和磷等营养物质，使水体的生态结构与功能发生了重大变化，导致藻类的异常繁殖生长，从而出现了蓝藻水华现象。水面湖靛堆积，大量消耗水中溶解氧致鱼类窒息死亡，藻体死亡分解过程中释放生物毒素类次级代谢产物，导致水体污染，水生动植物死亡。MC进入人体肝细胞后，能强烈地抑制蛋白磷酸酶(PP1、PP2A)的活性，诱发细胞角蛋白高度磷酸化，导致肝细胞微丝分解、破裂和出血。
MCs常用检测手段主要包括小鼠腹腔注射生物分析法、酶联免疫法、蛋白磷酸酶抑制等方法，但存在操作复杂，且无法实现不同种类MC的分析鉴定等缺点。将MCs氧化生成MMPB(2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸)，甲酯化衍生后用气相色谱质谱(GC-MS)测定MCs总含量。采用固相萃取-液相色谱/紫外检测法(SPE-HPLC/DAD)测定水体、土壤等样品中的MCs。近几年来质谱技术的应用越来越广泛，研究人员对质谱高通量快速检测技术也提出了更高的要求。生物组织样本无法直接用于高灵敏度的质谱检测，通常需要专业人员经组织匀浆、化合物提取、分离纯化等样品前处理步骤后进样检测。近年来发展的液相色谱/串联质谱技术(HPLC-MS/MS)既可以准确定量，又能提供结构信息，被广泛用于危害因子残留的检测分析。
激光(Laser)是一种高质量的光源，具有高亮度、高方向性、高单色性及高相干性等特性，已被广泛应用于工业生产中；但尚未见用于测定鱼肉中微囊藻毒素。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种激光解吸附组织中微囊藻毒素的方法。本发明仅需简单样品前处理、可实现肌肉组织中微囊藻毒素快速从蛋白质上面解吸附下来，适用于肌肉组织样品中微囊藻毒素的前处理和检测分析。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法，包括以下步骤：
A、样品处理：
以鱼肉(鱼的肌肉组织)作为待测样品；
制备组织匀浆液A1：
在鱼肉中加入溶剂I后进行均质分散，得组织匀浆液A1；
所述溶剂I为甲醇/水/三氟乙酸＝80/19.9/0.1(v/v/v)；
鱼肉：溶剂I＝1：1.5～2.5的重量比；
B、激光解吸附微囊藻毒素：
取2g组织匀浆液A1放置于具塞试管(规格为10mL的玻璃具塞试管)中，再加入3±0.5mL溶剂I，混合后进行磁力搅拌；
启动激光器，对具塞试管中混合液进行激光处理，得到样品B1；
C、微囊藻毒素提取：
将样品B1离心，取离心后所得的上清液进行旋转蒸发至体积为0.6～0.9mL，然后用有机溶剂II定容至1mL，得到样品C1；
所述有机溶剂II为乙腈/水＝90/10(v/v)；
D、仪器分析：
采用液相色谱串联质谱联用技术检测样品C1中的微囊藻毒素含量；
使用Waters Atlantis T3色谱柱(2.1mm×150mm；ID，3.5μm)；流动相A为水/甲酸(999/1，v/v)，流动相B为乙腈/甲酸(999/1，v/v)；梯度洗脱条件为：25％B(0～1min)，25-95％B(1～5min)，95％B(5～9min)，and 95-25％B(9～10min)；流速为0.3mL/min；色谱柱温度为40℃；进样量为10μL；
质谱采用正离子下的多反应监测模式，温度为500℃，离子喷雾电压5.5kV，雾化气压35psi；
E、计算
以等重的MC-RR、MC-YR和MC-LR混合后作为微囊藻毒素标准品，取600±60μg的微囊藻毒素标准品替代步骤B中所用的组织匀浆液A1，重复步骤B、C和D，得到微囊藻毒素标准品MC-RR、MC-YR和MC-LR的色谱峰面积ARR、AYR和ALR；从而获得MC-RR、MC-YR和MC-LR的色谱峰面积与浓度的对应关系；
将步骤D所得代入上式对应关系中，最终获得待测样品中的微囊藻毒素含量。
作为本发明的利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法的改进，步骤D中：
