CN113009016A

CN113009016A - 一种固相萃取包及其制备方法和应用

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Publication number: CN113009016A
Application number: CN202110208618.7A
Authority: CN
Inventors: 郭新颖; 史玉坤; 杨清华
Original assignee: Nantong Center For Disease Control And Prevention
Current assignee: Nantong Center For Disease Control And Prevention
Priority date: 2021-02-24
Filing date: 2021-02-24
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2041-02-24
Also published as: CN113009016B

Abstract

本发明提供了一种固相萃取包及其制备方法和应用，涉及化学检测技术领域。本发明固相萃取包由固相萃取剂与盐析萃取包组成，其中固相萃取剂为采用了一步水热法、丙烯酸改性和低温氧化协同聚合反应合成的聚苯胺@碳微球。该固相萃取包能够用于根及根茎、果实种子、花、皮、菌藻五种药用部位的46种中药材中的真菌毒素样品前处理，具有简单快速、高效省力、成本低廉、环境友好等优点。同时，结合同位素内标‑超高效液相色谱串联质谱法(UPLC‑MS/MS)高通量在线检测，可以检测出中药材中常见的16种真菌毒素，精确度好、灵敏度高、检出限低、回收率高，可以很好地用于中药材中真菌毒素检测，具有良好的市场应用前景。

Description

一种固相萃取包及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化学检测技术领域，涉及一种固相萃取包及其制备方法和应用。

背景技术

我国中药材资源丰富，中药文化历史悠久，中药及其制剂广泛用于治疗多种疾病。据世界卫生组织(WHO)统计，目前在全世界大约有40亿人在使用中药材防病治病。但迄今为止，中药材出口贸易尚未占据国际医药市场主导地位，中药材走向国际市场，国际上更多关注的是我国中药材生产工艺、质量标准和安全性能等因素。尤其是近年来，外源性有害物质真菌毒素(Foodborne Mycotoxins，FMs)等影响中药材安全性的这一主要危害因素的存在，造成了国际上对中药材的安全有效、质量可控等环节的质疑。由于真菌毒素是产毒真菌在生长过程中产生的次级代谢产物，广泛存在于各类中药材中，具有致癌、致畸、致突变和肝脏、生殖、造血系统损伤等毒性作用，因此WTO已将真菌毒素中的黄曲霉毒素B₁(AFB₁)定为一类致癌物。我国对中药材的质量检测与控制方法也不断更新，2020年最新修订的《2020版药典通则》建立了以黄曲霉毒素为主的若干种常见真菌毒素的检测方法——超高效液相色谱串联质谱法(UPLC/MS)，并被《中华人民共和国药典》2020年版采纳为最终判定方法。

中药走出国门，质量标准和安全风险必须符合国际规范，但是中药材种类繁多，数量庞大，逐一建立中药材外源性有害物质的检验检测分析方法工作量巨大、成本极高。目前，寻找简单、快速、绿色、高效的前处理方法与高通量、多组分、同时在线快速测定新技术用于系统研究中药真菌毒素分析检测工作迫在眉睫。

在检验检测方法上，简单快速固相萃取前处理——超高效液相色谱质谱分析联用技术凭借其简单快捷、高效准确等独特技术优势，在过去十年间发展迅猛，并在中药检测领域取得巨大研究进展。目前实验室常用的前处理方法为有机溶剂直提法、商品化的SPE固相萃取柱和QuEChERS萃取剂(包)。其中直提法的有机溶剂一般包括甲醇、乙腈、乙醇、乙酸等；固相萃取柱包括HLB柱、专用免疫亲和柱等；萃取剂(包)一般是固定质量配比下的石墨碳黑、PSA、C₁₈、氧化铝Al-N等中的一种或几种，结合氯化钠、硫酸钠或硫酸镁等中的一种或几种。例如，胡佳哲等人以甲醇-甲酸-水为提取液测定了中药材中8种真菌毒素(胡佳哲,吴凤丹,陈俏,赖宇红,陈浩桉.同位素标记-高效液相色谱-串联质谱法测定中药材中8种真菌毒素[J].中国卫生检验杂志,2020,30(5):513-517.)；陈勇等人利用HLB多功能净化柱检测了中药材三七中的10种真菌毒素(陈勇,陈重均,李劲,栾连军,刘雪松,吴永江.超高效液相色谱串联质谱法检测三七药材中10种真菌毒素[J].2015(050),001:81-85.)；梁晟等人利用乙酸钠-硫酸镁分散固相萃取联合专用免疫亲和柱进行苍耳子中展青霉素的含量测定(梁晟,邱婧,李瑞莲,潘震宇.UPLC-MS/MS法检测苍耳子中的展青霉素[J].2018,33(4):393-395.)。

