CN105758948B - 雷公藤甲素作为特征识别物在鉴别蜂蜜中是否含有雷公藤蜂蜜中的应用 - Google Patents

雷公藤甲素作为特征识别物在鉴别蜂蜜中是否含有雷公藤蜂蜜中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蜂蜜鉴别技术领域，尤其涉及鉴别蜂蜜中是否含有毒雷公藤蜂蜜的方法，具体地，本申请发现雷公藤甲素可以作为特征识别物用于雷公藤蜂蜜的鉴别，在此基础之上，提出了采用LC‑Q‑TOF或LC/MS/MS鉴别蜂蜜的方法，并对其具体检测条件进行了优化。本发明首先建立起了识别雷公藤蜂蜜的方法，对于蜂蜜的消费安全有着重要意义。

Description

雷公藤甲素作为特征识别物在鉴别蜂蜜中是否含有雷公藤蜂 蜜中的应用
技术领域
本发明涉及蜂蜜鉴别技术领域，尤其涉及雷公藤甲素作为特征识别物在鉴别蜂蜜中是否含有雷公藤蜂蜜中的应用。
背景技术
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露后与自身分泌物混合经充分酿造而成的天然甜物质。蜜蜂采集的植物花蜜、分泌物或蜜露应安全无毒，不得来源于有毒蜜源植物，如雷公藤、博落回、狼毒等。
蜂蜜中毒事件时有发生，在国外来自马桑和杜鹃花的“野蜂蜜”中毒事件时有报道，国外也建立了对应的分析方法来对这种蜂蜜进行确认检验。在我国，蜂蜜中毒很少发生，但是近几年在我国福建、湖北、重庆等地出现了蜜蜂中毒死亡事件，通过花粉初步认定为雷公藤和博落回形成的有毒蜂蜜。尽管蜜蜂很少去采集雷公藤和博落回这两种有毒蜂蜜，但是在大旱之季，或其他蜜源减少，雷公藤和博落回大量产粉和流蜜时，蜜蜂会采集雷公藤和博落回的花蜜，生产有毒蜂蜜。加之我国蜂蜜的生产方式，这些蜂蜜有可能混到以其他蜂蜜中后加工，造成潜在风险。
尽管目前还没有明确这种蜂蜜中到底是哪种或是那类物质导致的中毒，但是首先建立起识别这种蜂蜜的方法，对于蜂蜜的消费安全有着重要意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的缺陷和不足，筛选出易发现、易制备的物质作为特征识别物来鉴别蜂蜜中是否含有有毒的雷公藤蜂蜜，并利用该特征识别物建立起一种鉴别雷公藤蜂蜜的方法。
本发明的技术方案之一是：雷公藤甲素作为特征识别物在鉴别蜂蜜中是否含有雷公藤蜂蜜中的应用。
本发明的技术方案之二是：一种利用雷公藤甲素作为特征识别物鉴别蜂蜜中是否含有雷公藤蜂蜜的方法，该方法采用LC-Q-TOF(液相-四级杆-飞行时间质谱)或LC/MS/MS(液相色谱串联质谱)检测待测蜂蜜样品，所得谱图中含有所述雷公藤甲素对应的特征峰时，则判定蜂蜜中含有有雷公藤蜂蜜；不含有所述特征峰时，判定蜂蜜中不含有雷公藤蜂蜜。
其中，所述LC-Q-TOF的飞行时间质谱图中至少含有361.1646(允许偏差±5ppm)质量数(M+H)准分子离子峰。
优选地，为了提高鉴别的精准度，所述飞行时间质谱图中还含有如下质量数(M+H)准分子离子峰中的一个或多个：359.1624(允许偏差±5ppm)，307.1820(允许偏差±5ppm)，385.1718(允许偏差±5ppm)，327.1720(允许偏差±5ppm)，355.2032(允许偏差±5ppm)，371.1893(允许偏差±5ppm)，339.2081(允许偏差±5ppm)。
更优选地，所述飞行时间质谱图中同时含有上述7个分子离子峰。
具体地，在对蜂蜜样品进行检测时，优选采用如下预处理方式对蜂蜜样品进行预处理：取蜂蜜样品，每1g蜂蜜中加入0.8-1.2mL水溶解，向溶解液中加入0％-0.3％的甲酸乙腈溶液或甲酸甲醇溶液斡旋提取1-8min，加入无水硫酸镁和氯化钠后离心，取有机相并用氮气吹干，然后加入40％-60％的乙腈水溶液或甲醇水溶液复溶，过滤即得。
优选的预处理方法为：取蜂蜜样品，每1g蜂蜜中加入1mL水溶解，向溶解液中加入0％-0.2％的甲酸乙腈溶液或甲酸甲醇溶液斡旋提取5min，加入无水硫酸镁和氯化钠后离心，取有机相并用氮气吹干，然后加入50％的乙腈水溶液或甲醇水溶液复溶，过滤即得。
其中，0％-0.3％或0％-0.2％的甲酸乙腈溶液(或甲酸甲醇溶液)指的是乙腈溶液(或甲醇溶液)中甲酸的体积百分含量。40％-60％或50％的乙腈水溶液(或甲醇水溶液)指的是水溶液中乙腈(或甲醇)的体积百分含量。
采用LC-Q-TOF对蜂蜜样品进行检测时，所述LC-Q-TOF中的LC包括如下检测条件：
色谱柱：C18柱或C8柱或苯基柱；