微囊藻毒素MC-RR、MC-YR和MC-LR的离子信息为：MC-RR母离子为m/z 520.3，子离子为m/z 135.1和m/z 103.1；MC-YR母离子为m/z 523.8，子离子为m/z 135.1和m/z 103.1；MC-LR母离子为m/z 498.7，子离子为m/z 135.1和m/z 103.1。
作为本发明的利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法的进一步改进，步骤B中的激光处理为：
启动450nm激光器，功率输出8w，调节焦点至具塞试管中混合液的正中心(界面的圆心)，激光持续5±1min，得到样品B1。
作为本发明的利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法的进一步改进，步骤B中：150±30rpm的速度磁力搅拌3～8分钟。
作为本发明的利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法的进一步改进，步骤A中的均质分散为：在鲈鱼肌肉中加入溶剂I后以15000±3000rpm的转速进行均质分散20±5min(利用高速组织捣碎机)；工作模式为每分钟运行40s暂停20s，得组织匀浆液A1。
作为本发明的利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法的进一步改进，步骤C中：
样品B1以9000±1800rpm转速于室温高速离心10±2min；
在转速300±30rpm、温度70±2℃、压力0.1Pa的条件下进行旋转蒸发。
与现有技术比较，本发明采用450nm激光解吸附肌肉组织中的微囊藻毒素，激光能有效作用于组织蛋白和微囊藻毒素间的作用力，从而提高样品中微囊藻毒素测定结果的准确定性。现有技术的直接提取法采用有机溶剂直接提取样品中的微囊藻毒素，提取效果差；现有技术的加热提取法采用高温蛋白变性使微囊藻毒素释放的方法，但是实验结果显示效率不高。本发明仅需简单样品前处理、可实现样品中微囊藻毒素的高效提取，可促进食品安全理论与技术研究。
在本发明中，将不同来源的鲈鱼按照本发明所述方法进行检测，所得结果与GB5009.273-2016检测所得结果基本一致。
本发明旨在开发一种快速高效的激光照射解吸附方法；这种新型、高效、简便、低成本方法尚未见报道。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为激光功率输出对微囊藻毒素回收率的影响；
图2激光照射时间对微囊藻毒素回收率的影响；
图3三种微囊藻毒素的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、一种利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法，依次进行以下步骤：
1、组织样品处理：
将鲜活鲈鱼解剖，去除内脏后冷水(4℃)洗净，取腹部与背部肌肉(肌肉组织)，表面擦拭干至不再滴水；
以上述肌肉组织作为待测样品；
制备组织匀浆液A1：取50g鲈鱼肌肉组织，加入100g溶剂I后使用高速组织捣碎机以15000rpm的转速均质分散20min，工作模式为每分钟运行40s暂停20s，操作结束后，得到组织匀浆液A1；
溶剂I由甲醇/水/三氟乙酸＝80/19.9/0.1(v/v/v)组成。
2、激光解吸附微囊藻毒素：
取2g组织匀浆液A1放置于规格为10mL的玻璃具塞试管中，继续向试管中加入3ml溶剂I，手动震荡3～5次混合均匀，放入1枚磁力搅拌棒(尺寸6mm×1.2mm ID)后垂直放置于磁力搅拌器台面上；打开磁力搅拌器，以150rpm的速度于室温下搅拌5分钟；
启动450nm激光器，功率输出8w，手动调节焦点至具塞试管中样品的正中心(即，界面的圆心)，激光持续5min，得到样品B1。
3、微囊藻毒素提取：
将样品B1以9000rpm转速于室温高速离心10min；离心结束后弃去沉淀，取全部上清液并以转速300rpm、温度70℃、压力0.1Pa的条件旋转蒸发至液体体积为0.8mL，然后用有机溶剂Ⅱ定容至1mL，得到样品C1。
