CN104614471A

CN104614471A - 食品中苏丹红染料残留的快速提取净化及检测方法

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Publication number: CN104614471A
Application number: CN201510027428.XA
Authority: CN
Inventors: 陈晓红; 潘胜东; 赵永纲; 金米聪
Original assignee: Ningbo Municipal Center For Disease Control & Prevention
Current assignee: Ningbo Municipal Center For Disease Control & Prevention
Priority date: 2015-01-20
Filing date: 2015-01-20
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2035-01-20
Also published as: CN104614471B

Abstract

本发明涉及一种食品中苏丹红染料残留的快速提取净化及检测方法，所述食品为鸡蛋、辣椒以及辣椒油中的一种，包括以下步骤：鸡蛋样品或辣椒样品采用乙腈-二氯甲烷混合液提取，然后采用强阳离子固相萃取柱净化，而辣椒油样品与二氯甲烷-正己烷混合后直接上柱净化；超快速液相色谱-串联质谱法(UFLC-MS/MS)检测。该方法克服了苏丹红III和苏丹红IV回收率低的问题以及鸡蛋样品容易松散、不易实现有效固液分离的问题，具有步骤简单、操作方便的优点；同时，采用UFLC-MS/MS对处理后的净化液进行苏丹红含量检测，克服了现有的液相色谱法灵敏度差、准确性低、假阳性率高等不足，使得四种苏丹红染料的加标回收率为90.6～99.4％，检出限为0.1～0.5μg/kg。

Description

食品中苏丹红染料残留的快速提取净化及检测方法

技术领域

本发明涉及一种食品中有毒有害化学组分残留的测定方法，尤其涉及鸡蛋和辣椒等食品中苏丹红染料残留的快速提取净化及检测方法。

背景技术

苏丹红是一类人工合成的偶氮苯基萘酚工业染料，主要包括I、II、III和IV四种类型，被大量用于机油、汽油蜡和鞋油等工业品中，还可以用于焰火礼花的着色。在食品的加工过程中，为求制品色彩的艳丽或保持原有的色泽，借以改善食品的感官性状，增加人们的食欲，常常会添加一些食用色素。1995年欧盟禁止将苏丹红(尤其是苏丹红I号)作为食用色素添加到食品当中，对此我国也明文禁止。然而，近年来食品中频频检测出苏丹红，如，2005年3月4日，亨氏辣椒酱在北京首次被检出含有苏丹红I号；不到1个月，在包括肯德基等多家餐饮与食品公司的产品中相继检出含有苏丹红I号；苏丹红事件由此席卷全中国，国家质检总局于2005年4月对全国可能含有苏丹红的食品进行专项检查后发现，共有36家企业生产的88种食品及添加剂含有苏丹红；2007年1月，国家质检总局再次发布苏丹红预警，25％辣椒制品因含有苏丹红而抽检不合格。上述种种事件给整个社会造成了极其恶劣的影响，甚至造成了社会大众对食品安全的恐慌。因此，快速、准确、灵敏、简便的测定食品中苏丹红的分析方法迫在眉睫。

在苏丹红的检测中，由于食品样品基质复杂，需要选择合适的提取溶剂才能取得满意的提取效果，尤其是鸡蛋、辣椒及其制品等食品。国家标准GB/T 19681-2005推荐使用正己烷作为提取溶剂，但实验发现提取效果不甚理想，尤其是苏丹红III和IV回收率较低(<70％)。申请号为201310031730.3(公开号为CN 103091423A)的中国发明专利《苏丹红检测方法》提供了一种以乙腈为提取溶剂，经C18固相萃取小柱净化后采用液相色谱分析食品中苏丹红染料的方法；该方法步骤简单、成本低廉，但由于液相色谱-紫外检测法的局限性，其对食品中苏丹红残留分析存在灵敏度低、假阳性率高等不足，且该方法采用乙腈作为提取溶剂，适用的食品类别少，尤其对于含大量油脂的辣椒油无法较好的进行提取。又如：申请号为201210533392.9(公开号为CN 102944639 A)选择了甲醇、乙腈与异丙醇混合溶液对红辣椒粉样品和番茄汁样品进行提取，然后采样用高效液相色谱-紫外检测仪进行测定。同样地，该方法所采用的高效液相色谱-紫外检测仪具有灵敏度低、假阳性率高等缺陷，同时样品基质单一，对公众关注的鸡蛋样品和辣椒油样品均未涉及，且该方法未经净化直接测定，基质干扰大。