流动相：A乙腈或甲醇，B 0％-0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱：0-2min 5％B，2-20min 90％B，20-21min 5％B，21-35min 5％B；
所述Q-TOF包括如下检测条件：
目标离子：361.1646；
碰撞能量30eV。
其中，流动相B 0％-0.2％的甲酸水溶液指的是甲酸水溶液中甲酸的体积百分含量。
优选地，色谱柱采用C18柱，进一步优选采用Eclipse Plus C18，2.1x100mm，1.8μm。
为了进一步提高检测的精准度，LC的流动相流速为0.15-0.6mL/min，柱温为25-35℃，进样量为1-30μL。
优选地，流速为0.2mL/min，柱温为30℃，进样量为2μL。
为了进一步提高检测的精准度，Q-TOF采用ESI正离子，干燥气氮气流速为5-7mL/min，温度为280-320℃，气帘气流速为9-11L/min，温度为330-370℃，电离电压为3800-4200V；扫描方式为MS scan全扫描，质量数范围100-2000，参比实时校正。
优选地，采用ESI正离子，干燥气氮气流速为6mL/min，温度300℃，气帘气流速10L/min，温度350℃，电离电压4000V；扫描方式为MS scan全扫描，质量数范围100-2000，参比实时校正。
采用LC-Q-TOF方法对蜂蜜进行检测，具有无需标准品，通过识别特征物的准确质量数达到快速鉴别雷公藤蜂蜜的优势，但LC-Q-TOF存在着检测灵敏度不足的问题，为了能够更加灵敏的对雷公藤蜂蜜进行鉴别，本发明还提供一种采用LC/MS/MS手段进行鉴别的方法，该方法具有快速、准确、灵敏度高的优势。
具体的，所述LC/MS/MS中的LC包括如下条件：
色谱柱：C18柱或C8柱或苯基柱，优选为C18柱，进一步优选为agilent SB C18，2.1x50mm，1.8μm；
流动相：A乙腈或甲醇，B 0％-0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱，0-1min 5％B，1-4min 20％B，4-6min90％B，6-8min 5％B；
MS/MS包括如下条件：
扫描方式：MRM，雷公藤甲素361>143，361>197；倍增电压：0-400。
为了提高鉴别的精准度，所述LC还包括如下条件：流速：0.15-0.6mL/min，柱温：25-35℃，进样量1-30μL；
优选为：流速：0.2mL/min，柱温：30℃，进样量2μL。
所述MS/MS还包括：ESI正离子，干燥气氮气流速：5-7mL/min，温度180-220℃，气帘气流速：9-11L/min，温度330-370℃，电离电压3800-4200V；
优选为：ESI正离子，干燥气氮气流速：6mL/min，温度300℃，气帘气流速：10L/min，温度350℃，电离电压4000V。
本发明通过LC-Q-TOF或LC/MS/MS分析蜂蜜样品中是否含有雷公藤甲素，就可以确认蜂蜜中是否含有危害蜂蜜，且具有极低的检出限，具体地，LC-Q-TOF的检出限为30-35μg/kg，LC/MS/MS的检出限为10-12μg/kg。
需要说明的是，本发明的目的在于发现特征提取物，并利用该特征提取物用于雷公藤蜂蜜的鉴别。虽然雷公藤甲素毒性较高，但本发明并不能证明雷公藤甲素就是致雷公藤蜂蜜有毒的物质，具体是何种物质致雷公藤蜂蜜有毒，还需要通过实验进一步确认。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以互相组合，即得本发明各较佳实施例。
本发明涉及到的原料和试剂均可市购获得。
本发明具有的优点是：
(1)确定了雷公藤甲素可以作为鉴别蜂蜜中是否含有雷公藤蜂蜜的特征识别物，建立起了响应雷公藤蜂蜜的方法，且两种方法具有极低的检出限，对于蜂蜜的消费安全有着重要意义；
(2)雷公藤甲素标准样品易于获得，适合作为特征识别物；
(3)在确定了特征识别物的基础上，通过LC-Q-TOF，LC/MS/MS方法可以快速分析雷公藤甲素，从而快速识别这两种蜂蜜；
(4)蜂蜜样品预处理方法简单便捷，易于操作。
附图说明
图1中A为雷公藤整花提取物Q-TOF分析总离子图，B为雷公藤整花提取物Q-TOF分析特征离子361.1646(雷公藤甲素)提取色谱图，C为采集的雷公藤蜂蜜提取物Q-TOF分析总离子图，D为采集的雷公藤蜂蜜提取物Q-TOF分析特征离子361.1646(雷公藤甲素)提取色谱图；