乙腈/水＝90/10，v/v。
4、仪器分析：
采用液相色谱串联质谱联用技术检测样品C1中的微囊藻毒素含量；
使用Waters Atlantis T3色谱柱(2.1mm×150mm；i.d.，3.5μm)；流动相A为水/甲酸(999/1，v/v)，流动相B为乙腈/甲酸(999/1，v/v)；梯度洗脱条件为：25％B(0～1min)，25-95％B(1～5min)，95％B(5～9min)，and 95-25％B(9～10min)；流速为0.3mL/min；色谱柱温度为40℃；进样量为10μL。
注：每个梯度洗脱中，％为体积％，余量为流动相A。
质谱采用正离子下的多反应监测模式，温度为500℃，离子喷雾电压5.5kV，雾化气压35psi；
三种不同结构的微囊藻毒素MC-RR、MC-YR和MC-LR的离子信息为：MC-RR母离子为m/z 520.3，子离子为m/z 135.1和m/z 103.1；MC-YR母离子为m/z 523.8，子离子为m/z135.1和m/z 103.1；MC-LR母离子为m/z 498.7，子离子为m/z 135.1和m/z 103.1。
从而分别得到上述3中微囊藻毒素的色谱峰面积。
5、计算
以600μg微囊藻毒素标准品(MC-RR、MC-YR和MC-LR各200μg)替代步骤B中所用的组织匀浆液A1，重复步骤B、C和D，得到微囊藻毒素标准品MC-RR、MC-YR和MC-LR的色谱峰面积ARR、AYR和ALR；通过换算得到鲈鱼组织样品中的微囊藻毒素含量；
此换算方式，属于常规技术；
以MC-RR为例计算如下：
步骤B中2g组织匀浆液A1中MC-RR的含量
Figure BDA0001910984550000051
Figure BDA0001910984550000052
同理，可获得鲈鱼肌肉组织中MC-YR和MC-LR的含量。
6、结果
激光的输出功率和照射时间对微囊藻毒素的提取效果影响较为显著。实验通过调整激光输出功率1～10W，研究了其对微囊藻毒素回收率的影响，结果如图1所示，随着激光输出功率的提高，三种微囊藻毒素的回收率均有不同程度的提高；当输出功率为8W的时候三种微囊藻毒素的回收率达到最高；当进一步提高输出功率时，三种微囊藻毒素的回收率反而有所降低。因此，激光输出功率8W为最佳条件之一。
通过调整照射时间1～9min，研究了激光照射时间对提取效果的影响。结果如图2所示，三种微囊藻毒素的回收率随着曝光时间从1～5min而提高，当照射时间为5min时微囊藻毒素回收率最高；当进一步延长照射时间时，微囊藻毒素的回收率反而有所降低。因此选择5分钟的照射时间为最佳条件。
实验1、回收率的测定
将事先经GB 5009.273-2016国标法检测确认不含MC-RR、MC-YR和MC-LR的鲈鱼肌肉组织，然后按照每50g鲈鱼肌肉组织加入0.5mgMC-RR、0.5mg MC-YR和0.5mg MC-LR的比例加入上述三种微囊藻毒素；其余按照实施例1所述条件进行激光解吸附组织中微囊藻毒素，实验重复6次，取平均值；所得三种微囊藻毒素的回收率如表1。
表1、激光解吸附法微囊藻毒素MC-RR、MC-YR和MC-LR的回收率
Figure BDA0001910984550000061
对比例1、激光器波长改为488nm，其余内容等同于实施例1。结果见表2。
对比例2、激光器波长改为337nm，其余内容等同于实施例1。结果见表2。
对比例3、激光输出功率改为10W，其余内容等同于实施例1。结果见表2。
对比例4、激光照射时间改为7min，其余内容等同于实施例1。结果见表2。
表2、不同条件下微囊藻毒素回收率的影响
Figure BDA0001910984550000062
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法，包括步骤A的样品处理、步骤C的微囊藻毒素提取、步骤D的仪器分析、步骤E的计算；其特征是：
在步骤A和步骤C之间设置步骤B的激光解吸附微囊藻毒素：