因此，现有的应用于食品样品中苏丹红残留检测的方法存在许多不足，有待改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种检测灵敏度高、准确性高的食品中苏丹红染料残留的快速提取净化及检测方法，该方法尤其适用于鸡蛋、辣椒以及辣椒油等食品中苏丹红染料的检测。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种食品中苏丹红染料残留的快速提取净化及检测方法，所述食品为鸡蛋、辣椒以及辣椒油中的一种，其特征在于包括以下步骤：

1～5g鸡蛋样品或辣椒样品干燥与粉碎后置于容器中，然后加入5～15mL体积比为1:0.5～10的乙腈-二氯甲烷混合液，超声提取1～10min，离心取上清液，重复提取两次，合并提取液，旋蒸浓缩至近干得提取物；用2～10mL正已烷将提取物复溶，通过固相萃取小柱净化，收集洗脱液，氮吹至干，然后加入1～2mL叔丁基甲醚体积分数为10％～60％的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液复溶，过0.22μm滤膜后制得净化液待测；

或者，称取0.5～1.0g辣椒油样品，加入5～10mL二氯甲烷体积分数为1％～5％的二氯甲烷-正己烷混合溶液，涡旋混合均匀，加入固相萃取小柱进行净化，收集洗脱液，氮吹至干，然后加入1mL叔丁基甲醚体积分数为10％～40％的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液复溶，过0.22μm滤膜后用超快速液相色谱-串联质谱(UFLC-MS/MS)检测。

上述UFLC-MS/MS检测的检测条件如下：

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C₁₈柱(100mm×2.1mm,1.8μm)；

流动相：0.1％～1％甲酸水溶液A，0.1％～1％甲酸乙腈溶液B；

柱温：40.0℃；

流速：0.45mL/min；

进样量：5.0μL；

梯度洗脱程序：0～2.0min，10％～95％B；2.00～4.50min，95％B；4.50～4.51min,95％～10％B；4.51～6.50min，10％B；

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描方式(ESI⁺)；

定量检测方式：多反应检测模式(MRM)；

电喷雾电压：4500V；

雾化器压力：344.8kPa(50psi)；

气帘气压力：275.9kPa(40.0psi)；

碰撞气压力：41.4kPa(6.0psi)；

离子源温度：500℃；

扫描时间：50ms；

碰撞室出口电压：10.0V；

碰撞室入口电压：10.0V。

作为优选，上述检测方法中，乙腈-二氯甲烷混合液的体积比为1:1，能有效提取鸡蛋和辣椒样品中的四种苏丹红染料(I、II、III和IV四种类型)，尤其是苏丹红III和苏丹红IV，同时解决以二氯甲烷为提取液时鸡蛋样品容易松散、不易实现有效地固液分离等问题。

作为优选，所述步骤(1)中的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液中叔丁基甲醚的体积分数均为40％，能有效溶解目标分析物，降低基质效应。

作为优选，所述固相萃取小柱为中性氧化铝柱、C₁₈固相萃取柱和强阳离子固相萃取柱中的一种，进一步，所述固相萃取小柱为强阳离子固相萃取柱，这样能有效净化样品基质。

作为优选，所述二氯甲烷-正已烷混合溶液中二氯甲烷的体积分数为5％，能有效溶解辣椒油中残留的苏丹红染料。

作为优选，所述鸡蛋样品为去壳后的生鸡蛋或熟鸡蛋中的一种，所述辣椒样品为鲜辣椒、干辣椒、辣椒粉或辣椒酱中的一种。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中采用乙腈-二氯甲烷混合提取液提取鸡蛋样品和辣椒样品中残留的痕量苏丹红染料，克服了现有的检测方法中苏丹红III和苏丹红IV回收率低的问题，同时也克服了现有技术中用二氯甲烷作为提取液时鸡蛋样品容易松散、不易实现有效固液分离的问题；同时本发明采用二氯甲烷-正已烷混合液对辣椒油样品进行稀释后直接上柱净化，省略了繁琐的样品提取步骤，使得操作更加方便；最后本发明采用超快速液相色谱-串联质谱(UFLC-MS/MS)对处理后的净化液进行苏丹红含量检测，克服了现有的液相色谱法灵敏度差、准确性低、假阳性率高等不足，使得对四种苏丹红染料的检出限值均可达0.1～0.5μg/kg。

附图说明

图1为本发明实施例1中辣椒样品的四种苏丹红染料的多反应监测(MRM)色谱图，其中：1：苏丹红I；2：苏丹红II；3：苏丹红III；4：苏丹红IV。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：