图2中为E为雷公藤整花提取物Q-TOF分析特征离子准确质量数质谱图，F为采集的雷公藤蜂蜜提取物Q-TOF分析特征离子准确质量数质谱图；
图3中为G为实际样品提取物Q-TOF分析特征离子361.1646(雷公藤甲素)提取色谱图，H为实际样品提取物Q-TOF分析特征离子准确质量数质谱图；
图4为油菜蜂蜜特征离子361.1646(雷公藤甲素)提取色谱图；
图5为椴树蜂蜜特征离子361.1646(雷公藤甲素)提取色谱图；
图6为荆条蜂蜜特征离子361.1646(雷公藤甲素)提取色谱图；
图7为洋槐蜂蜜特征离子361.1646(雷公藤甲素)提取色谱图；
图8为枣花蜂蜜特征离子361.1646(雷公藤甲素)提取色谱图；
图9为多花种蜂蜜特征离子361.1646(雷公藤甲素)提取色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
预实验例
1、实验材料：雷公藤蜂蜜，雷公藤整花，油菜蜂蜜，洋槐蜂蜜，荆条蜂蜜，椴树蜂蜜，枣花蜂蜜，多花种蜂蜜。
其中，雷公藤蜂蜜通过如下方法获得：在河南新乡蜂场，选择有雷公藤种植地域，将蜂场置于密封能采集的区域，通过人工手段将附近其他蜜源去除，让蜜蜂来采集雷公藤蜂蜜，采集一周，从蜂箱摇出蜂蜜，取100g，清蜜脾，并将其他剩余蜂蜜销毁。
2、实验方法：
(1)准备待测样品：
制备蜂蜜待测样品：取雷公藤蜂蜜、油菜蜂蜜、洋槐蜂蜜、荆条蜂蜜、椴树蜂蜜、枣花蜂蜜各10g，分别按照如下方式处理，得到待测样品：将蜂蜜放入50mL离心管中，加入10mL水溶解，再加入0.2％甲酸乙腈20mL斡旋提取5min，将4g无水硫酸镁和1g氯化钠加入到离心管中，混合1min，5000rpm离心5min。取上层有机相氮气吹干，用2mL 50％的乙腈水溶液复溶，混合后，用0.2μm滤膜过滤。
制备雷公藤整花提取液：称取2.5g雷公藤整花到50mL离心管中，加入0.2％甲酸乙腈10mL斡旋提取5min，将4g无水硫酸镁和1g氯化钠加入到离心管中，混合1min，5000rpm离心5min，取0.5mL上清液到离心管中，再加入0.5mL去离子水，混合后，用0.2um滤膜过滤。
(2)采用LC-Q-TOF对雷公藤整花提取液和雷公藤蜂蜜进行检测，检测条件为：
LC条件如下：
色谱柱：Eclipse Plus C18，2.1x100mm，1.8μm；
流速：0.2mL/min；
流动相：A乙腈，B 0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱：0-2min 5％B，2-20min 90％B，20-21min 5％B，21-35min 5％B；
柱温：30℃；
进样量：2μL；
Q-TOF条件：
ESI正离子，干燥气氮气流速：6L/min；温度：300℃；气帘气流速：10L/min；温度：350℃；电离电压4000V；
扫描方式：MS scan全扫描，质量数范围100-2000，参比实时校正；
确证方法：target ms，目标离子361.1646，碰撞能量30eV。
(3)检测结果：
请参考图1和图2，E中的361.1672峰为B中7.988min对应的分子离子峰；F中361.1672峰为D中8.011对应的分子离子峰。
3、结果分析：
从图1A和C可以看出，雷公藤蜂蜜和雷公藤整花提取物在3-11min中内有许多重叠峰，用分子特征软件形成分子式，筛选到400多种化合物，其中强度较大的化合物有23个，对所有的分子式进行检索分析，结合文献报道的雷公藤研究的化合物数据，推测所有可能的物质，一些典型的准确分子量(M+H)为359.1624，307.1820，385.1718，327.1720，355.2032，371.1893，339.2081，361.1672有7个物质备选，将他们形成分子式。为了能够最后形成有效的标准方法，筛选的化合物应该具有易获得或是有标准品的优先，最后分子式C20H24O6入选，初步推测其为雷公藤甲素，在雷公藤提取物和蜂蜜提取物中提取准确质量数361.1646，可以看出两个提取物中均有该组分(参见图2)。通过购买标准品与提取样品中的物质比对，保留时间和准确质量数一致，确认该物质为雷公藤甲素(见图3，保留时间为7.987min，分子离子峰为361.1665)。通过标样校正计算该蜂蜜中雷公藤甲素的含量为234μg/kg。其他几个物质推测其也可能为二萜内酯类化合物，但是很难推测其具体是什么组分，也很难获得对应的标准物质，他们仅能作为辅助参考。