但是中药材本身成分复杂、药用部位不同，前处理如不采取快速有效方式，会造成目标物损失，影响实验结果。采用直提法提取液所产生的基质效应会在一定程度上影响分离峰形和试验准确性，亟需添加基体消除剂改善；商业化的固相萃取柱价格高昂，且检测目标特异性强、目标物相对单一；采用简单固相萃取前处理方法虽然省时省力，但是针对不同基质样品需要考察和优化萃取物质种类和萃取质量比例，亟待开发新型复合材料普适于基层检验检测机构用于真菌毒素的定量检测。基于此，进一步开发具有实际应用潜力的功能性强的萃取剂(包)，使之更加广泛应用到中药材实际样品检测、拓宽商品化途径以及被国家标准采用，成为未来中药材真菌毒素残留快速检测技术的发展趋势。

碳微球是一个良好的介质材料，本身具有良好的表面反应活性、亲水性和吸附性能，也可以通过官能团改性或者表面复合形成特异性强的功能化材料，适用于进一步包覆纳米颗粒材料的聚合反应介质，也可以作为制备多层核壳结构复合材料模板。聚苯胺是一种常见的高分子化合物，易于合成、原料易得、用途广泛。针对复杂吸附环境，聚苯胺耐溶剂性能好、适应能力强，加上改性后的聚苯胺纳米材料表面含有大量的含氧基团，在吸附色素和杂质等方面应用广泛。但现有技术中，目前聚苯胺@碳微球(PANI@CS)复合固体吸附剂用于中药材中真菌毒素的前处理方面的研究未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种固相萃取剂，与一定质量配比的萃取盐析包形成混合固相萃取包，可用于五种药用部位中药材中的真菌毒素样品前处理，具有简单快速、高效省力、成本低廉、环境友好等优点。同时，针对中药材中常见的16种真菌毒素采用同位素内标-超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)高通量在线检测，精确度好、灵敏度高、检出限低、回收率高，可以实际应用于中药材中真菌毒素检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种固相萃取剂，由聚苯胺和碳微球复合而成。

所述固相萃取剂的制备方法包括以下步骤：

(1)采用一步水热法合成碳微球；

(2)将步骤(1)制得的碳微球浸于丙烯酸溶液增加活性位点；

(3)通过低温氧化协同聚合反应在步骤(2)处理过的碳微球表面合成聚苯胺，即得聚苯胺@碳微球。

进一步地，所述制备方法步骤(1)具体为：取碳水化合物溶于水，置于反应釜中控温160-180℃反应4-10h，降温至60-80℃反应3-5h，将所得液体离心、洗涤，循环3次，洗涤剂为水和乙醇，反复洗涤得到粒径大小可控的碳微球；优选地，所述碳水化合物为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、纤维素、糖原中的一种或几种；所述碳水化合物与水的质量体积比为1-2g：8-10mL。

进一步地，所述的制备方法步骤(2)具体为：将步骤(1)所得碳微球置于丙烯酸溶液中，超声分散5-10min，60-80℃水浴加热1-2小时，常温干燥得到改性碳微球；优选地，所述丙烯酸溶液的质量浓度为2％-5％；所述碳微球与丙烯酸溶液的质量体积比为1-2g：10-20mL。

进一步地，所述制备方法步骤(3)具体为：将步骤(2)所得改性碳微球置于高氯酸水溶液中，超声分散均匀，加入苯胺，在冰浴条件下搅拌10-20min，逐滴加入过硫酸铵引发剂，继续冰浴搅拌8-12h，反应完成后，产物依次用无水乙醇和二次去离子水反复离心洗涤，烘干即得聚苯胺@碳微球；优选地，所述高氯酸水溶液的摩尔浓度为0.8-1.5mol/L；所述改性碳微球与高氯酸水溶液的质量体积比为1-2g：10-14mL。

