CN102980961B - 鳗鱼中孔雀石绿、结晶紫及其残留物检测的前处理方法 - Google Patents

鳗鱼中孔雀石绿、结晶紫及其残留物检测的前处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种水产品中孔雀石绿、结晶紫及其残留物检测的前处理方法,属于分析化学领域。该方法包括待测样品的称量、均质、固相萃取、洗脱等操作；所用仪器包括恒温振荡器、高速分散均质机和离心机等；用本前处理方法制备出的样品溶液可以直接用液相色谱-串联质谱法进行检测。该前处理方法与现有方法相比,具有操作简单有效、耗时少、成本低、重现性好等优点，具有很强的可操作性，有望在环保、商检及出入境检验检疫等行业大规模推广应用，具有显著的经济效益。

Description

鳗鱼中孔雀石绿、结晶紫及其残留物检测的前处理方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，更具体涉及鳗鱼中孔雀石绿、结晶紫及其残留物检测的前处理方法。
背景技术
孔雀石绿(Malachite green)、结晶紫（Crystal violet）是一类合成的三苯基甲烷类工业染料，自上世纪30年代作为一种体外驱虫剂，杀真菌剂和消毒剂被广泛的用于水产品养殖业。特别是治疗鱼的增值性肾病（PKD）非常有效。当孔雀石绿和结晶紫被鱼体吸收后，它们主要分别代谢为无色孔雀石绿和无色结晶紫，并沉积在脂肪组织中。由于动物试验证明孔雀石绿和结晶紫对人畜有潜在的致畸、致癌和致突变作用，因而欧盟、美国食品和药物管理局（FDA）等宣布禁止其在水产品养殖过程中使用。
加拿大在1992年发现人类若进食含孔雀石绿的鱼类，会对健康构成重大影响，主要是孔雀石绿中的三苯甲烷基团可引致肝癌。不过，基于孔雀石绿、结晶紫低廉的生产成本及容易使用，不少监管较弱的国家依然在使用中。例如在中国仍有渔民在防治鱼类感染真菌时使用，也有运输商用作消毒，以延长鱼类在长途贩运中的存活时间。
由于易获得，低成本，高效性，虽然因其高毒性、高残留和致畸、致癌、致突变等作用已被国内外许多国家列为“不得检出”的禁用药物。根据欧盟法案2004/25/EC规定对其提出的检测限要求是2mg/kg；日本的肯定列表也明确规定在进口产品中不得检出孔雀石绿残留。2005年，国家标准委将“水产品中孔雀石绿结晶紫及其代谢物残留量检验方法”立项，该标准同时测定水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫，规定检出限为0.5mg/kg。
鉴于上述原因，有必要研究掌握孔雀石绿、结晶紫及其残留物的有效检测方法，达到有效监控其在水产品中残留，减少对人类健康的危害。现阶段对于孔雀石绿、结晶紫及其残留物的检测方法多样，但都包含了样品前处理过程。前处理方法多为使用有机溶剂多次萃取，之后使用层析柱或者具有吸附性填料的柱子进行清洗。此类前处理技术的关键缺点是提取效率低、反复萃取损失大、处理过程耗时较长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、耗时短的鳗鱼中孔雀石绿、结晶紫及其残留物检测的前处理方法,经该方法处理后的待测样品能够直接用液相色谱-串联质谱法进行检测。
    本发明的水产品中孔雀石绿、结晶紫及其残留物检测的前处理方法包括以下步骤：
（1）准确称取样品5.00 g，精确至0.01g，置于50 mL离心管中，加入乙腈有机混合溶剂，用高速分散均质机将样品打散，再加入4.0 g的碱性氧化铝粉末，振荡1min，4500rpm/min离心10min；所述乙腈有机混合溶剂的配制为：20mL乙腈+20mL冰乙酸；
（2）取10mL上清液，以15mL高纯水稀释备用，制备成25mL样品液；
（3）C18固相萃取柱的活化过程： 
a.2mL 含2% 冰醋酸的乙腈淋洗；
                     b.5mL含20%冰醋酸的甲醇杂；
                     c.5mL蒸馏水平衡；
（4）将步骤（2）中25mL样品液过柱，抽真空，5mL 20%乙腈溶液淋洗，弃去全部淋洗液；
（5）再用2 mL 含2% 冰醋酸的乙腈洗脱，收集洗脱液，加入0.01mol/L乙酸铵溶液，定容至2.5mL；
（6）定容液用0.22 μm微孔滤膜过滤，所得滤液即可上机测试。
    所述孔雀石绿、结晶紫及其残留物包括显色孔雀石绿、隐色孔雀石绿、显色结晶紫、隐色结晶紫。
本发明的前处理方法与现有国标方法GB/T 20361-2006相比，具有操作简单有效、耗时短、成本低、重现性好等优点，具有很强的可操作性。
本发明的显著优点为:
1) 目前报导的大部分孔雀石绿、结晶紫及其残留物检测提取方法是针对动物源性食品设计，而本方法是针对鳗鱼中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留检测的一种提取方法；
2) 国标方法需要用有机混合缓冲溶液来提取孔雀石绿、结晶紫及其残留物，而在本发明中我们直接用乙酸-乙腈提取，使孔雀石绿、结晶紫及其残留物能够得到充分的提取，从而能够有效地检测孔雀石绿、结晶紫及其残留物；