此外，按照此方法分析常见的油菜，洋槐，枣花，荆条，椴树和多花种蜂蜜的萃取物(图4-图9)，提取雷公藤甲素准确质量数361.1646，在这些蜂蜜中对应的保留时间未检测到该特征离子存在。进一步说明雷公藤甲素可以作为此蜂蜜的特征识别指示物。
实施例1
检测样品：市场抽取130多份不同样品，包括油菜、洋槐、枣花、荆条、荔枝、龙眼、椴树、山花、荞麦等，其中2份怀疑为雷公藤蜂蜜(附近有少量雷公藤)。
样品预处理：将10g蜂蜜放入50mL离心管中，加入10mL水溶解，再加入乙腈20mL斡旋提取5min，将4g无水硫酸镁和1g氯化钠加入到离心管中，混合1min，5000rpm离心5min。取上层有机相氮气吹干，用2mL 50％的甲醇水溶液复溶，混合后，用0.2μm滤膜过滤。
检测方法：采用LC/MS/MS法检测(检出限为12μg/kg)，检测条件为：
色谱柱：agilent SB C18，2.1x50mm，1.8μm；
流速：0.2mL/min；
流动相：A乙腈，B 0.2％的甲酸水，梯度洗脱：0-1min 5％B,1-4min 20％B，4-6min90％B，6-8min 5％B；
柱温：30℃；
进样量：2μL；
MS/MS条件：
离子漏斗ESI正离子，干燥气氮气流速：6L/min；温度：200℃；气帘气流速：10L/min；温度：350℃；电离电压4000V；
扫描方式：雷公藤甲素361>143，361>197；倍增电压：0。
检测结果：2份疑似雷公藤蜂蜜中，来源于福建的1份疑似样品中检测出雷公藤甲素，含量为69μg/kg，实地确认，附近确有雷公藤种植，另一份疑似样品未检测到雷公藤甲素，经色谱指纹判别为饲喂一定糖浆的多花种混合蜂蜜，是因为蜜蜂采集具有单一性，附近有少量的雷公藤种植，但在其他蜜源丰富的情况下，蜜蜂一般很少采集雷公藤花粉或蜜。
实施例2
检测样品：同实施例1
样品预处理：将10g蜂蜜放入50mL离心管中，加入10mL水溶解，再加入0.2％甲酸甲醇溶液20mL斡旋提取8min，将4g无水硫酸镁和1g氯化钠加入到离心管中，混合1min，5000rpm离心5min。取上层有机相氮气吹干，用2mL 50％的甲醇水溶液复溶，混合后，用0.2μm滤膜过滤。
检测方法：采用LC-Q-TOF法检测，检测条件同预实验例，区别仅在于色谱柱采用苯基柱，流动相为：A甲醇，B水。
检测结果：2份疑似雷公藤蜂蜜中，来源于福建的1份疑似样品中检测出雷公藤甲素，实地确认，附近却有雷公藤种植，另一份疑似样品未检测到雷公藤甲素，检测结果与LC/MS/MS一致。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (17)

1.以雷公藤甲素作为特征识别物，采用LC-Q-TOF或LC/MS/MS检测蜂蜜中是否含有雷公藤蜂蜜的方法；
所述LC-Q-TOF中的LC包括如下检测条件：
色谱柱：C18柱或C8柱或苯基柱；
流动相：A乙腈或甲醇，B 0％-0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱：0-2min 5％B，2-20min90％B，20-21min 5％B，21-35min 5％B；
所述Q-TOF包括如下检测条件：
目标离子：361.1646；
碰撞能量30eV；
所述LC/MS/MS中的LC包括如下条件：
色谱柱：C18柱或C8柱或苯基柱；
流动相：A乙腈或甲醇，B 0％-0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱，0-1min 5％B，1-4min20％B，4-6min 90％B，6-8min 5％B；
MS/MS包括如下条件：
扫描方式：MRM，雷公藤甲素361>143，361>197；倍增电压：0-400。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述LC-Q-TOF的飞行时间质谱图中至少含有361.1646±5ppm质量数(M+H)准分子离子峰。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述飞行时间质谱图中还含有如下质量数(M+H)准分子离子峰中的一个或多个：359.1624±5ppm，307.1820±5ppm，385.1718±5ppm，327.1720±5ppm，355.2032±5ppm，371.1893±5ppm，339.2081±5ppm。