一种固相萃取包，所述的固相萃取剂或所述方法制备得到的固相萃取剂与一定质量配比的萃取盐析包组成。

进一步地，所述萃取盐析包由氯化钠、无水硫酸钠和硫酸铵按质量比1:2-4:2-4混合而成。

所述固相萃取包在中药材真菌毒素分析检测中的应用。

进一步地，所述应用包括以下步骤：

(1)样品前处理：将中药材样品真空干燥后粉碎，粉末过筛，四分法缩分；所得粉末加入萃取剂，涡旋混匀，室温浸泡，振荡提取后恒温超声提取，调节pH；利用萃取盐析包提取上层有机相；将前述有机相加入同位素内标溶液，加入固相萃取剂处理，过有机相滤膜，得待测液；优选地，所述真空干燥温度设置为60-80℃、时间设置为4-6h，筛孔直径为0.2-0.5mm，pH值设定为5.5-6.0；所述样品、萃取盐析包的质量比为1:0.6-1；

(2)利用同位素内标-液相色谱串联质谱法检测步骤(1)所得待测液中的真菌毒素；

优选地，所述中药材按五种药用部位分类为：

根及根茎类(22种)：百合、川贝、天麻、麦冬、白芍、葛根、生半夏、山药、山奈、生建曲、西洋参、党参、黄芪、当归、重楼、甘草、柴胡、制何首乌、制川乌、地黄、赤芍、白术；

果实种子类(17种)：薏苡仁、苦杏仁、山楂、芡实、枸杞子、五倍子、预知子、菟丝子、五味子、牛蒡子、盐补骨脂、苘麻子、桑椹、沙苑子、蛇床子、槐米、枳椇子；

花类(2种)：金银花、红花；

皮类(3种)：杜仲、陈皮、黄柏；

菌藻类(2种)：白本耳、土茯苓。

所述真菌毒素选自玉米赤霉烯酮(ZEN)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON)、赭曲霉毒素A(OTA)、T-2毒素(T-2)、HT-2毒素(HT-2)，伏马毒素B₁(FB₁)、伏马毒素B₂(FB₂)、伏马毒素B₃(FB₃)、黄曲霉毒素B₁(AFTB₁)、黄曲霉毒素B₂(AFTB₂)、黄曲霉毒素G₁(AFTG₁)、黄曲霉毒素G₂(AFTG₂)、杂色曲霉素(ST)中的一种或几种。

进一步地，所述应用步骤(1)中，对于浅色中药材应用时，萃取盐析包中氯化钠、无水硫酸钠和硫酸铵的质量比为1:3-4:2-3，固相萃取剂与上层有机相的质量体积比为0.1-0.2g:2mL；对于深色中药材应用时，萃取盐析包中氯化钠、无水硫酸钠和硫酸铵的质量比为1:2-3:3-4，固相萃取剂与上层有机相的质量体积比为0.2-0.25g:2mL；所述浅色中药材包括百合、川贝、天麻、麦冬、白芍、薏苡仁、苦杏仁、白本耳、葛根、生半夏、山药、山奈、山楂、芡实中的至少一种，深色中药材包括生建曲、西洋参、党参、黄芪、当归、重楼、甘草、柴胡、制何首乌、制川乌、地黄、赤芍、白术、枸杞子、五倍子、预知子、菟丝子、五味子、牛蒡子、盐补骨脂、苘麻子、桑椹、沙苑子、蛇床子、槐米、枳椇子、金银花、红花、杜仲、陈皮、黄柏、土茯苓中的至少一种。

进一步地，所述的应用步骤(1)中使用的固相萃取剂可进行回收利用，其具体操作为：玻璃漏斗中平铺双层有机滤膜，倒入步骤(1)所得沉积物，先后用乙醇、0.1％氨水、二次去离子水洗涤，重复洗涤操作至少三次，抽气机真空抽滤、真空干燥箱干燥，即得可重复使用的固相萃取剂；优选地，有机滤膜孔径为0.10-0.25μm，真空干燥箱设置温度为60-80℃，设置干燥时间为4-8h。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)该固相萃取剂与盐析剂组合成混合固相萃取包，用于五种药用部位中药材中的真菌毒素样品前处理，具有简单快速、高效省力、成本低廉等优点，同时该固相萃取剂经洗涤、干燥等处理可回收利用，重复使用次数达5-10次、萃取效率维持在73％-95％，降低了成本，对环境友好。

