CN102393432A - 一种微囊藻毒素的快速提取检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微囊藻毒素的快速提取检测方法，其步骤：A、藻样预处理：天然水体中的水华微囊藻样品，经除杂物，用蒸馏水反复清洗后过滤；B、匀浆处理、干重测定：上述A步骤浓缩后的藻浆，按照体积比加入蒸馏水后，用匀浆器匀浆，另取藻浆测干重；C、甲醇一步法抽提毒素：上述B步骤样品干重测定的结果并计算，取藻干重、体积均为已知的藻浆：充分振荡混合后，冰箱中静置提取；D、离心纯化：将上述C步骤处理后的提取液离心，取上清，得到澄清的藻提取液；E、滤器过滤：合并D步骤上清液过滤；F、HPLC检测：采用优化的色谱条件快速分析毒素。本发明有可靠性高、所需仪器简单、操作方便、检测效率高等优点，适于常规实验室进行大批量的毒素提取和分析工作。
Description
技术领域
本发明涉及水质检测技术领域，更具体涉及一种水体中快速提取检测微囊藻毒素的方法，尤其适合因蓝藻水华污染的水体中浮游藻类的快速取样、提取和检测微囊蓝藻毒素。该发明能广泛应用于水体中的微囊藻毒素的现场快速检测中。
背景技术
蓝藻水华在国内暴发的频率和强度日益加重，随着水环境中微囊藻毒素含量的监测被列为饮用水源的安全标准(WHO 1998)，微囊藻毒素的常规检测日益引起世界各国的重视。因此有必要建立一种能在常规实验室推广应用的高效提取检测微囊藻毒素的技术。
在微囊藻毒素的提取和检测工作中，首先要解决微囊藻毒素的快速高效提取问题。据文献报道，毒素抽提的方法包括真空干燥处理、冻融或烘干、微波或沸水浴加热处理等。这些方法均有各自优缺点：真空干燥效果较好，但设备昂贵难以普及；烘干和加热的方法会导致一些对热敏感的毒素变体降解；而冻融方法存在细胞破碎率低、提取效率较低的缺点。
采用常规的微囊藻毒素提取方法，往往还需要磁力搅拌器搅拌反复抽提，并加上C18ODS固相萃取柱浓缩、旋转蒸发器干燥定容的处理步骤。实验中发现，传统的提取方法，具有提取时间过长、工作量大、样品提取和预处理步骤复杂、被检测样品和使用试剂需要量较大等缺点，特别不适合进行现场实时监测和大量样品的处理和分析。因此有必要在目前相关研究的基础上，建立起一套微囊藻毒素的快速高效提取方法。
发明内容
本发明的目的是提供了一种微囊藻毒素的快速提取检测方法。该方法操作简单，高效快捷，所需仪器非常简单，普通实验室均可以操作；此外大大减轻了工作强度，适用于对大量的样品的批量处理；同时待测藻样需要量少，也减轻了藻样培养、环境样品的采集工作量。本发明能广泛应用于常规实验室进行大批量的毒素提取和分析工作。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种微囊藻毒素的快速提取检测方法，该方案按照以下步骤进行：
A.样品处理：采集野外的水华微囊藻样品，由于天然水体中往往存在大量有机杂物，且藻细胞中通常含有大量的伪空胞而无法用通常采用的离心方法浓缩收获，因此需采用有效的处理方法。本发明提出的样品浓缩纯化处理方法，是在Shen提出的方法(Shen，Fresenius Environmental Bulletin，2005年第14卷，1124-1128页)的基础上，在实验工作中进一步改进而得到的成熟方法。
B.匀浆、干重测定：经步骤A浓缩处理后的样品，通过采用匀浆处理破碎藻细胞团的方法(周湘池，海洋与湖沼，2006年第5期，424-429页)后，使藻浆密度均一化并测定干重。由于天然水体中的水华微囊藻往往以群体形态存在，为达到藻细胞团分散和藻浆密度均匀，以及保证干重称量的准确性及微囊藻毒素提取效率的目的，本处理步骤十分必要。
C.毒素一步法提取：采用50％-90％(V/V)甲醇溶液快速提取微囊藻毒素。微囊藻毒素类似于细胞内毒素，只有在藻细胞裂解破碎后才能被释放出来。因此选择能缩短提取时间、提高提取效率的微囊藻毒素提取方法和提取溶剂十分重要。本发明在当前国内外的相关研究的基础上(M Barco，Journal of Chromatography A，2005年第1074卷，23-30页)，通过大量反复实验，选择合理提取溶剂(50％-90％体积比甲醇)，优化待提取样品和提取溶剂比例(样品藻干重和甲醇提取液重量体积比1/30000-1/5000)、提高提取液的提取效率、优化提取步骤等手段，最后提出该快速提取样品微囊藻毒素的步骤，方法简单可靠。
D.离心、过滤：步骤C提取后的提取液，经HPLC检测前，需再经进一步的离心过滤的纯化处理步骤。提取液经过高速离心后取上清，然后再经0.45μm的微滤器过滤进一步纯化。本次离心过滤步骤可以除去大量的藻细胞碎片，以便于随后的HPLC仪器检测。
E.HPLC检测：选用高效的HPLC快速分析色谱柱，在优化后色谱条件下对样品进行检测分析。在该检测体系下，微囊藻毒素MC-RR、MC-LR的保留时间在3min以内。与传统的HPLC检测方法相比，在保证分离效果的前提下毒素分析时间被大大缩短。