1.1将新鲜辣椒干燥后粉碎得辣椒粉末，然后称取1.0g辣椒粉末于50mL塑料离心管中，加入5mL体积比为1:0.5的乙腈-二氯甲烷混合液，超声提取1min，离心5min，重复提取2次，合并提取液，旋蒸浓缩至近干得提取物，用2mL正己烷将提取物复溶，通过固相萃取小柱净化，收集洗脱液于10mL玻璃离心管中，氮吹至干，加入1mL叔丁基甲醚体积分数为10％的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液复溶，过0.22μm滤膜后制得净化液待测。

1.2将步骤1.1得到的辣椒样品的净化液按照下述条件进行超快速液相色谱-串联质谱法(UFLC-MS/MS分)析，液相色谱和质谱条件如下:

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C₁₈柱(100mm×2.1mm,1.8μm)；流动相A：甲酸浓度为0.1％的甲酸水溶液；流动相B：甲酸浓度为0.1％的甲酸乙腈溶液；柱温：40.0℃；流速：0.45mL/min；进样量：5.0μL。梯度洗脱程序：0～2.0min，10％～95％B；2.00～4.50min，95％B；4.50～4.51min，95％～10％B；4.51～6.50min，10％B。

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描方式(ESI⁺)；定量检测方式：多反应检测模式(MRM)；电喷雾电压：4500V；雾化器压力：344.8kPa(50psi)；气帘气压力：275.9kPa(40.0psi)；碰撞气压力：41.4kPa(6.0psi)；离子源温度：500℃；扫描时间：50ms；碰撞室出口电压：10.0V；碰撞室入口电压：10.0V；4种苏丹红染料的保留时间、Q₃/Q₁离子对、碰撞能量(CE)和去簇电压(DP)见表1，四种苏丹红染料的多反应监测(MRM)色谱图如图1所示。测得新鲜辣椒中四种苏丹红染料的加标回收率为91.5～99.6％，检出限为0.1～0.2μg/kg。

表1四种苏丹红染料的保留时间、Q₃/Q₁离子对、碰撞能量(CE)和去簇电压(DP)

*为定量离子

实施例2：

2.1将干辣椒进一步干燥和粉碎而得辣椒末，然后称取2.0g辣椒末于50mL塑料离心管中，加入10mL体积比为1:1的乙腈-二氯甲烷混合液，超声提取5min，离心5min，重复提取2次，合并提取液，旋蒸浓缩至近干得提取物，用5mL正己烷将提取物复溶，通过固相萃取小柱净化，收集洗脱液于10mL玻璃离心管中，氮吹至干，加入1mL叔丁基甲醚体积分数为40％的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液复溶，过0.22μm滤膜后制得净化液待测。

2.2将步骤2.1得到的辣椒样品的净化液按照实施例1的条件进行UFLC-MS/MS分析，与实施例1不同的是，实施例2中流动相A和B中甲酸的浓度为0.5％。测得干辣椒中四种苏丹红染料的加标回收率为90.6～98.7％，检出限为0.1～0.4μg/kg。

实施例3：

3.1将辣椒粉进一步干燥和粉碎得辣椒末，称取4.0g辣椒末于50mL塑料离心管中，加入10mL体积比为1:5的乙腈-二氯甲烷混合液，超声提取8min，离心5min，重复提取2次，合并提取液，旋蒸浓缩至近干得提取物，用8mL正己烷将提取物复溶，通过固相萃取小柱净化，收集洗脱液于10mL玻璃离心管中，氮吹至干，加入1mL叔丁基甲醚体积分数为50％的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液复溶，过0.22μm滤膜后制得净化液待测。

3.2将步骤3.1得到的辣椒样品的净化液按照实施例1的条件进行UFLC-MS/MS分析，与实施例1不同的是，实施例2中流动相A和B中甲酸的浓度为0.8％。测得辣椒粉中四种苏丹红染料的加标回收率为93.4～98.5％，检出限为0.2～0.5μg/kg。

实施例4：

4.1将辣椒酱干燥后粉碎得辣椒粉末，称取5.0g辣椒末于50mL塑料离心管中，加入10mL体积比为1:10的乙腈-二氯甲烷混合液，超声提取10min，离心5min，重复提取2次，合并提取液，旋蒸浓缩至近干得提取物，用10mL正己烷将提取物复溶，通过固相萃取小柱净化，收集洗脱液于10mL玻璃离心管中，氮吹至干，加入2mL叔丁基甲醚体积分数为60％的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液复溶，过0.22μm滤膜后制得净化液待测。