(2)针对中药材中常见的16种真菌毒素采用同位素内标-超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)高通量在线检测，精确度好、灵敏度高、检出限低、回收率高，可以很好地应用于中药材中真菌毒素检测。

(3)实现了新型萃取材料样品前处理技术与大型仪器的联用，适用于大批量样品绿色、安全、快速、高效的样品检测，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1、图2分别为碳微球和聚苯胺@碳微球的扫描电镜图。

图3为红外光谱图，曲线(1)和(2)分别代表碳微球和聚苯胺@碳微球的红外光谱。

图4为16种真菌毒素混合标准品及其同位素内标物在EIS-负离子模式下的多反应监测(MRM)色谱图。

图5为16种真菌毒素混合标准品及其同位素内标物在EIS+正离子模式下的多反应监测(MRM)色谱图。

图6-图28分别为16种真菌毒素单一标准品及其同位素内标物的多反应监测(MRM)色谱图，依次为：

16种真菌毒素单一标准：ZEN、NIV、DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、OTA、T-2、HT-2、FB₁、FB₂、FB₃、AFT B₁、AFT B₂、AFT G₁、AFT G₂、ST；

同位素内标：¹³C₁₅-NIV、¹³C₁₅-DON、¹³C₁₈-ZEN、¹³C₂₀-OTA、¹³C₂₄-T-2、¹³C₂₂-HT-2、¹³C₃₄-FB₁。

图29(A)-图33(B)为五种不同药用部位5种中药材在负离子源模式(EIS-)下的雪腐镰刀菌烯醇(NIV)(A)和正离子源模式(EIS+)下的黄曲霉毒素B₁(AFTB₁)(B)多反应监测(MRM)色谱图，依次为生建曲(根茎类)、苦杏仁(果实种子类)、红花(花类)、杜仲(皮类)、白本耳(菌藻类)。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。为了清楚，不描述实际实施例的全部特征。在下列描述中，不详细描述公知的功能和结构，因为它们会使本发明由于不必要的细节而混乱。应当认为在任何实际实施例的开发中，必须做出大量实施细节以实现开发者的特定目标。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中：

API3200三重四极杆超高效液相色谱-串联质谱仪购自AB SCIEX公司，配有电喷雾离子源；UFLCXR超快速液相色谱仪购自日本岛津公司；高速离心机购自美国赛默飞，型号为X1R；恒温超声仪购自上海昆山，型号为KS501；涡旋混合器购自德国iKa；恒温磁力搅拌器；高速粉碎机购自德国RETSCH公司，型号为GM200；高分辨率扫描电镜购自日本Hitachi，型号为S-4800；

乙腈、乙酸、柠檬酸、乙酸铵、十二水磷酸氢二钠(色谱纯)，购自德国默克试剂公司；氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、柠檬酸钠、苯乙烯、过硫酸铵、苯胺、高氯酸、磷酸、氨水、N,N-二甲基甲酰胺(分析纯)，购自国药集团化学试剂有限公司；

中药材实际样品购自国内中药材基地市场；

16种真菌毒素单标和7种同位素内标购自Romer Labs中国公司，纯度≥98％。

标准溶液配制：

0.5μg/mL ESI-5种混标：分别取DON、ZEN、NIV、3-ADON、15-ADON 100μg/mL原液25μL，加入乙腈定容至5mL，混匀备用。

0.5μg/mL ESI+11种混标：取100μg/mL的T-2、HT-2各25μL，50μg/mL的FB₁、FB₂、FB₃各50uL，100μg/mL的OTA 25μL，10μg/mL的ST 250μL，5.0μg/mL的AFT B₁、A FT B₂、A FT G₁、AFT G₂各500μL，加入乙腈定容至5mL，充分混匀后于-20℃避光保存。