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述飞行时间质谱图中同时含有准分子离子峰：359.1624±5ppm，307.1820±5ppm，385.1718±5ppm，327.1720±5ppm，355.2032±5ppm，371.1893±5ppm，339.2081±5ppm。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，检测前，采用如下方法对所述蜂蜜样品进行预处理：取蜂蜜样品，每1g蜂蜜中加入0.8-1.2mL水溶解，向溶解液中加入0％-0.3％的甲酸乙腈溶液或0％-0.3％的甲酸甲醇溶液涡旋提取1-8min，加入无水硫酸镁和氯化钠后离心，取有机相并用氮气吹干，然后加入40％-60％的乙腈水溶液或40％-60％的甲醇水溶液复溶，过滤即得。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：取蜂蜜样品，每1g蜂蜜中加入1mL水溶解，向溶解液中加入0％-0.2％的甲酸乙腈溶液或0％-0.2％的甲酸甲醇溶液涡旋提取5min，加入无水硫酸镁和氯化钠后离心，取有机相并用氮气吹干，然后加入50％的乙腈水溶液或50％的甲醇水溶液复溶，过滤即得。
7.根据权利要求1或2或6所述的方法，其特征在于，所述LC-Q-TOF的检测条件中，所述色谱柱为C18柱。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为Eclipse Plus C18，2.1x100mm，1.8μm。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述LC-Q-TOF中，所述LC还包括如下检测条件：流速：0.15-0.6mL/min，柱温：25-35℃，进样量：1-30μL；
和/或：所述Q-TOF还包括如下检测条件：
ESI正离子，干燥气氮气流速：5-7mL/min，温度280-320℃，气帘气流速：9-11L/min，温度330-370℃，电力电压3800-4200V；
MS scan全扫描，质量数范围100-2000，参比实时校正。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述LC还包括如下检测条件：流速：0.2mL/min，柱温：30℃，进样量：2μL。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述Q-TOF还包括如下检测条件：ESI正离子，干燥气氮气流速：6mL/min，温度300℃，气帘气流速：10L/min，温度350℃，电离电压4000V；
MS scan全扫描，质量数范围100-2000，参比实时校正。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LC/MS/MS的检测条件中，所述色谱柱为C18柱。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为agilent SB C18，2.1x50mm，1.8μm。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LC/MS/MS中，所述LC还包括：流速：0.15-0.6mL/min，柱温：25-35℃，进样量1-30μL；
所述MS/MS还包括：ESI正离子，干燥气氮气流速：5-7mL/min，温度180-220℃，气帘气流速：9-11L/min，温度330-370℃，电离电压3800-4200V。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述LC还包括：
流速：0.2mL/min，柱温：30℃，进样量2μL。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述MS/MS还包括：ESI正离子，干燥气氮气流速：6mL/min，温度300℃，气帘气流速：10L/min，温度350℃，电离电压4000V。
17.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：LC-Q-TOF的检出限为30-35μg/kg，LC/MS/MS的检出限为10-12μg/kg。
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