4.2将步骤4.1得到的鸡蛋和辣椒样品的净化液按照实施例1的条件进行UFLC-MS/MS分析，与实施例1不同的是，实施例2中流动相A和B中甲酸的浓度为1.0％。测得辣椒酱中四种苏丹红染料的加标回收率为91.4～96.5％，检出限为0.3～0.5μg/kg。

实施例5：

5.1将新鲜鸡蛋打破取蛋清和蛋黄，干燥、粉碎后搅拌均匀得鸡蛋样品，称取1.0g鸡蛋样品于50mL塑料离心管中，加入5mL体积比为1:0.5的乙腈-二氯甲烷混合液，超声提取1min，离心5min，重复提取2次，合并提取液，旋蒸浓缩至近干得提取物，用2mL正己烷将提取物复溶，通过固相萃取小柱净化，收集洗脱液于10mL玻璃离心管中，氮吹至干，加入1mL叔丁基甲醚体积分数为10％的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液复溶，过0.22μm滤膜后的净化液待测。

5.2将步骤5.1得到的鸡蛋样品的净化液按照下述条件进行UFLC-MS/MS分析，液相色谱和质谱条件如下：

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C₁₈柱(100mm×2.1mm,1.8μm)；流动相A：甲酸含量为0.1％的甲酸水溶液；流动相B：甲酸含量为0.1％的甲酸乙腈溶液；柱温：40.0℃；流速：0.45mL/min；进样量：5.0μL。梯度洗脱程序：0～2.0min，10％～95％B；2.00～4.50min，95％B；4.50～4.51min，95％～10％B；4.51～6.50min，10％B。

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描方式(ESI⁺)；定量检测方式：多反应检测模式(MRM)；电喷雾电压：4500V；雾化器压力：344.8kPa(50psi)；气帘气压力：275.9kPa(40.0psi)；碰撞气压力：41.4kPa(6.0psi)；离子源温度：500℃；扫描时间：50ms；碰撞室出口电压：10.0V；碰撞室入口电压：10.0V；4种苏丹红染料的保留时间、Q₃/Q₁离子对、碰撞能量(CE)和去簇电压(DP)见表2。测得生鸡蛋中四种苏丹红染料的加标回收率为92.6～95.5％，检出限为0.1～0.2μg/kg。

表2四种苏丹红染料的保留时间、Q₃/Q₁离子对、碰撞能量(CE)和去簇电压(DP)

*为定量离子

实施例6：

6.1将新鲜鸡蛋蒸熟，熟鸡蛋去壳，取蛋白和蛋黄，干燥与粉碎后搅拌均匀得鸡蛋样品，称取2.0g鸡蛋样品于50mL塑料离心管中，加入10mL体积比为1:1的乙腈-二氯甲烷混合液，超声提取5min，离心5min，重复提取2次，合并提取液，旋蒸浓缩至近干得提取物，用5mL正己烷将提取物复溶，通过固相萃取小柱净化，收集洗脱液于10mL玻璃离心管中，氮吹至干，加入1mL叔丁基甲醚体积分数为40％的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液复溶，过0.22μm滤膜后得净化液待测。

6.2将步骤6.1得到的鸡蛋样品的净化液按照实施例5的条件进行UFLC-MS/MS分析，与实施例5不同的是，实施例6中流动相A和B中甲酸的浓度为0.5％。测得熟鸡蛋中四种苏丹红染料的加标回收率为93.5～97.4％，检出限为0.2～0.5μg/kg。

实施例7：

7.1将新鲜鸡蛋打破取蛋清和蛋黄，干燥、粉碎后搅拌均匀得鸡蛋样品，称取4.0g鸡蛋样品于50mL塑料离心管中，加入10mL体积比为1:5的乙腈-二氯甲烷混合液，超声提取8min，离心5min，重复提取2次，合并提取液，旋蒸浓缩至近干得提取物，用8mL正己烷将提取物复溶，通过固相萃取小柱净化，收集洗脱液于10mL玻璃离心管中，氮吹至干，加入1mL叔丁基甲醚体积分数为50％的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液复溶，过0.22μm滤膜后得净化液待测。

7.2将步骤7.1得到的鸡蛋样品的净化液按照实施例5的条件进行UFLC-MS/MS分析，与实施例5不同的是，实施例7中流动相A和B中甲酸的浓度为0.8％。测得生鸡蛋中四种苏丹红染料的加标回收率为92.2～96.8％，检出限为0.1～0.5μg/kg。