0.5μg/mL混合内标配制：各取25μg/mL的NIV、DON、ZEN、FB₁、T-2、HT-2同位素内标¹³C₁₅-NIV、¹³C₁₅-DON、¹³C₁₈-ZEN、¹³C₃₄-FB₁、¹³C₂₄-T-2、¹³C₂₂-HT-2原液200μL，10μg/mL的OTA同位素内标¹³C₂₀-OTA原液500μL，加入乙腈定容至10mL，充分混匀后于-20℃避光保存。

ESI-模式下的5种混标标准曲线溶液配制：对于质量浓度分别为10、30、50、100、150、200μg/L的混合标准溶液，将质量浓度0.5μg/mL的ESI-混合标准工作液分别移取20、60、100、200、300、400μL，加入0.5μg/mL混合内标50μL，再加入空白基质溶液定容至1mL，混匀备用。

ESI+模式下的11种混标标准曲线溶液配制：对于质量浓度分别为10，30，50，100，150，200μg/L的混合标准溶液，将质量浓度0.5μg/mL的ESI+混合标准工作液分别移取20，60，100，200，300，400μL，加入0.5μg/mL混合内标50μL，再加入空白基质溶液定容至1mL，混匀备用。

空白基质匹配工作液：取空白中药材样品溶液，经前处理后得到空白基质溶液，使用前涡旋混匀，现配现用。

流动相：ESI-模式下，流动相A，0.1％氨水；流动相B，乙腈(色谱纯)；ESI+模式下，流动相A，0.1％甲酸；流动相B，乙腈(色谱纯)。

仪器测定条件

EIS-负离子模式：测量组分5种，AB SCIEX API3200型液质联用仪，液相柱为Agilent Poroshell 120EC C₁₈色谱柱(3.0mm×100mm，2.7μm)，柱温30-40℃，进样盘15℃，流动相0.1％氨水(A)-乙腈(B)；流速0.4mL/min，进样量10μL。液相色谱采用梯度洗脱进样分离。EIS-负离子模式梯度洗脱程序为：流动相A/B(0.1％氨水/乙腈)，0-0.5min：A/B＝95％/5％；0.5-1.0min：A/B＝80％/20％；1.0-3.0min：A/B＝30％/70％；3.0-4.0min：A/B＝5％/95％；4.0-6.0min：A/B＝95％/5％。液相色谱-串联质谱仪多反应监测模式(负离子模式ESI-)测定。在分析样品组之前，注入3针空白溶剂乙腈以确保系统没有污染物或干扰峰。

EIS+正离子模式：测量组分11种，AB SCIEX API3200液质联用仪，液相柱为Agilent Poroshell 120EC C18色谱柱(3.0mm×100mm，2.7μm)，柱温30-40℃，进样盘15℃，流动相0.1％甲酸(A)-乙腈(B)；流速0.4mL/min，进样量10μL。采用梯度洗脱进样分离。EIS+正离子模式梯度洗脱程序为：流动相A/B(0.1％甲酸/乙腈)，0-0.8min：A/B＝90％/10％；0.8-2.5min：A/B＝72％/28％；2.5-11.5min：A/B＝32％/68％；11.5-13.0min：A/B＝0％/100％；13.0-15.0min：A/B＝90％/10％。液相色谱-串联质谱仪多反应监测模式(正离子模式ESI+)测定。在分析样品组之前，注入3针空白溶剂乙腈以确保系统没有污染物或干扰峰。

质谱条件

离子源：电喷雾离子源(EIS)；质谱扫描方式：多重反应监测模式(MRM)；锥孔电压：3.0kV；加热气温度：500℃；离子源温度：150℃；脱溶剂气：800L/H。

16种真菌毒素混合标准品及其同位素内标物在不同离子源模式(EIS)下的多反应监测(MRM)色谱图如图4-5所示；16种真菌毒素单一标准品及其同位素内标物的多反应监测(MRM)色谱图如图6-28所示；五种不同药用部位5种中药材在负离子源模式(EIS-，简写N)下的雪腐镰刀菌烯醇(NIV)和正离子源模式(EIS+，简写P)下的黄曲霉毒素B₁(AFT B₁)多反应监测(MRM)色谱图如图29-33所示。