3) 目前报道的大部分固相萃取方法均采用多根萃取柱串联的方法将孔雀石绿、结晶紫及其残留物从基质中分离出来，而本方法采用一根萃取柱直接萃取，从而简化了分离步骤，节省了分析时间；
4) 国标方法采用旋转蒸发或者氮气吹干的方法进行浓缩富集，耗时较长，而本方法采用固相萃取的方法可同时进行多个样品的检测，耗时少，操作方便，有机提取剂用量少。
具体实施方式
按照本发明的发明内容实施本发明，所需试剂溶液的配制方法如下：10mmol/L乙酸铵溶液：0.385g乙酸铵溶于500 mL去离子水中，超声脱气；乙腈溶液（V/V）：200 mL乙腈与800 mL水混匀；冰醋酸+甲醇（2+8）（V/V）：200mL的冰醋酸与800mL甲醇混匀，超声脱气；2%的冰醋酸/乙腈：20mL的冰醋酸与980mL的乙腈混匀，超声脱气；标准工作液：标准工作液：取1.0 μg/mL标准中间液1.0 mL用乙腈稀释至10 mL，得到0.1 μg/mL工作液；定量曲线：用乙腈配制定量曲线标液，各个组分的浓度0.0005μg /mL、0.001μg /mL、0.002 μg /mL、0.004μg /mL、0.010μg /mL；基质混合校准曲线：分别取2.00 mL浓度为0.0005μg/mL、0.001μg/mL、0.002μg/mL、0.004μg/mL、0.010μg /mL的标准溶液对空白样品进行洗脱，乙酸铵定容，过滤得基质混合校准溶液。本方法对空白鳗鱼样品中显色孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检出限为0.5μg/kg，达到国内外检测的要求。
实施例1
本发明的鳗鱼中孔雀石绿、结晶紫及其残留物检测的前处理方法的具体操作流程包括样品均质、固相萃取、洗脱等操作。
具体步骤：
（1）准确称取5.00 g(精确至0.01g)样品于50 mL离心管中，加入乙腈有机混合溶剂（20mL乙腈+20mL冰乙酸），用高速分散均质匀浆机把样品打散，加入4.0 g的碱性氧化铝粉末，振荡1min,4500rpm/min离心10min；
（2）取10mL上清液，以15mL高纯水稀释备用，制备成25mL样品液；
（3）C18固相萃取柱（SPE小柱C18-200mg/3mL）活化过程： 
a.2mL 2% 冰醋酸/乙腈淋洗；
                     b.5mL 20%冰醋酸/甲醇除杂；
                     c.5mL蒸馏水平衡；
（4）将步骤（2）中25mL样品液过柱，抽真空，5mL 20%乙腈/水溶液淋洗；
（5）再用2 mL 2%冰醋酸/乙腈洗脱，洗脱液加入0.5mL 0.01mol/L乙酸铵溶液，定容至2.5mL；
（6）定容液用0.22 μm微孔滤膜过滤，所得滤液即可上机测试。
  本发明的提取方法较乙腈-乙酸铵缓冲溶液提取检测的孔雀石绿、结晶紫及其残留物的回收率高（见表1），说明本发明使孔雀石绿、结晶紫及其残留物的残留能够得到充分的提取，从而能够有效的检测孔雀石绿、结晶紫及其残留物的残留。且本发明重复性好（见表2），具有很强的可操作性。
表1：国标方法与本方法乙腈-乙酸混合溶液提取的回收率比较
Figure 2012105520588100002DEST_PATH_IMAGE001
注：本方法的提取剂效果明显比国标中乙腈-乙酸铵缓冲溶液效果要好
表2：提取方法的重现性实验
Figure 361553DEST_PATH_IMAGE002
注：孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的RSD%均小于5。
结果：
1.加标回收：添加0.02 mg/L混合标准工作液125μL，相当于0.005 mg/kg添加水平。空白鳗鱼样品进行加标回收试验结果表明:在5μg·kg-1添加水平时平均回收率在80%-110%左右。
2.用本方法处理后经UPLC检测得孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的保留时间依次为1.31min,2.64min,1.66min,2.28min,分离效果良好,分析时间为4min。

Claims (1)

1. 一种鳗鱼中孔雀石绿、结晶紫及其残留物检测的前处理方法，其特征在于：所述的前处理方法包括以下步骤：
（1）准确称取样品5.00 g，精确至0.01g，置于50 mL 离心管中，加入乙腈有机混合溶剂，用高速分散均质机将样品打散，再加入4.0 g 的碱性氧化铝粉末，振荡1min，4500rpm 离心10min ；所述乙腈有机混合溶剂的配制为：20mL 乙腈+20mL 冰乙酸；
（2）取10mL 上清液，以15mL 高纯水稀释备用，制备成25mL 样品液；
（3）C18 固相萃取柱的活化过程：
a.2mL 含2% 冰醋酸的乙腈淋洗；
b.5mL 含20% 冰醋酸的甲醇除杂；
c.5mL 蒸馏水平衡；
（4）将步骤（2）中25mL 样品液过柱，抽真空，5mL 20% 乙腈溶液淋洗，弃去全部淋洗液；
（5）再用2 mL 含2% 冰醋酸的乙腈洗脱，收集洗脱液，加入0.01mol/L 乙酸铵溶液，定容至2.5mL ；
（6）定容液用0.22 μm 微孔滤膜过滤，所得滤液即可上机测试。
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