实施例8：

8.1将新鲜鸡蛋蒸熟，熟鸡蛋去壳，取蛋白和蛋黄，干燥与粉碎后搅拌均匀得鸡蛋样品，称取5.0g鸡蛋样品于50mL塑料离心管中，加入10mL体积比为1:10的乙腈-二氯甲烷混合液，超声提取10min，离心5min，重复提取2次，合并提取液，旋蒸浓缩至近干得提取物，用10mL正己烷将提取物复溶，通过固相萃取小柱净化，收集洗脱液于10mL玻璃离心管中，氮吹至干，加入2mL叔丁基甲醚体积分数为60％叔丁基甲醚-甲醇混合溶液复溶，过0.22μm滤膜后的净化液待测。

8.2将步骤8.1得到的鸡蛋样品的净化液按照实施例5的条件进行UFLC-MS/MS分析，与实施例5不同的是，实施例8中流动相A和B中甲酸的浓度为1.0％。测得熟鸡蛋中四种苏丹红染料的加标回收率为91.6～99.4％，检出限为0.2～0.5μg/kg。

实施例9：

9.1称取0.5g辣椒油样品，加入5mL 1％二氯甲烷-正己烷混合溶液，涡旋混合均匀，加入固相萃取小柱进行净化，收集洗脱液于10mL玻璃离心管中，氮吹至干，加入1mL叔丁基甲醚体积分数为10％的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液复溶，过0.22μm滤膜后得净化液待测。

9.2将步骤9.1得到的辣椒油样品的稀释净化液按照实施例1的色-质谱条件进行UFLC-MS/MS分析。测得辣椒油中四种苏丹红染料的加标回收率为92.7～98.4％，检出限为0.1～0.3μg/kg。

实施例10：

10.1称取1.0g辣椒油样品，加入10mL 5％二氯甲烷-正己烷混合溶液，涡旋混合均匀，加入固相萃取小柱进行净化，收集洗脱液于10mL玻璃离心管中，氮吹至干，加入2mL叔丁基甲醚体积分数为40％的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液复溶，过0.22μm滤膜后得净化液待测。

10.2超快速液相色谱-串联质谱法(UFLC-MS/MS)检测鸡蛋样品中苏丹红残留

将步骤10.1得到的辣椒油样品的稀释净化液按照实施例1的色-质谱条件进行UFLC-MS/MS分析。测得辣椒油中四种苏丹红染料的加标回收率为91.6～99.2％，检出限为0.1～0.2μg/kg。

Claims

1.一种食品中苏丹红染料残留的快速提取净化及检测方法，所述食品为鸡蛋、辣椒以及辣椒油中的一种，其特征在于包括以下步骤：

1～5g鸡蛋样品或辣椒样品干燥与粉碎后置于容器中，然后加入5～15mL体积比为1:0.5～10的乙腈-二氯甲烷混合液，超声提取1～10min，离心取上清液，重复提取两次，合并提取液，旋蒸浓缩至近干得提取物；用2～10mL正已烷将提取物复溶，通过固相萃取小柱净化，收集洗脱液，氮吹至干，然后加入1～2mL叔丁基甲醚体积分数为10％～60％的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液复溶，过0.22μm滤膜后用超快速液相色谱-串联质谱(UFLC-MS/MS)检测。

2.如权利要求1所述的食品中苏丹红染料残留的快速提取净化及检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中乙腈-二氯甲烷混合液的体积比为1:1。

3.如权利要求1所述的食品中苏丹红染料残留的快速提取净化及检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中的叔丁基甲醚-甲醇混合溶液中叔丁基甲醚的体积分数均为40％。

4.如权利要求1所述的食品中苏丹红染料残留的快速提取净化及检测方法，其特征在于：所述固相萃取小柱为中性氧化铝柱、C₁₈固相萃取柱和强阳离子固相萃取柱中的一种。

5.如权利要求4所述的食品中苏丹红染料残留的快速提取净化及检测方法，其特征在于：所述固相萃取小柱为强阳离子固相萃取柱。

6.如权利要求1所述的食品中苏丹红染料残留的快速提取净化及检测方法，其特征在于：所述二氯甲烷-正已烷混合溶液中二氯甲烷的体积分数为5％。

7.如权利要求1～6中任一权利要求所述的食品中苏丹红染料残留的快速提取净化及检测方法，其特征在于：所述鸡蛋样品为去壳后的生鸡蛋或熟鸡蛋中的一种，所述辣椒样品为鲜辣椒、干辣椒、辣椒粉或辣椒酱中的一种。