16种真菌毒素及其同位素内标在EIS-负离子模式和EIS+正离子模式的质谱条件参考表1和表2。

表1 5种真菌毒素及其同位素内标在负离子模式下的质谱参数

表2 11种真菌毒素及其同位素内标在正离子模式下的质谱参数

标准曲线与检出限

为了降低基质效应对定量结果的影响，本试验采用同位素稀释内标法定量，以确保分析结果的准确性。对于质量浓度范围10.0-200μg/L的空白基质混合标准溶液，按照由低到高浓度依次进样检测，以各化合物组分色谱峰与相对应内标色谱峰的峰面积比值为纵坐标，以各组分标示浓度为横坐标进行线性回归分析，得到内标法-标准曲线回归方程。结果表明，该法线性关系良好，相关系数R²≥0.996，各组分检出限(LOD,S/N＞3)范围在0.1-6.0μg/kg，定量限(LOQ,S/N＞10)范围在0.33-20μg/kg。表3代表16种真菌毒素分别在负离子模式和正离子模式下的基质校正曲线、相关系数、检出限和定量限。

表3 16种真菌毒素在不同离子模式下的基质校正曲线、相关系数、检出限和定量限

实施例1固相萃取剂的合成

(1)采用一步式高温水解-水热合成法合成碳微球

16g葡萄糖溶于80mL水，置于100mL反应釜中控温170℃反应8h，降温到80℃反应3h。黑色液体离心-洗涤，循环3次以上，离心转速3500rpm，离心时间10min，以水和乙醇为洗涤剂反复洗涤，得到粒径为400nm的碳微球。

(2)将碳微球浸于丙烯酸溶液增加活性位点

将13g步骤(1)所得碳微球置于100mL 5％的丙烯酸中，超声分散10min，60℃水浴2小时，常温干燥5h得到改性碳微球。

(3)低温氧化协同聚合法使聚苯胺包覆碳微球

在250mL三口瓶中加入10g改性碳微球和70mL 1mol/L的高氯酸水溶液低温超声分散均匀，加入适量1.0mol/L的苯胺在冰浴条件下搅拌20min，磁子搅拌机的搅拌速度维持在500rpm，逐滴加入2mol/L的过硫酸铵引发剂，滴速3秒/滴，继续冰浴搅拌12h，反应完成后，产物依次用无水乙醇和二次去离子水反复离心洗涤，5000rpm转速离心10min；产品在80℃烘箱烘干24h，得到粒径为410nm的聚苯胺@碳微球。

碳微球和聚苯胺@碳微球扫面电镜图如图1-2所示。碳微球溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)分散液中的扫描电镜表明，球形粒径大小均匀、分散性好，其粒径大小为400nm；聚苯胺@碳微球溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)分散液中的扫描电镜表明，聚苯胺均匀包覆在碳微球上，形成了粒径大小为410nm的聚苯胺@碳微球。

碳微球和聚苯胺@碳微球红外光谱图如图3所示。3450、1622和1162cm^-1处的特征峰值在碳微球的红外光谱中观察到(曲线1)，这些峰值归因于-OH、C＝O和C-C-O的伸缩振动峰；曲线2中，位于1574cm^-1和1482cm^-1处的特征峰分别对应于醌环和苯环，1251cm^-1和1304cm^-1处的特征峰为芳香胺的C-N伸缩振动，1144cm^-1处的特征峰是聚苯胺N＝O＝N键的特征吸收峰。这些结果表明聚苯胺成功地聚合在碳微球表面。

实施例2固相萃取包的制备

固相萃取包由萃取盐析包和吸附净化包组成：

(1)将氯化钠、无水硫酸钠、硫酸铵按质量比1:2:4混合均匀，即得萃取盐析包1。

(2)将氯化钠、无水硫酸钠、硫酸铵按质量比1:4:2混合均匀，即得萃取盐析包2。

(3)取实施例1制得的聚苯胺@碳微球装包，即得吸附净化包。

萃取盐析包和吸附净化包各自独立包装。

实施例3中药材中真菌毒素的吸附残留分析(含量)检测

(1)样品前处理

选生建曲、苦杏仁、红花、杜仲、白本耳五种中药材作为样品，采集样品于80℃真空干燥6h，晾干后高速粉碎机粉碎处理，粉末过筛(0.3mm筛孔)，四分法缩分取得均质样品；