取步骤A所得的2g组织匀浆液A1放置于具塞试管中，再加入3±0.5mL溶剂I，混合后进行磁力搅拌；
启动450nm激光器，对具塞试管中混合液进行激光处理，激光输出功率1～10W，照射时间1～9min，得到样品B1；
将所得的样品B1进行步骤C；
所述溶剂I为甲醇/水/三氟乙酸＝80/19.9/0.1的体积比。
2.根据权利要求1的利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法，其特征是：
A、样品处理：
以鱼肉作为待测样品；
制备组织匀浆液A1：
在鱼肉中加入溶剂I后进行均质分散，得组织匀浆液A1；
所述溶剂I为甲醇/水/三氟乙酸＝80/19.9/0.1的体积比；
鱼肉：溶剂I＝1：1.5～2.5的重量比；
C、微囊藻毒素提取：
将样品B1离心，取离心后所得的上清液进行旋转蒸发至体积为0.6～0.9mL，然后用有机溶剂II定容至1mL，得到样品C1；
所述有机溶剂II为乙腈/水＝90/10的体积比；
D、仪器分析：
采用液相色谱串联质谱联用技术检测样品C1中的微囊藻毒素含量；
使用2.1mm×150mm、ID 3.5μm的Waters Atlantis T3色谱柱；流动相A为水/甲酸＝999/1的体积比，流动相B为乙腈/甲酸＝999/1的体积比；梯度洗脱条件为：
0～1min，25％B；1～5min，25-95％B；5～9min，95％B；and 9～10min，95-25％B；流速为0.3mL/min；色谱柱温度为40℃；进样量为10μL；
质谱采用正离子下的多反应监测模式，温度为500℃，离子喷雾电压5.5kV，雾化气压35psi；
E、计算
以等重的MC-RR、MC-YR和MC-LR混合后作为微囊藻毒素标准品，取600±60μg的微囊藻毒素标准品替代步骤B中所用的组织匀浆液A1，重复步骤B、C和D，得到微囊藻毒素标准品MC-RR、MC-YR和MC-LR的色谱峰面积ARR、AYR和ALR；从而获得MC-RR、MC-YR和MC-LR的色谱峰面积与浓度的对应关系；
将步骤D所得代入上式对应关系中，最终获得待测样品中的微囊藻毒素含量。
3.根据权利要求2的利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法，其特征是步骤D中：
微囊藻毒素MC-RR、MC-YR和MC-LR的离子信息为：MC-RR母离子为m/z 520.3，子离子为m/z 135.1和m/z 103.1；MC-YR母离子为m/z 523.8，子离子为m/z 135.1和m/z 103.1；MC-LR母离子为m/z 498.7，子离子为m/z 135.1和m/z 103.1。
4.根据权利要求2或3的利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法，其特征是步骤B中的激光处理为：
启动450nm激光器，功率输出8w，调节焦点至具塞试管中混合液的正中心，激光持续5±1min，得到样品B1。
5.根据权利要求4的利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法，其特征是步骤B中：150±30rpm的速度磁力搅拌3～8分钟。
6.根据权利要求2或3的利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法，其特征是步骤A中的均质分散为：在鲈鱼肌肉中加入溶剂I后以15000±3000rpm的转速进行均质分散20±5min；工作模式为每分钟运行40s暂停20s，得组织匀浆液A1。
7.根据权利要求2或3的利用激光解吸附测定鱼肉中微囊藻毒素的方法，其特征是步骤C中：
样品B1以9000±1800rpm转速于室温高速离心10±2min；
在转速300±30rpm、温度70±2℃、压力0.1Pa的条件下进行旋转蒸发。
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