本发明与现有的微囊藻毒素提取检测方法相比，有以下的优点和效果：
1.本提取方法采用的是甲醇一步法提取，与Harada在1988年提出的常规的毒素提取方法(Journal of Chromatography，第448卷，275-283页)相比较，避免了提取液的多次转移而造成的污染、损失等误差，充分保证了测定结果的准确性和可靠性。
2.提取方法涉及的仪器非常简单。所需的主要设备器材仅为测定干重时使用的烘箱，分析天平和甲醇提取时使用的匀浆器、涡旋混合器、冰箱、离心机、移液管等等，在普通实验室均可以操作，也便利于对野外采集的大量样品的现场处理。
3.另外，本提取方法操作简单，大大减轻了工作强度，适用于对大量的样品的批量处理；待测藻样需要量少，也减轻了藻样培养、环境样品的采集工作量。同时在一次提取中使用的有毒溶剂量仅为毫升级，减轻了对操作人员的危害。大大降低了提取的成本。
4.本发明中采用的HPLC检测方法可将毒素的保留时间缩短在3min内，对微囊藻毒素变体的分离效果好。该检测方法值得在微囊藻毒素的检测中广泛应用推广。
附图说明
图1为一种微囊藻毒素的快速提取检测方法的工艺流程图。
其中：藻样预处理1、匀浆处理、干重测定2、甲醇一步法抽提毒素3、离心纯化4、0.45μm微滤器过滤5、HPLC检测6。
具体实施方式
一种微囊藻毒素的快速提取检测方法，具体步骤如下：
A.藻样预处理1：天然水体中的水华微囊藻样品，用孔径30-100μm的浮游生物网采集。经除去树叶、浮萍等有机杂物后，用蒸馏水反复清洗2或3或4次，再用孔径30-100μm的浮游生物网浓缩成黏稠状的藻浆。注意尽量将沥干水分。
B.匀浆处理、干重测定2：上述A步骤浓缩后的藻浆，按照体积比加入2倍体积蒸馏水后，用匀浆器匀浆，使藻细胞团分散和藻浆密度均匀。取藻浆在80℃，24h，烘至恒重后于干燥器中冷却，分析天平上测干重。
C.甲醇一步法抽提毒素3：根据上述B步骤样品干重测定的结果并计算，取藻干重、体积均为已知的藻浆(其中藻干重为1-20mg)，通过补添蒸馏水和纯甲醇配制得到终体积1-2ml甲醇浓度为体积比75％的提取液(样品藻干重和甲醇提取液重量体积比1/30000-1/5000)，转入2ml Corning冻存管中密封；充分振荡混合后，-20℃冰箱中静置提取1或2或3或4次，每次提取时间为2-24h。
D.离心纯化4：将上述C步骤处理后的提取液离心(10000rpm×10min)，取上清，得到澄清的藻提取液。离心得到的沉淀采用C步骤的方法继续提取1或2或3次，离心(10000rpm×10min)取上清液。
E.0.45μm微滤器过滤5：合并D步骤处理得到的上清液，用0.45μm的非水系微滤器过滤处理，取滤液。
F.HPLC检测6：上述E步骤处理后的藻毒素提取液，用HPLC测定毒素浓度。色谱条件：YMC-Pack ODS-AQ色谱柱(4.6mm×50mm i.d.，5μm)；流动相：乙腈(0.1％TFA)-水(0.1％TFA)；流速：2.5ml/min；柱温：40℃；检测波长：238nm；梯度洗脱所用的时间程序为：0.1-6min，乙腈(0.1％TFA)由10％线性递增至90％。
Claims (1)
1.一种微囊藻毒素的快速提取检测方法，其步骤是：
A、藻样预处理（1）：天然水体中的水华微囊藻样品，用孔径30-100 μm的浮游生物网采集，经除去树叶、浮萍有机杂物后，用蒸馏水反复清洗2—4次，再用孔径30-100μm的浮游生物网浓缩成黏稠状的藻浆；
B、匀浆处理、干重测定（2）：上述A步骤浓缩后的藻浆，按照体积比加入2倍体积蒸馏水后，用匀浆器匀浆，使藻细胞团分散和藻浆密度均匀，取藻浆在80℃，24h，烘至恒重后于干燥器中冷却，分析天平上测干重；
C、甲醇一步法抽提毒素（3）：根据上述B步骤样品干重测定的结果并计算，取藻干重、体积均为已知的藻浆：其中藻干重为1-20mg，通过补添蒸馏水和纯甲醇配制得到终体积1-2ml甲醇浓度为体积比75%的提取液：样品藻干重和甲醇提取液重量体积比1/30000－1/5000，转入2ml Corning冻存管中密封；充分振荡混合后，-20℃冰箱中静置提取1—4次，每次提取时间为2-24h；
D、离心纯化（4）：将上述C步骤处理后的提取液离心10000 rpm×10min，取上清，得到澄清的藻提取液，离心得到的沉淀采用C步骤的方法继续提取1—3次，离心10000 rpm×10min取上清液；
E、0.45μm微滤器过滤（5）：合并D步骤处理得到的上清液，用0.45μm的非水系微滤器过滤处理，取滤液；
F、HPLC检测（6）：上述E步骤处理后的藻毒素提取液，用HPLC测定毒素浓度，色谱条件： YMC-Pack ODS-AQ色谱柱4.6 mm ×50 mm i.d., 5μm；流动相：乙腈0.1%TFA，水0.1%TFA；流速：2.5ml/min；柱温：40℃；检测波长：238 nm；梯度洗脱所用的时间程序为：0.1-6 min 。
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