称取10.0g均质样品，加入40mL1％的柠檬酸-乙腈萃取溶剂，涡旋混匀2min，室温浸泡20min，振荡提取30min，50℃恒温超声提取30min；准确称取35.8g十二水磷酸氢二钠至1000mL去离子水中，超声并搅拌溶解，再以磷酸调节溶液pH，制得硫酸盐缓冲液；加入适量0.1mol/L的磷酸盐缓冲液调节pH6.0；

加入1.0g由实施例2制得的萃取盐析包1或2于提取管中，震荡涡旋2min，5000rpm离心10min，提取上层有机相；

从有机相中准确移取2mL加入一定浓度¹³C标记的真菌毒素同位素内标溶液，加入0.25g实施例2制得的聚苯胺@碳微球的吸附净化包于萃取管中，涡旋2min，充分分散并吸附色素和杂质，5000rpm离心10min，过0.22μm有机相滤膜得待测液和沉积物。

(2)同位素内标-液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)高通量在线检测中药材中的真菌毒素。

取处理后的待测溶液按照最佳条件进样，内标法计算待测液中目标组分的质量浓度，按公式(1)计算实际样品中16种真菌毒素含量。图29-33显示了对生建曲、苦杏仁、红花、杜仲、白本耳五种中药材的检测结果。

式中：

X：试样中真菌毒素目标组分的含量，单位为微克每千克，μg/kg；

C：试样中真菌毒素目标组分在标准曲线中对应的浓度，单位为纳克每升，ng/mL；

V：试样提取液的体积，单位为毫升，mL；

m：试样称样量，单位为克，g；

f：提取液稀释因子；

经计算，五种中药材中16种真菌毒素的检测结果均小于检出限。

实施例4吸附净化包的回收利用

在100mL G4垂型玻璃过滤漏斗中，平铺双层0.22μm有机滤膜，倒入实施例3步骤(1)中萃取后的沉积物，先后用乙醇、0.1％氨水、二次去离子水循环洗涤至少三次，抽气机真空抽滤液体，滤膜连同墨绿色清洗物置于真空干燥箱70℃干燥6h，即可重复使用3-5次，萃取效率维持在73％-95％。

实施例5回收率和精密度测定

随机取中药材杜仲和麦冬样品进行回收率和精密度测试，真菌毒素组分AFTB₁、AFTB₂、AFTG₁、AFTG₂、OTA在1.0μg/kg，2.0μg/kg和10μg/kg进行加标试验，其余组分在20μg/kg、50μg/kg和200μg/kg进行加标试验，每个加标水平平行测定6次(n＝6)，计算16种真菌毒素的回收率(％)和相对标准偏差(RSD,％)。结果表明，回收率范围为90.1％-105.8％，RSD为1.3％-4.1％。表4为16种真菌毒素在杜仲和麦冬两种样品的低中高三个加标质量浓度的回收率和相对标准偏差。

表4 16种真菌毒素在杜仲和麦冬两种根及根茎类样品的低中高三个加标质量浓度的回收率(％)和精密度RSD(％)(n＝6)

对比例1

与实施例3的区别在于，不使用萃取盐析包，吸附净化包仅使用碳微球进行提取净化。

结果测得16种真菌毒素在杜仲和麦冬两种根及根茎类样品的低中高三个加标质量浓度的回收率(％)分别为75.4-82.7％和77.5-81.9％，精密度RSD(％)分别为3.5-10.8％和4.2-9.1％。

对比例2

与实施例3的区别在于，使用萃取盐析包，吸附净化包仅使用碳微球进行提取净化。

结果测得16种真菌毒素在杜仲和麦冬两种根及根茎类样品的低中高三个加标质量浓度的回收率(％)分别为79.7-90.1％和82.6-89.7％，精密度RSD(％)分别为2.1-4.8％和3.0-6.7％。

对比例3

与实施例3的区别在于，仅仅使用萃取盐析包提取，不使用吸附净化包。

结果测得16种真菌毒素在杜仲和麦冬两种根及根茎类样品的低中高三个加标质量浓度的回收率(％)分别为70.2-82.9％和72.3-84.0％，精密度RSD(％)分别为5.4-10.7％和4.8-9.5％。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种固相萃取剂，其特征在于，由聚苯胺和碳微球复合而成。

2.权利要求1所述固相萃取剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用一步水热法合成碳微球；

(2)将步骤(1)制得的碳微球浸于丙烯酸溶液增加活性位点；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体为：取碳水化合物溶于水，置于反应釜中控温160-180℃反应4-10h，降温至60-80℃反应3-5h，将所得液体离心、洗涤，循环3次，洗涤剂为水和乙醇，反复洗涤得到粒径大小可控的碳微球；优选地，所述碳水化合物为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、纤维素、糖原中的一种或几种；所述碳水化合物与水的质量体积比为1-2g：8-10mL。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体为：将步骤(1)所得碳微球置于丙烯酸溶液中，超声分散5-10min，60-80℃水浴加热1-2小时，常温干燥得到改性碳微球；优选地，所述丙烯酸溶液的质量浓度为2％-5％；所述碳微球与丙烯酸溶液的质量体积比为1-2g：10-20mL。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体为：将步骤(2)所得改性碳微球置于高氯酸水溶液中，超声分散均匀，加入苯胺，在冰浴条件下搅拌10-20min，逐滴加入过硫酸铵引发剂，继续冰浴搅拌8-12h，反应完成后，产物依次用无水乙醇和二次去离子水反复离心洗涤，烘干即得聚苯胺@碳微球；优选地，所述高氯酸水溶液的摩尔浓度为0.8-1.5mol/L；所述改性碳微球与高氯酸水溶液的质量体积比为1-2g：10-14mL。

6.一种固相萃取包，其特征在于，由权利要求1所述的固相萃取剂或权利要求2-5任一项所述方法制备得到的固相萃取剂与一定质量配比的萃取盐析包组成。

7.根据权利要求6所述的固相萃取包，其特征在于：所述萃取盐析包由氯化钠、无水硫酸钠和硫酸铵按质量比1:2-4:2-4混合而成。

8.权利要求6-7任一项所述固相萃取包在中药材真菌毒素分析检测中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品前处理：将中药材样品真空干燥后粉碎，粉末过筛，四分法缩分得到均质样品；所得均质样品加入萃取剂，涡旋混匀，室温浸泡，振荡提取后恒温超声提取，调节pH；利用萃取盐析包提取上层有机相；将前述有机相加入同位素内标溶液，加入固相萃取剂处理，过有机相滤膜，得待测液；优选地，所述真空干燥温度设置为60-80℃、时间设置为4-6h，筛孔直径为0.2-0.5mm，pH值设定为5.5-6.0；所述样品、萃取盐析包的质量比为1:0.6-1；

优选地，所述中药材选自生建曲、西洋参、天麻、党参、黄芪、当归、百合、麦冬、川贝、白芍、重楼、甘草、柴胡、制何首乌、制川乌、葛根、地黄、生半夏、赤芍、白术、山药、山奈、苦杏仁、枸杞子、五倍子、薏苡仁、预知子、山楂、芡实、菟丝子、五味子、牛蒡子、盐补骨脂、苘麻子、桑椹、沙苑子、蛇床子、槐米、枳椇子、红花、金银花、杜仲、黄柏、陈皮、白本耳、土茯苓中的至少一种；

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，对于浅色中药材应用时，萃取盐析包中氯化钠、无水硫酸钠和硫酸铵的质量比为1:3-4:2-3，固相萃取剂与所述上层有机相的质量体积比为0.1-0.2:2g/mL；对于深色中药材应用时，萃取盐析包中氯化钠、无水硫酸钠和硫酸铵的质量比为1:2-3:3-4，固相萃取剂与所述上层有机相的质量体积比为0.2-0.25:2g/mL；所述浅色中药材包括百合、川贝、天麻、麦冬、白芍、薏苡仁、苦杏仁、白本耳、葛根、生半夏、山药、山奈、山楂、芡实中的至少一种，深色中药材包括生建曲、西洋参、党参、黄芪、当归、重楼、甘草、柴胡、制何首乌、制川乌、地黄、赤芍、白术、枸杞子、五倍子、预知子、菟丝子、五味子、牛蒡子、盐补骨脂、苘麻子、桑椹、沙苑子、蛇床子、槐米、枳椇子、金银花、红花、杜仲、陈皮、黄柏、土茯苓中的至少一种。